病原性溶藻弧菌对大黄鱼鳃黏液黏附作用研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了溶藻弧菌对大黄鱼鳃黏液黏附作用.结果表明,溶藻弧菌的黏附量随着菌浓度的增加而升高并在180 min后达到饱和;在温度15~30℃、pH偏酸条件下黏附作用较强,Na+是溶藻弧菌黏附作用必需的,Ca2+起着辅助作用;溶藻弧菌经营养饥饿、热处理及高碘酸处理后黏附作用有明显下降;8种碳水化合物都有不同程度的促进溶藻弧菌的黏附作用,其中葡萄糖、甘露糖、果糖及麦芽糖有明显促进作用.研究结果表明:海水中的溶藻弧菌可很好地黏附于大黄鱼鳃黏液,其黏附作用受环境因子影响,并且与溶藻弧菌的表面碳水化合物、热敏结构等有着密切关系.     

河流弧菌对牙鲆表皮黏液黏附作用的研究

为了解河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附特性,采用3H-TdR同位素示踪方法研究了细菌浓度、孵育时间、孵育温度、pH值、阳离子、碳水化合物等因子对河流弧菌黏附作用的影响。试验结果表明:河流弧菌能很好地黏附于牙鲆表皮黏液,黏附量随菌浓度升高而增大并符合饱和黏附动力学:y=417.89ln(x)+691.57(R2=0.986);在30℃下黏附量随着孵育时间的延长而增加,180min趋于饱和;孵育温度在4~30℃范围内黏附量随温度升高而增多,30℃时黏附量最大;pH值酸性较碱性黏附作用明显,pH为5时最强;NaCl浓度在0.5%~4.5%范围内,细菌黏附作用随着浓度升高而增强,较纯水存在显著性差异(P<0.05);Ca2+,Mg2+能显著加强河流弧菌的黏附作用,但Ca2+作用明显超过Mg2+;葡萄糖等8种碳水化合物能显著促进河流弧菌的黏附作用(P<0.05)。以上结果说明:河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附量较大,这有利于进一步感染、致病;河流弧菌的黏附作用受温度、pH值、阳离子、碳水化合物等多种环境因子的影响,较高的水温有利于河流弧菌的黏附,有利于疾病的发生。     

大黄鱼病原菌──溶藻弧菌的ELISA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌（0.05%甲醛，30℃,8h）制成菌苗，注射免疫实验兔获得抗血清。该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应，用该抗血清进行溶藻水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%，表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病，也可能检测无病症带菌大黄鱼。     

大黄鱼溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测

用酚 水法从20dm3溶藻弧菌培养液中分离得到脂多糖(LPS)97.6mg,以0.5mg cm3的LPS溶液通过耳缘静脉注射免疫实验兔,经过3次加强注射后从颈动脉放血制备抗血清.该抗血清的效价为1∶2560,对副溶血弧菌等10株细菌的交叉反应效价都较低.用免疫吸附过滤法去除血清中的非特异性成分.用吸附后的抗血清进行溶藻弧菌间接ELISA检测,其检测限为97×104个 cm3.以ELISA进行大黄鱼体内溶藻弧菌检测.结果表明:用LPS抗血清可以较为灵敏地检测大黄鱼体内的溶藻弧菌,该方法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

大黄鱼病原菌——溶藻弧菌的EuSA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌(0.05%甲醛,30℃,8h)制成菌苗,注射免疫实验兔获得抗血清.该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应.用该抗血清进行溶藻弧菌ELISA检测,其最低检测极限为97000cfu/ml.将该方法应用于养殖现场,检测结果为海水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%,表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

大黄鱼溶藻弧菌病细胞病理变化的初步研究

对患有典型弧菌病症状的养殖大黄鱼（Pseudociaena crocea)的主要组织进行了细胞病理研究,结果显示,患病鱼的肝、肾、脾等组织细胞均出现程度不同的坏死现象,严重时整个细胞呈溶解状态。在此基础上对该病的致病机理和致死原因进行了探讨。     

环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液影响的研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了环境因子对溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液粘附作用的影响。试验结果表明,溶藻弧菌能很好地粘附于大黄鱼表皮粘液,其粘附量在菌浓度不超过6.52×108cfu/ml情况下随菌浓度的升高而升高;粘附量在25℃下孵育180min趋于饱和,在180min以内与孵育时间呈正相关关系;粘附作用在温度25—30℃、pH值偏酸、盐度35条件下较强;在无Na (盐度为0)时,无粘附作用;Ca2 能显著加强溶藻弧菌的粘附作用,而Mg2 作用不明显。这些结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用,其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子的影响。     

