适用于甲壳动物细胞的缓冲液配方优化

目前,在对螯虾、对虾等甲壳动物细胞的研究中,广泛采用了适用于哺乳动物细胞或昆虫细胞的各类缓冲液和培养液。但是,甲壳动物体液的渗透压与哺乳动物等有很大差异,直接沿用哺乳动物等细胞的缓冲系统不合适。本研究首先测定了红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii),与饲养在盐度30海水中的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的血清渗透压,其值分别为(409±12)、(465±8)、(704±15) mOsmol/kg。随后,通过调节NaCl的浓度来改变抗凝剂和磷酸盐缓冲液(PBS)的渗透压,使其与相应动物的血清渗透压相等。优化后适用于红螯螯虾的抗凝剂和PBS中,NaCl的浓度分别为70、200 mmol/L;适用于克氏原螯虾的抗凝剂和PBS中,NaCl的浓度分别为100、230 mmol/L;适用于凡纳滨对虾的抗凝剂和PBS中,NaCl的浓度分别为220、360 mmol/L。进一步比较了3种动物的血细胞在不同渗透压缓冲液中的存活情况。结果表明,红螯螯虾、克氏原螯虾以及凡纳滨对虾这3种甲壳动物的血细胞在未优化的PBS中处理15 min,死亡率就分别达到4.5%、2.0%以及10.0%左右;然而当使用优化后的PBS进行处理时,死亡率则分别降至1.0%、1.0%以及2.0%左右。而血细胞在抗凝剂中的死亡率则较低(<2.0%),优化前后没有显著差异。综上,在甲壳动物活细胞实验中采用优化后的缓冲液,能改善细胞的状态,提高实验的准确性。     

饲料中铜离子对斑节对虾血细胞组成、活性和免疫功能的影响

以不同铜离子添加量(0, 10, 25, 40, 55 和110 mg/kg)的饲料喂养斑节对虾(Penaeus monodon)8 周,测定对虾的血细胞总数(THC), 并应用流式细胞术测定血细胞中含颗粒细胞(小颗粒细胞和大颗粒细胞)的比例、血细胞凋亡率、活性氧(ROS)含量和酯酶活性。结果显示, 当铜添加量为10～55 mg/kg 时, 与对照组相比, 对虾的THC、血细胞凋亡率、ROS 含量和酯酶活性均没有显著的变化(P>0.05); 铜添加量为25～110 mg/kg 时, 含颗粒细胞的比例显著提高(P<0.05); 铜添加量为110 mg/kg 时, ROS 含量显著高于其他组(P<0.05), 血细胞凋亡率高于25 和55 mg/kg 组(P<0.05), THC 低于55 mg/kg 组(P<0.05), 酯酶活性低于25mg/kg 组(P<0.05)。这些结果表明, 适宜的饲料铜含量有利于两类颗粒细胞的生成; 铜添加过量(110 mg/kg)会诱导血细胞ROS 的产生, 造成氧化损伤, 从而导致凋亡率上升和THC 下降。综上所述, 在本实验日粮条件下, 针对斑节对虾的血细胞功能, 其饲料中铜适宜添加含量范围为25～55mg/kg。     

夏季南黄海浮游甲壳动物死体比例的初步研究

浮游动物死体是海洋沉降碳通量的重要组成部分,研究浮游动物死体对于准确评估特定海区生物泵碳通量具有十分重要的意义。为了解夏季南黄海浮游甲壳动物在自然海区的死亡情况,采用2019年7~8月在南黄海获取的浮游动物样品,使用中性红染色法分析了浮游甲壳动物死体的平面分布及其受控环境因素。结果表明,夏季南黄海浮游甲壳动物平均丰度为(1 378.3±929.84) ind./m³,其死体比例在5.0%~68.8%之间,平均为33.3%±16.6%。桡足类是浮游甲壳动物的主要类群,平均丰度为(1 202.9±937.4) ind./m³,死体比例在3.6%~69.7%之间,平均为38.6%±17.0%,与全球海域浮游桡足类的平均死体比例相当。不同浮游甲壳动物优势种的死体比例存在差异。其中,拟长腹剑水蚤(Oithona similis)死体比例最高(62.0%),鸟喙尖头溞(Penilia avirostris)最低(17.9%)。与环境因子的相关性分析结果表明,海水温度和盐度是影响夏季南黄海浮游甲壳动物死体比例的主要影响因子。小拟哲水蚤(Paracalanus parvus)死体比例和表层温度显著正相关,拟长腹剑水蚤和近缘大眼剑水蚤(Corycaeus affinis)的死体比例与表底温差具有显著的正相关;而表层盐度与克氏纺锤水蚤(Acartia clausi)的死体比例存在正相关关系。该研究结果可为深入认识南黄海海洋生态动力学过程和海洋碳通量等相关研究提供重要的参考资料。     

