马氏珠母贝家系遗传结构的微卫星分析

利用6个微卫星位点研究了9个马氏珠母贝(Pinctada fucata)养殖家系的遗传结构,为后续育种工作提供了指导。从60对引物中筛选出6对能够稳定扩增且多态性较好的引物。6个微卫星位点在9个家系中共检测到17个等位基因,每个位点等位基因数(A)为2~4个,平均2.833个。6个位点在9个家系上的有效等位基因数(Ne)平均值为2.030~2.632,平均杂合度观测值(Ho)为0.4306~0.6354,平均杂合度期望值(He)为0.4380~0.5962。家系间遗传分化系数(FST)为0.0749。采用NJ法进行聚类分析显示,9个家系分为明显的两支,根据遗传距离计算结果, F7和F9家系之间的遗传距离最近, F11与F12家系遗传距离最远。结果表明,9个家系的遗传多样性和遗传分化处于中等水平,可以考虑F11与F12家系杂交,以期获得较好的杂种优势, F11自交培育出遗传稳定的优良家系。     

马氏珠母贝群体内遗传多样性的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术,对一马氏珠母贝养殖群体中个体大和个体小的两个组的遗传多样性进行分析。5个引物在2个组100个样品中共得到72个清晰的扩增位点,其中多态性位点71个,多态位点百分率(PPB)为98.61%。POPGENE分析结果表明:个体大的组的遗传多样性水平高于(PPB=94.44%,I=0.3523,h=0.2181,na=1.9444)小个体组(PPB=80.61%,I=0.3008,h=0.1915,na=1.8056)。两组间的遗传分化系数Gst=0.0948。UPGMA聚类分析表明大个体组内几乎所有的贝(47个)聚在一起,而小个体组的贝(50个)聚成另一支。     

马氏珠母贝SNP标记开发及家系遗传多态性分析

利用13个源自转录组序列的SNP标记对3个马氏珠母贝(Pinctada fucata)家系进行遗传多态性分析及聚类分析。结果显示,家系1#、3#、6#的平均期望杂合度(He)分别为0.307 8、0.318 9和0.382 7;平均观测杂合度(Ho)分别为0.342 2、0.341 0和0.394 2;平均多态信息含量(PIC)分别为0.243 5、0.247 9和0.297 7。结果表明,3个马氏珠母贝家系具低度或中度遗传多态性,为马氏珠母贝内SNP应用于遗传多态性分析等提供了基础。利用SNP标记对3个家系进行聚类分析,发现半同胞家系1#和3#在家系及个体聚类中均先聚在一起,然后再与亲缘关系较远的家系6#聚在一起。新开发的SNP标记能较准确地对家系及个体进行聚类,为SNP标记应用于马氏珠母贝遗传关系分析提供了研究基础。     

马氏珠母贝(Pinctada martensii)四种壳色选育系F5 的生长及遗传多样性分析

采用跟踪测量和微卫星(SSR)技术研究了马氏珠母贝四种壳色选育系F5和对照组的存活率、生长情况及遗传多样性。结果表明,四种壳色选育系和对照组的生长性状之间均存在显著差异(P<0.05)。从30对微卫星引物中扩增筛选获得8个多态位点,多态位点比例为26.67%,它们在4个壳色选育系共120个个体中产生了42个等位基因,平均每个多态位点产生5.25个。4个选育系的平均期望杂合度范围为0.6622—0.6850,平均观察杂合度范围为0.2708—0.4667,平均多态信息含量PIC值范围为0.6025—0.6190,说明4个选育系的遗传多样性处于较高水平,具有育种潜力;平均遗传偏离指数均为负值,4个选育系均存在不同程度的杂合子缺失。遗传分化和遗传距离分析表明白壳色选育系与红壳色选育系之间的亲缘关系最近,黑壳色与白壳色之间的遗传距离最大。     

马氏珠母贝金黄壳色系F3和基础群体

2003年4月,从广东湛江流沙港养殖群体选取金黄壳色个体为亲本建立育种基础群体,2004-2007年期间,按照壳色性状对基础群体进行连续3代选择建立选系F3。2009年5月,利用10对微卫星引物分析了金黄壳色系F3和基础群体的遗传结构。结果表明:在10个位点中共检测出40个等位基因,每个位点产生的等位基因数2~6个,平均每个位点产生4个等位基因;金黄壳色系F3和基础群体的平均有效等位基因数分别为2.286 2和2.264 6,平均表观杂合度分别为0.411 9和0.440 3,平均期望杂合度分别为0.533 3和0.546 4,平均多态信息含量分别为0.472 2和0.465 5;两个群体的平均遗传分化系数为0.038 9,属于轻度偏中度分化水平。本研究说明了,经过3代连续选择后选系具有较高的遗传多样性。     