溶藻弧菌脂多糖对大黄鱼的毒性与免疫保护性试验

用酚水法从20dm3大黄鱼的病原菌--溶藻弧菌菌液分离出脂多糖(LPS)溶液380cm3,冻干后得到LPS粉末97.6mg.在注射剂量为0.2cm3不同浓度LPS溶液对大黄鱼肌肉注射毒性试验中,LPS注射浓度为0.5 mg/cm3 时, 5d内能引起大黄鱼死亡;当LPS浓度提高到2 mg/cm3时,大黄鱼的死亡率达到100%.以剂量为0.2 cm3、浓度为0.2 mg/cm3的LPS溶液对大黄鱼进行免疫注射,15d后用0.2cm3浓度为9×108 个/cm3的溶藻弧菌进行攻毒试验,40%的大黄鱼获得免疫保护.     

不同碳源对溶藻弧菌黏附相关表型的影响初探及Hfq对其的调控

为探讨不同碳源对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)黏附相关表型的影响及Hfq对其的调控作用,研究了D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-海藻糖和D-果糖对溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq缺失株及回补株的运动性、菌落形态、鞭毛、胞外多糖及生物膜合成的影响。研究结果显示,4种碳源均使溶藻弧菌群集运动(swarmming)显著增强(P0.001),并受Hfq正调控;游动性(swimming)显著减弱(P0.01),但不受Hfq调控;菌落变得褶皱,并受Hfq负调控;4种碳源不影响溶藻弧菌鞭毛及胞外多糖合成,但D-果糖使其生物膜合成减少,并受Hfq负调控。实验分析表明:4种碳源可能通过调控溶藻弧菌黏性阻力及能量代谢来调控其运动性;并可能通过调控胞外多糖分子结构及理化性质影响其菌落形态;另外,D-果糖在调控生物膜形成过程中具有重要作用;因此,添加不同碳源会影响溶藻弧菌黏附相关表型,可能影响其致病性,但具体调控机制需进一步研究。     

大黄鱼溶藻弧菌病组织中巨噬细胞移动抑制因子的检测及意义

本文应用免疫组织化学方法,对健康大黄鱼和患溶藻弧菌病大黄鱼组织中巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)蛋白进行了检测,以研究溶藻弧菌病大黄鱼组织中MIF的表达情况及其对预后的影响。结果表明,MIF在健康大黄鱼头肾、脾、肠各组织中均无表达;MIF在溶藻弧菌病大黄鱼各组织中高表达,表达强度从弱到强依次是肠、脾、头肾,MIF表达阳性率分别为:56%、64%、92%。推测MIF在大黄鱼溶藻弧菌病发病中发挥重要作用。     

Adhesion of pathogenic Vibrio alginolyticus to the gill mucus of Pseudosciaena crocea

Adhesion of Vibrio alginolyticus to the gill mucus of Pseudosciaena crocea has been investigated using [methyl—3H]thymidine as isotope tracer. The results showed that: the adhesive quantity of V. alginolyticus increased with bacterial concentrations and reached equilibrium after incubated for 180 min; the higher adhesive quantity was obtained at 15~30 ℃ and sourish conditions; adhesion of V. alginolyticus could not achieved without Na , and Ca2 played an auxiliary role in the bacterial adhesion; adhesion of V. alginolyticus was inhibited remarkably by starvation, heat treatment and periodic acid treatment; all of the eight kinds of carbohydrates investigated enhanced the adhesion of V. alginolyticus to the gill mucus of P. crocea, among them, glucose, mannose, fructose and maltose showed the specially enhanced adhesion. The results indicated that V. alginolyticus could adhere to the gill mucus of P. crocea facilely in seawater, and this bacterial adhesion was influenced by environmental factors and closely related to superficial carbohydrate structures and some heat-sensitive structures.     

大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体制备及其应用

用甲醛灭活副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)制成免疫原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1株特异的针对副溶血弧菌的单克隆抗体,命名为D6F3H5。腹水及培养上清液抗体的ELISA效价分别为:1∶5 120和1∶1 280,该单克隆抗体与其它细菌没有明显的交叉反应。利用该单克隆抗体和兔抗副溶血弧菌多克隆抗体,建立了检测副溶血弧菌的双抗体夹心ELISA方法。该方法对副溶血弧菌的最小检出量为5×104个/mL。用双抗体夹心ELISA检测大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品,14尾患病大黄鱼中有11尾检出副溶血弧菌,而10尾健康大黄鱼都没有检出副溶血弧菌。由此可见,本试验制备的高特异性的抗副溶血弧菌单克隆抗体,可以用于患病大黄鱼副溶血弧菌的快速诊断。     