背景色对红螯螯虾生长、存活、体色及栖息行为的影响

本研究通过设置5种不同背景色（白色、红色、绿色、蓝色、黑色）,以探究背景色差异对红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）生长、存活、体色及栖息行为的影响。结果表明养殖56 d后黑色背景色组红螯螯虾体重增长量、特定生长率和成活率最高,分别为32.66 g、1.74%和76.4%,其次为绿色、蓝色和红色背景色组,白色组最差（P<0.05）;黑色和红色背景色红螯螯虾饵料系数最小（3.73~3.80）;黑色背景色条件下红螯螯虾体色偏蓝,ImageJ分析表明,黑色背景色组虾壳RGB值中R和G值显著低于其他各组,黑色背景色虾壳虾青素含20.23 mg/kg,亦显著低于其他各组（69.34~82.15 mg/kg）（P<0.05）;黑色背景色条件下红螯螯虾分布于遮蔽物外的几率显著高于其他各组（P<0.05）。综上所述,背景色能够影响红螯螯虾生长存活、体色及行为分布,养殖中采用黑色作为背景色能够显著提高红螯螯虾生长存活,改善虾体颜色。     

逐步线性回归法实现中华虎头蟹(Orithyia sinica) 形态指标与体重的通径分析

为探讨中华虎头蟹(Orithyia sinica)形态指标与体重的关系, 为良种选育提供最佳的测量指 标, 实验以中华虎头蟹为材料, 测量甲宽、甲长、眼间距、侧齿间距、大螯不动指长、大螯宽、步足 长节长、体高、体重等26 个指标, 借助逐步线性回归、相关分析和通径分析等方法, 分析形态指标 与体重的关系。结果表明, 除第Ⅳ侧齿间距(A₈)外, 实验所测形态指标与体重的相关系数均达到了显 著水平(P<0.05); 采用逐步线性回归的方法建立了多元回归方程Y=-273.841+10.4X₁+2.867X₂, 其中 Y 为体重(g), X₁ 为右大螯宽(mm), X₂ 为第Ⅱ侧齿间距(mm), 定量分析了形态指标对体重的影响结果。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)造血激素的组织分布及细胞定位分析

造血激素(astakine)是一种具有促进造血组织细胞分化和增殖作用的甲壳动物细胞因子,参与甲壳动物的造血活动,对于只依赖于非特异性免疫的甲壳动物抗感染能力有重要的意义。本实验室前期成功克隆凡纳滨对虾造血激素(LvAST)的基因Lvast。为了进一步了解其功能,本文通过实时荧光定量PCR技术检测了Lvast表达的组织分布,同时还用Dlight标记抗LvAST抗体进行了LvAST在对虾细胞和组织中的免疫荧光定位分析。荧光定量PCR测定结果说明,Lvast主要在肝胰腺、鳃和肌肉中大量表达,而淋巴器官和血淋巴细胞中表达量较低;免疫荧光结果显示,LvAST可同时存在于血淋巴细胞内和血淋巴细胞膜表面,不同的血淋巴细胞表面的LvAST分布呈现出明显差异,可能具有重要的血细胞分类意义。LvAST蛋白在肝胰腺、鳃、肌肉、淋巴器官等组织中均有分布,并且肝胰腺组织中分布较多,淋巴器官组织中分布较少。     

白芍(Radix paeoniae alba)提取物对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)造血组织发育及造血因子Astakine的影响

血淋巴细胞在甲壳动物免疫反应中起着非常重要的作用,其主要由造血组织(Hematopoietic tissue, HPT)生成并随着开管式循环分布到身体各处。到目前为止,还没有相关研究表明甲壳动物造血组织是否受草本植物的影响。本研究以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为对象,利用荧光定量PCR、免疫荧光和组织化学等技术,初步探索了白芍(Radix paeoniae alba)提取物对中华绒螯蟹造血组织和造血因子Astakine的影响。结果显示,在原代培养的造血组织细胞中添加终浓度为0.85mg/mL的白芍提取物后,造血因子Astakine mRNA的表达量显著上调(P0.05)。进一步制备含1%白芍提取物的中华绒螯蟹饲料并进行饲喂实验,结果显示饲喂含白芍提取物饲料的中华绒螯蟹造血组织的Astakine mRNA的表达量较饲喂前上调了10.5倍,要高于对照组。免疫荧光结果同样表明,饲喂含白芍提取物饲料后中华绒螯蟹造血组织的Astakine蛋白荧光信号也要强于对照组。通过造血组织的形态学观察和造血组织体重百分比的检测,我们发现白芍组中华绒螯蟹造血组织含有较多卵形小叶,且造血组织体重百分比较饲喂前增加了6.64%,而对照组仅增加1.6%。免疫保护率实验显示,在脂多糖急性刺激下,白芍添加组的中华绒螯蟹的存活率(77.5%)要高于对照组(57.5%)。综上所述,白芍提取物可以促进中华绒螯蟹造血因子的表达和造血组织的发育,从而提高中华绒螯蟹的免疫调节功能。     

