栉孔扇贝血细胞数量变化与生长的关系

于2009年3月至2010年1月期间,每月中旬分别从青岛和威海两地区采集人工养殖和野生的栉孔扇贝(Chla-rays farreri).采集的扇贝经壳长测量后,于闭壳肌血窦中取血,离心,重悬,超声波破碎后制得血细胞破碎液.从抗栉孔扇贝血细胞的单克隆抗体库中筛选出1株与颗粒血细胞和透明血细胞均能结合,并能与血细胞多个蛋白结合的单克降抗体作为酶联免疫吸附法( ELISA)中的第一抗体;第二抗体为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体.将血细胞破碎液包被于酶标板孔中,经一抗、二抗孵育后,显色读数,分析血细胞数量与生长的关系.结果表明:两地区人工养殖和野生扇贝的壳长均由3月的2cm左右增长到了次年1月的7cm以上,其中4～7月增长较快,而8～1月相对缓慢.两地区人工养殖和野生扇贝的血细胞数量于3～6月间均维持在较高的水平,6月达到最高峰,随后急剧下降,并于8或9月达到最低值,此后10～1月有所回升,但仍显著低于3～6月的水平.结论认为:栉孔扇贝血细胞数量与生长的关系在两地区、两扇贝品种间差别不大;但3～6月栉孔扇贝生长较快,血细胞数量相对高;而8～10月栉孔扇贝生长缓慢,其血细胞数量较低.     

栉孔扇贝三倍体与二倍体的生长比较

近几年在我国栉孔扇贝养殖业中出现了单产降低、品质下降、大面积死亡问题 ,其主要原因是缺少生长快、品质优、抗逆能力强的养殖新品种。对于养殖贝类来说 ,性成熟往往导致生长抑制、抗逆性下降和肉质下降。目前广泛开展的多倍体贝类研究的主要目的是产生不育的三倍体 ,充分利用三倍体的不育性和生长优势 ,为海水养殖业健康、稳定、持续地发展提供技术支持。通过对栉孔扇贝三倍体和二倍体的生长比较 ,证实栉孔扇贝三倍体具养殖实用价值。１材料与方法１．１材料栉孔扇贝Ｃｈｌａｍｙｓ(Ａｚｕｍａｐｅｃｔｅｎ) ｆａｒｒｅｒｉ取自青岛太平…     

华贵栉孔扇贝的三倍体诱导及生长比较

分别和细胞松驰素Ｂ和低温处理诱导华贵栉孔扇贝Ｃｈｌａｍｙｓｎｏｂｉｌｉｓ产生三倍体。抑制第一极体的三倍体诱导率分别４４．１％和３１．８％；抑制第二极体的三倍体诱导率分别为９０．２％和７２．７％。ＣＢ处理组幼虫的日增长率显著超过二倍体。     

温度骤变对栉孔扇贝全血细胞和颗粒血细胞数量的影响

血细胞及其亚群的数量是栉孔扇贝(Chlamys farreri)的重要免疫指标之一。本文研究了栉孔扇贝在17℃下,分别经水温突变(11、23和28℃)和不同温度(5、11、17和23℃)干露处理后,应用以抗栉孔扇贝全血细胞单抗和颗粒血细胞单抗分别为第一抗体的间接酶联免疫吸附实验和流式细胞术测定全血细胞数量、颗粒血细胞数量及比例的变化。结果表明:水温骤变全血细胞和颗粒血细胞数量变化显著,全血细胞数量11、23℃组均先升高后逐渐趋于对照组,28℃组一直显著低于对照组;颗粒血细胞数量及其比例11℃组显著增加并始终高于对照组,23℃组显著降低后逐渐恢复至对照水平,28℃组始终低于对照水平。不同温度干露后,全血细胞和颗粒血细胞数量均显著降低,海水恢复后,5℃组较11、17℃组更接近对照组,23℃组干露12h扇贝全部死亡。研究表明:全血细胞及颗粒血细胞数量对温度变化的反应敏感;较低水温有利于细胞数量的提升,较高水温下细胞数量下降显著;低温干露后细胞数量恢复较好,高温干露扇贝存活率差。     