马氏珠母贝家系的生长比较

采用单对配对方法建立马氏珠母贝Pinctada martensii第一代家系7个,对家系间的生长和家系内大小变异进行了分析比较。7个家系的壳高大小顺序为F15>F20>F18>F19>F12>F17>F21,总重大小顺序为F15>F18>F19>F20>F12>F17>F21。在同批家系中,F15的壳高、总重显著大于其它2个家系(F12、F17)(p<0.05),其壳高比F12大11.64%,比F17大16.01%;其总重比F12重27.40%,比F17重38.98%,而且其个体大小变异较小,表现出明显的生长优势,是一个生长性状优良的家系。F18在壳高和总体重上比F19大2.88%和19.49%。F20显著大于F21(p<0.05),壳高比F21大19.49%,总重大53.72%,该家系生长较快,可通过进一步的选择培育成一个生长快、个体大的家系。     

马氏珠母贝外套膜培养细胞的电镜观察

运用扫描电镜和透射电镜对马氏珠母贝（Pinctada martensii D0外套膜组织培养过程中各种细胞的生长变化和活动状况的研究，重点是对上皮细胞分泌活动的观察。最初从外套膜组织迁出的上皮细胞为圆球形，细胞表面近似光滑，但有走向规则细而浅的花纹；培养到第4天，上皮细胞形态上发生了较大的变化，分成A型和B型两种细胞，A型上皮细胞内颗粒物少，是处于合成分泌物的早期阶段或尚未开始合成分泌物，B型上皮细胞处于旺盛的分泌物合成阶段，细胞内粗面内质网和线粒体丰富。培养到15－16天的B型上皮细胞体积明显变大，细胞合成并聚集了大量单层膜包裹的颗粒物，培养到第31天的B型上皮细胞分泌活动减弱，上皮细胞逐渐失去分泌功能，进入衰老，死亡，胞体明显萎缩变小，整个培养过程持续了65d。     

形态学和SNP标记分析马氏珠母贝杂交子代及其亲本群体的遗传结构

马氏珠母贝是重要的海水养殖贝类, 为了探究繁育亲本及其子代的遗传结构和关系, 本研究运用多元性形态学和SNP标记对马氏珠母贝母本深圳群体、父本海南群体和其杂交子代F1的外部形态和分子遗传结构进行分析。结果发现, 3个群体的综合判别率为72%, F1和母本群体的形态差异最小, 父本群体与母本、F1的形态差异较大。采用HRM法 (high resolution melting) 应用4个SNP位点对这3个群体进行分型, 3个群体的平均观测杂合度H_o和期望杂合度H_e分别为0.2110~0.2879和0.3317~0.4685, F1的杂合度高于两个亲本; 平均多态信息含量PIC值为0.2643~0.3556, 呈现中等程度遗传多样性。F1与母本之间的基因流N_m最大(7.7701), 遗传距离最小(0.0546), 亲缘关系最近; 两个亲本之间的N_m最小(1.9662), 遗传距离最大(0.1759)。rs8位点可以判别两个亲本群体, 可作为特异性的标记。该结果可以为马氏珠母贝群体遗传结构鉴别、育种群体管理提供指导。     

SRAP标记在马氏珠母贝家系F1代中的分离

用SRAP(sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)标记首次对马氏珠母贝(Pinctada martensii)红壳家系的亲本及其子一代(F1)进行了遗传分析.7对引物共扩增出63个位点,多态位点比例为68.25%,其中正常位点59个(93.65%),异常位点4个(6.35%).59个正常位点中,20个位点在F1不分离,39个位点分离.卡方检验表明,39个分离位点中符合孟德尔分离规律的位点28个,占分离位点数的71.79%;偏孟德尔分离规律的位点11个,占分离位点数的28.21%.符合孟德尔分离规律的位点中按1:1分离的位点占25%,3:1分离的位点占75%,1:1分离位点所占比例较小,因此要利用马氏珠母贝家系F1进行SPAP遗传图谱的绘制应适当增加引物数量或改用杂交家系.     