大菱鲆CD55负调控补体激活及其广谱细菌结合能力

CD55蛋白在哺乳动物中是一种补体调控因子,但其在鱼类中的功能未知。本研究探索了大菱鲆(Scophthalmus maximus) CD55(SmCD55)蛋白的功能。结果表明,SmCD55蛋白由344个氨基酸残基构成,含有一个N端信号肽和3个补体调控蛋白(CCP)功能域。SmCD55基因在大菱鲆多种组织中均有表达,其中,在肌肉中表达量最低,在脑组织的表达量最高。通过原核表达获得了重组的SmCD55(rSmCD55)蛋白,发现rSmCD55蛋白能够抑制大菱鲆血清的溶血活性和杀菌活性,表明其负调控补体系统的激活。此外,本研究还发现rSmCD55蛋白可以结合包括重要水产病原菌迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、鳗弧菌(Vibrio anguilla­rum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和海豚链球菌(Strep­tococcus iniae)在内的多种细菌,其中与哈维氏弧菌的结合能力最强。以上这些研究结果丰富了鱼类补体系统的理论知识,加深了对鱼类补体激活调控的了解。     

海草土壤种子库：特征、影响因素、研究方法及其在受损海草场恢复中的作用

海草的土壤种子库具有巨大的时空异质性,不同种类密度差别可达5个数量级,同一种植被的土壤种子库,在不同环境、不同阶段亦相差甚大。种子具有休眠现象的海草可形成持久种子库(种子寿命≥1 a),例如喜盐草属(Halophila)、针叶草属(Syringodium)、川蔓草属(Ruppia)和丝粉草属(Cymodocea),或短暂种子库(种子寿命<1 a),例如鳗草属(Zostera)和虾形草属(Phyllospadix)。种子没有休眠现象,例如海菖蒲属(Enhalus)和泰来草属(Thalassia),或具有胎生现象的海草,例如全楔草属(Thalassodendron)和根枝草属(Amphibolis),则不形成土壤种子库。植被特性、环境条件、动物行为等影响海草的土壤种子库。海草土壤种子库密度的研究方法可分为直接计数法和幼苗萌发法两种,采用何种方法取决于种子的大小以及破除休眠的可控性。土壤种子库尤其是持久种子库是一年生海草场或受到较大干扰海草场恢复的关键。我国绝大部分的海草场面临巨大的人为威胁,且不少海草场由一年生海草组成,因此,保护好这些海草场的土壤种子库至关重要。     

凡纳滨对虾造血激素的组织分布及细胞定位分析

造血激素（astakine）是一种具有促进造血组织细胞分化和增殖作用的甲壳动物细胞因子,参与甲壳动物的造血活动,对于只依赖于非特异性免疫的甲壳动物抗感染能力有重要的意义。本实验室前期成功克隆凡纳滨对虾造血激素（LvAST）的基因Lvast。为了进一步了解其功能,本文通过实时荧光定量PCR技术检测了Lvast表达的组织分布,同时还用Dlight标记抗LvAST抗体进行了LvAST在对虾细胞和组织中的免疫荧光定位分析。荧光定量PCR测定结果说明,Lvast主要在肝胰腺、鳃和肌肉中大量表达,而淋巴器官和血淋巴细胞中表达量较低;免疫荧光结果显示,LvAST可同时存在于血淋巴细胞内和血淋巴细胞膜表面,不同的血淋巴细胞表面的LvAST分布呈现出明显差异,可能具有重要的血细胞分类意义。LvAST的蛋白在肝胰腺、鳃、肌肉、淋巴器官等组织中均有分布,并且肝胰腺组织中分布较多,淋巴器官组织中分布较少。     

利用实时荧光定量PCR法测算红螯螯虾实体组织的细胞数量

螯虾是重要的水产养殖动物,也是研究甲壳动物疾病与免疫的一个良好模型.在研究不同组织的功能及受病原感染的影响时,需要了解组织内的细胞数量.但是,目前常用的细胞计数方法仅适用于单细胞悬液,无法用于实体组织.本研究以红螯螯虾( Cherax quadricarinatus)为对象,建立了基于基因拷贝数定量分析的实体组织细胞数...     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Runt转录因子的基因克隆及其功能分析