栉孔扇贝血细胞的显微和超微结构

通过光镜、扫描电镜和透射电镜观察栉孔扇贝Chlamys farreri血细胞的形态、结构特征,对其分类进行了初步研究。根据细胞的大小、形态和结构特征可将血细胞分成5种类型:Ⅰ型小透明细胞,大小约2.44±0.11μm,约占45%—50%;Ⅱ型大透明细胞,大小约4.83±0.28μm,约占15%—20%;Ⅲ型小颗粒细胞,大小约4.07±0.15μm,约占15%—20%;Ⅳ型中颗粒细胞,大小约7.20±0.26μm,约占20%—25%和Ⅴ型大颗粒细胞,大小约13.87±0.73μm,约占3%—5%。血细胞在血淋巴中的平均密度为(3.03±0.11)×107cell.ml—1,其中颗粒细胞占42.6%,透明细胞占57.4%。透射电镜观察结果表明,颗粒细胞的细胞质颗粒可区分成3种类型:Ⅰ型高电子密度颗粒,Ⅱ型低电子密度颗粒和Ⅲ型中等电子密度颗粒。     

栉孔扇贝D形幼虫血细胞发生特点的研究

研究组前期实验表明,栉孔扇贝(Chlamys farreri)从囊胚期开始的各发育时期中,以D形幼虫期开始出现形态可辨的血细胞。本文采用石蜡切片、组织化学、栉孔扇贝血细胞单克隆抗体的免疫组化方法,定位、观察栉孔扇贝D形幼虫血细胞的分布和形态特点。结果表明:可辨形态的血细胞集中分布于幼虫的外套膜、面盘、口、食道、胃、消化腺、肠等组织,游离的血细胞大多为球形或椭球形,直径约为1~3μm,中央有一深色细胞核,而在消化腺中血细胞密集层叠,形态各异。在该时期未观察到不同类型的血细胞和造血组织。结论认为,D形幼虫期开始出现形态可辨的血细胞,主要分布于与摄食消化相关的组织器官内。     

脂多糖对栉孔扇贝血清和血细胞中7种酶活力的影响

实验于１９９８年１￣１０月进行。栉孔扇贝注射脂多糖后,分别于１,１５和３０ｈ测定了其血清和血细胞中７种参与免疫防御的水解酶、氧化酶和抗氧化酶的活力。结果表明,血清实验组的酸性磷酸酶（ＡＣＰ）活力在１,１５和３０ｈ时,血细胞实验组在１ｈ时显著高于对照组。血清和血细胞实验组的碱性磷酸酶（ＡＫＰ）活力仅在１ｈ时,溶菌酶活力分别在１ｈ和１５ｈ时显著高于对照组。血细胞中无酚氧化酶（ＰＯ）活性。血清实验组的Ｐ     

栉孔扇贝血细胞活性检测方法的筛选与应用

筛选栉孔扇贝(Chalmys farreri)血细胞活性的检测方法,研究苯并[a]芘(B[α]P)对栉孔扇贝血细胞活性的影响.结果表明96孔培养板中栉孔扇贝血细胞接种密度在(1～32)×10~4 cell/孔时,血细胞活性无显著性差异(P>0.05),且细胞存活率在97.42%～98.82%之间,台盼蓝排斥法、四甲基偶氮唑(MTT)、二甲氧唑黄(XTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)活性测定法均可作为栉孔扇贝血细胞活性的测定方法,而当血细胞接种密度在(12～32)×10~4/孔时,中性红比色法亦可作为血细胞活性的检测方法;同时实验采用Eagle培养液进行血细胞原代培养在0～24 h内血细胞活性较好.采用中性红比色法检测B[α]P对栉孔扇贝血细胞活性具有显著抑制作用,且抑制程度与B[α]P作用浓度、时间呈正相关,其余方法均未检测出B[α]P对血细胞活性的影响.由此可见,B[α]P对栉孔扇贝血细胞活性具有免疫毒性作用,中性红比色法可以作为评价B[α]P对栉孔扇贝血细胞免疫活性的敏感指标.     