马氏珠母贝DNA快速一步法(ROSE)提取及ISSR-PCR应用

以马氏珠母贝(Pinctada martensii)为材料，采用一步法(ROSE)提取DNA，并将提取的DNA应用于ISSR扩增。结果表明：ROSE法提取DNA比常用的SDS法简易，快捷，无污染物产生，节省费用99％，DNA提取效率相当。ROSE法和常用的SDS法提取的DNA分别用于ISSR分析．可以获得一致性很好的扩增效果。因此，ROSE法提取DNA是一种适合于海洋贝类大规模提取DNA的有效方法。     

大珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

采用生物素标记的(CA)15探针和磁珠富集法构建了大珠母贝(Pinctada maxima)微卫星DNA文库,随机挑选1200个菌落,经PCR筛选得到298个候选克隆,成功测序246个,分析获得251个微卫星序列,其中完美型、非完美型和混合型分别占63%、32%和5%。除探针中使用的CA重复外,还得到AT、GT、TC、AG、GC、TAA、CAA、AGG、GATA、GACA、GTGC、CGTC、GACG、CTGT等重复序列。设计引物90对,挑选其中30对合成并筛选出21对能在大珠母贝基因组有效扩增的引物。种群PCR扩增后利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行检测,获得了10个多态位点,共检测出59个等位基因,片段长度范围为133~444 bp。各位点等位基因数2~8个,平均等位基因数5.9个;有效等位基因数为1.342 3~6.000 0,平均为4.124 0;多态性信息含量(CPI)为0.222 5~0.811 8,平均0.7179;期望杂合度(He)为0.259 3~0.847 5,平均0.717 9;观测杂合度(Ho)为0.300 0~0.800 0,平均0.533 3。这些微卫星多态性标记的获得,为进一步开展大珠母贝遗传育种、保护生物学和种群遗传多样性等研究奠定了一定基础。     

Production of Aneuploid Pinctada martensii Dunker in Tetraploid Induction

Aneuploidy embryos of Pinctada martensii Dunker are produced during tetraploid induction by inhibiting the first polar body in eggs from triploid fertilized with haploid sperms with cytochalasin B treatment. Chromosome analysis reveals that there are 88.18 ±6.79% aneuploidy embryos, and 28.70% aneuploids in pearl oysters of one-year age These aneuploids have five chromosomal conditions, such as 2n + 1(29), 2n + 2 (30), 3n-2 (40), 3n-1(41) and 3n + 1 (43). Results of growth measurement show that there is no significant difference between aneuploids (as a group) and diploids in body size and weight (p ＞ 0.10), but the aneuploide is obviously different from triploid (p ＜ 0.01). The mean body size and weight of aneuploids in diploid condition (2n ± 1 and 2n ± 2) are significantly smaller than those of diploids (p ＜ 0.01),but aneuploids within triploid condition (3n ± 1 and 3n ± 2) are not smaller than diploids in body size and weight (p ＞ 0.1).This study indicates Pinctada martensii Dunker could tolerate aneuploidy by 7 ～ 14% of the haploid genome, and that aneuploids of this species are viable under certain conditions.     

海南岛大珠母贝遗传多样性分析

利用RAPD技术首次对中国海南岛环岛的大珠母贝（Pinctada maxima Jameson）遗传多性进行分析。从20条10bp引物中选取7条引物用于群体遗传多样性分析，共检测出22个位点，其中11个位点（占50％）显多态性，Shannon多样性值为0．117。用非加权配对算数平均法（UPGMA）聚类分析的结果：12个体间遗传相似系数最大为1．000，最小为0．706，平均遗传相似系数为0．8438。表明海南岛大珠母贝群体间遗传多样性不一，遗传分化较大，因此很有必要对遗传多样性水平较高的种群，划定保护范围加以重点保护，以扩大和恢复大珠母贝的种质资源。     

马氏珠母贝选育子一代生长特性研究

通过选择培育获得马氏珠母贝Pinctada martensii大亚湾养殖群体选育子一代(DDS),以大亚湾养殖群体为对照(DDC),在相同条件下进行养殖,对其生长性状进行了约1年的跟踪测量,运用t检验对2个组别主要性状进行了比较。分析表明,经过一代的选育,DDS在壳长、高、宽和总重上均大于DDC,存活率提高9.18%,除壳长在2个时期(2003年12月,2004年2月)差异不显著外(p>0.05),DDC/DDS2个组别其他性状在7个生长时期均具有显著差异(p<0.05)。该研究为进一步通过选择育种培育马氏珠母贝优良品种奠定了基础。     