宫井洋大黄鱼遗传多样性的RAPD分析

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对取自宁德官井洋闽—粤东族大黄鱼的野生种群和养殖群体进行遗传多样性分析.结果表明,野生种群的平均多态性为18.9%,平均遗传差异度为0.0960;养殖群体的分别为16.7%和0.0747;野生种群与养殖群体之间的相似系数为0.9959,遗传距离为0.0041.分析结果表明官井洋大黄鱼野生种群和养殖群体遗传多样性水平较低的主要原因在于过度捕捞、有效繁育群体数量偏少及值得探讨的人工放流等.提出官井洋大黄鱼仍具有一定的变异潜力,尽快采取有效的管理保护措施,可以保持乃至提高大黄鱼现有的遗传多样性水平.     

Starvation effects on pathogenic Vibrio alginolyticus in natural seawater

To get a better understanding of the starvation survival strategy of pathogenic Vibrio alginolyticus, log-phase cells were inoculated into sterile natural seawater for starvation studies. The results showed that all of total bacteria number, viable bacteria number and CFU number of V. alginolyticus increased remarkably at the initial starvation stage; after reaching their peaks at 5 d, both total bacteria number and viable bacteria number of V. alginolyticus fell slowly, while the CFU number fell more quickly after reaching its peak at 10 d; V. alginolyticus elongated their cells at the prophase of starvation, and then shrunk their volume and turned their shapes into ovals from rods at the anaphase of starvation; starved cells showed more sensitivity to heating and UV; starved cells showed no significant difference from unstarved ones at the lowest detection limit determined by indirect enzyme-linked immu- nosorbent assay （ELISA） ; starved cells＇ ability to adhere to the skin mucus of large yellow croaker （ Pseudosciaena crocea） showed a sharp decline as the starvation time increases; the cellular protein of V. alginolyticus increased remarkably at the ariaphase of starvation. The results indicated that pathogenic V. alginolyticus could survive in starvation for relatively long periods of time （ ≥2 months） in 28℃ natural seawater due to the morphological and physiological changes; however, starved V. alginolyticus cells showed less virulence and higher sensitivity under environmental stresses.     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液的影响

采用3H-TdR同位素示踪法研究了病原性溶藻弧菌和9株拮抗菌对大黄鱼表皮粘液的粘附动力学。结果表明,10株细菌的粘附作用都符合饱和粘附动力学特征;R4、R13和R32等3株拮抗菌的最大粘附量高于溶藻弧菌;9株拮抗菌的分离常数都高于溶藻弧菌;R32的亲和指数大于溶藻弧菌,其余8株拮抗菌的亲和指数都小于溶藻弧菌。测定了9株拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼表皮粘液的竞争、排斥和置换作用,结果显示:9株拮抗菌在竞争条件下都能极显著减少溶藻弧菌对表皮粘液粘附(P<0.01);在粘附排斥方面,R4、R13、J26、J28、J312、Y59等6株拮抗菌能显著排斥病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用(P<0.05);在粘附置换方面,J26、J28等2株拮抗菌能极显著(P<0.01)降低病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量。研究结果表明,病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用;9株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用,其中竞争作用效果最好,排斥作用次之,置换作用的效果最差;拮抗菌对病原菌粘附的抑制效果受多种因素的影响,各菌株的粘附动力学参数有重要的影响作用。     

大黄鱼头肾免疫细胞研究

对大黄鱼（Pseudosciaena,crocea）头肾印迹片、光镜片和电镜片进行观察。结果表明,大黄鱼头肾包括淋巴细胞聚集区和颗粒细胞聚集区,但无肾小球结构。头肾免疫细胞丰富,包括淋巴细胞、颗粒细胞（Ⅰ型和Ⅱ型）、单核细胞和巨噬细胞,分别占57．94％、36．43％、5．63％,表明头肾是大黄鱼免疫细胞的生发中心,在免疫防御系统中具重要作用。     

不同地理种群大黄鱼染色体核型的比较研究

大黄鱼(Pseudosciaena crocea(Richardson)),隶属于鲈形目(Perciformes),石首鱼科(Scieani-dae),黄鱼属(Pseudosciaena),是我国重要的海水养殖种类.近年来,经过长期的人工繁育和人工养殖,大黄鱼的性状有了较大的变化.主要表现为个体小型化,性成熟提前,抗病力下降等.目前有关大黄鱼遗传背景的研究还十分缺乏,相关的研究仅见于国内学者对养殖、野生大黄鱼的染色体核型、同工酶酶谱、不同群体遗传多样性水平的研究[1~7],这些研究多是针对我国沿海3个大黄鱼地理种群之一的闽粤东族进行的.