栉孔扇贝(Chlamys farreri)壳顶幼虫血细胞分布的免疫学观察

研究组前期实验发现,栉孔扇贝血细胞在D形幼虫时期出现.本文应用单克隆抗体的免疫组化、免疫电镜方法进一步定位栉孔扇贝壳顶幼虫的血细胞并观察其分布.结果表明,栉孔扇贝壳顶幼虫已分化出界限明显的组织器官,包括外套膜、面盘、口、食道、胃、消化腺、足等;血细胞主要分布于壳顶幼虫的外套膜、面盘、食道、消化腺、胃等组织器官内及周围,其中面盘、消化腺、胃等处有大量血细胞成簇分布.血细胞形状不规则,直径为3～5μm;细胞核多为圆形、椭圆形,位于细胞的一侧;细胞质内有线粒体、内质网等细胞器和空泡.结果证实,栉孔扇贝在壳顶幼虫时期已出现了大量清晰可辨的血细胞,其分布特点与成贝血细胞相似.     

栉孔扇贝DAPI带型和PI带型研究

选取栉孔扇贝Chlamys farreri担轮幼虫为材料,采用秋水仙素-低渗-空气干燥法制备染色体标本,应用荧光显带技术,分析了DAPI带和PI带在栉孔扇贝染色体上的分布。DAPI带型结果显示,栉孔扇贝所有染色体上都存在DAPI阳性带,主要分布于传统的着丝粒区和端部区域,另外还存在一些中间区DAPI带及可变带,总带数为62。PI带型结果与DAPI带型结果相似,在所有染色体上都存在PI阳性带。2种带型的阳性带所在位置与异染色质分布区域相吻合。     

硒化壳聚糖对栉孔扇贝血细胞中部分免疫因子的影响

取人工养殖栉孔扇贝(Chlamys farreri)的血淋巴,体外加入不同浓度的硒化壳聚糖,作用1h后采用生化方法分别测定栉孔扇贝血细胞中的髓性过氧化物酶(MPO)和非特异性酯酶(NSE)的活力,以及过氧化氢(H2O2)和活性氧的含量。结果表明:加入硒化壳聚糖后,栉孔扇贝血细胞中依赖卤素的MPO、不依赖卤素的MPO、α-醋酸萘酯酶和α-丁酸萘酯酶的活力均为实验组显著高于对照组,过氧化氢和活性氧的含量也为实验组显著高于对照组。说明硒化壳聚糖对栉孔扇贝血淋巴中多种参与免疫防御的酶的活力和具有杀菌作用的免疫因子的含量均具有明显的提高作用,因而硒化壳聚糖对栉孔扇贝的免疫功能具有明显的增强作用。     

栉孔扇贝雌核发育二倍体早期成活与生长发育的研究

利用筛选出的精子遗传失活法和卵染色体加倍法,批量诱导出第二极体抑制型栉孔扇贝雌核发育二倍体个体,观测了幼体不同发育时期的成活率、发育速度和个体大小等生物学特性。结果发现,雌核发育二倍体的卵裂率、胚胎畸形率、D形幼虫发生率、孵化后3,6,9,12,15,18 d的成活率均显著低于对照组,表明栉孔扇贝基因组中可能存在大量有害隐性基因,雌核发育个体中有害隐性基因的纯合导致了成活率的显著下降。在发育速度方面,D形幼虫期之前,雌核发育二倍体个体明显低于对照组个体;壳顶期后则相反,雌核发育二倍体个体高于对照组个体。在个体大小方面,雌核发育二倍体个体在孵化后3 d前,壳长和壳高均小于对照组个体;孵化3 d后,壳长和壳高逐渐大于对照组个体。这一结果显示随着致死隐性基因因纯合而被自然排除,雌核发育二倍体的生长性状逐渐优越于正常个体,通过将这些雌核发育二倍体个体培养至成体,则可望培育出栉孔扇贝的优良品系。     