海洋酸化对马氏珠母贝受精及早期发育的影响

自2010年7月1日至3日,在pH值为8.1、7.7和7.4条件下研究了海洋酸化对马氏珠母贝(Pinctada martensii Dunker)受精及早期发育的影响。结果显示,海洋酸化对不同pH值下马氏珠母贝的受精率无显著影响。pH8.1、pH 7.7和pH 7.4试验组幼虫的壳长、壳高的值逐渐增大,pH 8.1组幼虫的壳长、壳高的值大于同期其他两组的值,且在实验的第24、36、48小时与其他两组同期幼虫的壳长、壳高的值差异显著,这表明海洋酸化显著影响马氏珠母贝幼虫的生长。实验期间,pH 8.1试验组幼虫的存活率和畸形率没有显著变化,而pH 7.7和pH 7.4组幼虫的存活率显著低于pH 8.1组。pH 7.4组幼虫的畸形率显著高于同期pH 8.1和pH 7.7组幼虫的畸形率,表明在海洋酸化的环境中幼虫的发育受到影响。本文将为海洋酸化的相关研究提供基础数据。     

斜带石斑鱼不同地理群体遗传变异的微卫星分析

筛选5时可分析引物对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)台湾群体和广东群体的DNA多态性进行分析.根据电泳检测结果,平均每个引物获得4.2个等位基因,未发现群体的特异位点.获得2个群体平均观测杂合度(H_o)分别为0.672 1和0.682 6,平均期望杂合度(H_e)分别为0.647 9和0.544 4,两群体间的遗传分化系数(F_(ST))为0.011 0.统计结果表明,2个群体有着较高的遗传变异性,群体间的遗传分化程度处于多数海水鱼类的平均水平.     

马氏珠母贝两个与生长性状相关QTL 的验证

利用2个马氏珠母贝群体对遗传连锁图谱已经定位的,与马氏珠母贝生长性状相关的数量性状位点(Quantitative trait locus,QTL)中的两个进行验证。结果显示:m59标记在2个群体中与壳高、壳长、壳宽和总重具有显著的相关性(P0.05),其GT基因型的个体壳高、壳长、壳宽和总重均显著高于GG基因型的个体;154165标记在湛江群体中与壳高具有显著相关性(P0.05),而在深圳群体中与壳宽具有显著相关性(P0.05);表明QTL标记m59在2个群体中是共享QTL,而154165标记在群体中是特异QTL。基于这两个QTL在这2个群体中分别构建二倍型,发现在湛江群体中二倍型C_1(AAGT)和深圳群体中D_1(AGGT)型和D_2(AAGT)型对马氏珠母贝生长最为有利,可作为优先的基因型组合。     

马氏珠母贝养殖群体的生长特性研究

从养殖于深圳大亚湾海区的3月龄马氏珠母贝Pinctada martensii养殖群体中挑出较大和较小个体的贝分为2个组,分别命名为大个体组和小个体组,以同样的方式进行养殖,在3—12月龄间每隔1—2月对其生长进行测量;同时取12月龄的贝200个编号进行个体生长测量,到16月龄结束。经t检验,大个体组贝在各个测量阶段4个性状(壳长、高、宽和体重)都显著大于小个体组(p<0.01),大个体组日增长幅度在3—9月龄也大于小个体组;经最小显著差法分析,个体测量的3个亚组间大小存在显著差异(p<0.01),顺序为Ⅰ(Ⅰ’)<Ⅱ(Ⅱ’)<Ⅲ(Ⅲ’),但其日增长量为Ⅰ(Ⅰ’)>Ⅱ(Ⅱ’)>Ⅲ(Ⅲ’),同时显示出初始值较大的个体在后期仍有较大的增长趋势,但个别初始值较小的个体增长快,在生长后期个体也很大。3—9月龄贝的大小平均增长率大于11—16月龄贝,而体重增长要小于11—16月龄贝。该研究结果对选择育种中亲本的选留、珍珠生产中植核贝的选留具有较大的指导作用。