栉孔扇贝Fosmid文库的构建及基因组结构特征分析

研究构建第一个栉孔扇贝的fosmid基因组文库,该文库包含133 851个克隆,插入片断平均长度为40 kb,覆盖栉孔扇贝基因组的4.3倍.栉孔扇贝DNA在fosmid传代中表现得较为稳定,没有发现插入片段的丢失或重排.所有的克隆进行了超级池和二级池的构建,并筛选了2个基因和7个微卫星,结果阳性克隆数介于2到8之间.由此可见,该文库可以很好的用于目的基因或标记的筛选,将有利于物理作图和基因的图位克隆研究.2 016个克隆进行双末端测序,获得3 646 条序列.序列总长2 286 986 bp,大约占栉孔扇贝基因组的1.84‰.共得到2 500条串连重复序列,其中微卫星序列371条,小卫星序列1 816条,卫星序列313条.共得到317条散布重复序列,总长97 412 bp,占测序总长的4.26%.查找到的散布重复序列共有4种类型:DNA 转座子、LTR 反转座子、LINE反转座子和滚环转座子,其中LINE反转座子的数目最多.BLAST比对共有1 383条序列与数据库现有的序列有明显的相似性(E＜e-5),占测序总数的37.93%.BLASTN比对有明显相似性的1 036条序列中,与nr数据库序列相似的有113条,与EST数据库序列相似的有923条.BLASTX比对有明显相似性的序列有347条,占序列总数的9.52%.     

中国北方沿海6个栉孔扇贝群体的AFLP分析

利用4对AFLP引物首次对我国北方沿海主要的6个栉孔扇贝养殖区的自然采苗群体进行了遗传多样性分析,共扩增得到191条清晰带谱,其中175条具有多态性。对各群体进行遗传多样性分析,结果表明各群体均具有较高的遗传多样性水平,香农式多样性指数在0.347 4～0.391 7之间。AMOVA结果表明遗传变异主要来源于群体内,占总遗传变异的87.22%。个体聚类结果表明,烟台、长岛、大连3个群体的个体聚在一起,可看做1个群体;而荣成群体的个体单独聚在一起,具有独立的遗传结构;胶南和日照的一部分个体聚在一起,其他大部分各群体单独聚在一起;推测是海洋环境和人工养殖影响的共同结果。     

栉孔扇贝(Chlamys (Azumapecten) farreri) 消化盲囊的组织学和组织化学的研究

运用石蜡切片法、透射电镜技术及组织化学方法，对栉孔扇贝的消化盲囊进行了研究。结果表明消化盲囊的腺上皮由消化(吸收)细胞和分泌细胞组成，消化(吸收)细胞顶端有微绒毛，细胞内有酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脂酶和酯酶活性，还含有糖原和脂肪。是进行食物的细胞内消化和营养物质吸收的主要场所，并有储存能量的功能；分泌细胞内含粗面内质网、高尔基体和分泌颗粒，具有酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性。并含有丰富的RNA和蛋白质，有分泌消化酶的功能；消化盲囊导管上皮细胞顶端有纤毛和微绒毛，细胞内有酸性磷酸酶、碱性磷酸酶及脂酶活性，也能分泌消化酶。消化(吸收)细胞浅部的细胞质及其释放到盲囊腔中的胞质团中含铁；各部位不含钙。     

栉孔扇贝(Chlamys farreri) 血细胞类型及抗菌力的研究

用2种方法将栉孔扇贝血细胞分为2大类透明细胞、颗粒细胞.吉姆萨染色观察,透明细胞的细胞质中颗粒很少,细胞核圆形,居中,细胞质较少,核质比大;颗粒细胞比透明细胞大且多,染色深,但核质比小,在细胞质中有颗粒,有些颗粒细胞具双核.密度梯度离心结果,透明细胞主要位于上层,颗粒细胞则大部分位于下层.吞噬力、抗菌活力、溶菌活力及活性氧检测结果表明,颗粒细胞均强于透明细胞.