Runt结构域转录因子家族(Runx)在哺乳动物体内存在三种基因型,分别起着造血,骨生成和控制上皮细胞增殖的作用。本文应用反转录和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,首次在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中克隆并测序了一种Runt(lvrunt)基因全长。lvrunt c DNA全长1754bp,含有1个663bp长的开放阅读框,编码221个氨基酸,理论分子量为23.6k Da,具有Runt-family结构域。对凡纳滨对虾鳃、肠、肝胰腺、类淋巴、心脏、肌肉组织和血淋巴lvrunt的转录特征进行分析,结果显示该基因几乎特异性地在血淋巴细胞中表达,而在其他组织中表达较低。肌肉注射重组造血激素蛋白(r AST)或白斑综合征病毒(WSSV)粗提液均可显著提高lvrunt在凡纳滨对虾体内的转录表达。上述结果提示,lvrunt主要在血细胞发挥作用,可能作为造血激素的下游基因起到调节血细胞增殖和分化的作用,并在受到病毒感染后,参与提升血细胞数量或者促进血细胞分化的过程。     

三疣梭子蟹含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆及其表达分析

为探究三疣梭子蟹的免疫机制以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)在甲壳动物响应寄生虫感染免疫过程中的作用,本研究采用RACE方法从三疣梭子蟹中克隆获得硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,其cDNA序列全长为696bp,5′-UTR长度为102bp,3′-UTR长度为87bp,开放阅读框长度为507bp,编码168个氨基酸,其中含有一个典型的由蛋白石终止密码子(220TGA222)编码的硒半胱氨酸(40U)。预测了该基因编码的氨基酸序列及其中的保守结构域,包括GPx家族签名序列(64LAFPCNQF71)、活性位点序列(152WNFEKF157)以及与酶催化活性相关的氨基酸位点包括谷氨酰胺(74Q)、精氨酸(90R和168R)和色氨酸(142W)。相似性比对和系统发育分析结果表明,三疣梭子蟹硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶(SeGPx)与甲壳动物中的SeGPxs相似性较高,其中与拟穴青蟹SeGPx相似性最高,并与其在系统发育树中聚为一支。经血卵涡鞭虫侵染后(0—192h),SeGPx基因在三疣梭子蟹的血细胞、肝胰腺和鳃组织中的转录水平均发生显著性升高。该结果表明,SeGPx在三疣梭子蟹应对血卵涡鞭虫的免疫反应中发挥重要作用,可通过调控甲壳宿主体内被病原扰乱的氧化还原状态进而起到宿主组织保护作用。     

皱纹盘鲍血细胞吞噬发光的研究

于１９９８年７月从大连碧龙海珍品有限公司购得人工养殖的皱纹盘鲍,运用化学发光法研究在体外条件下利用６种活性氧清除剂ＳＯＤ（超氧化物歧化酶）、ＣＡＴ（过氧化氢酶）、苯甲酸钢和ＤＭＦ（二甲基呋喃）、ＮＢＴ（硝基四唑蓝）及金属螯合济ＥＤＴＡ（乙二胺四乙酸）等试齐对皱纹盘鲍血细胸吞噬活动中化学发光的产生和影响。结果表明,活性氧清除剂对皱纹盘鲍血细胞的吞噬发光都有掏作用,说明皱纹盘鲍血细胞在吞噬活动中能够释     

脊尾白虾C-型凝集素基因cDNA全长的克隆和表达分析

本研究利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞c DNA文库中的C-型凝集素基因EST序列,采用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术克隆获得脊尾白虾C-型凝集素基因c DNA全长,命名为Ec CTL。该基因全长1285 bp,包含1041 bp的开放阅读框,编码346个氨基酸组成的蛋白质,分子量为38.56 k Da,为甘露糖型凝集素。同源性分析表明,脊尾白虾Ec CTL基因氨基酸序列与秀丽白虾(Palaemon modestus)的同源性最高,达到91%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec CTL基因在血细胞、肝胰腺、肌肉等组织中均有表达,其中在肝胰腺当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)后6~12 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec CTL的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究证明脊尾白虾C-型凝集素在其免疫反应中起到重要作用,为进一步探索脊尾白虾免疫系统打下基础。     

Uptake of palytoxin‐like compounds by shellfish fed Ostreopsis siamensis (Dinophyceae)

Abstract

Greenshell? mussels (Perna canaliculus Gmelin), scallops (Pecten novaezealandiae Reeve), and Pacific oysters (Crassostrea gigas Thunberg) were fed with a New Zealand strain of mass cultured Ostreopsis siamensis Schmidt (for 27 and 84 h and with 1.5 × 10⁶ or 8.6 × 10⁶ cells, respectively) under laboratory conditions. The microalgal cells contained 0.3 pg palytoxin equivalents cell^–1 (as determined by the haemolysis neutralisation assay (HNA) of Bignami (1993)) and extracts of these cells were toxic to mice after intraperitoneal injection. No palytoxin‐like material was detected either in the hepatopancreas or the muscle and roe of mussels fed O. siamensis. Oysters contained detectable amounts of toxin in hepatopancreas muscle, and roe while higher concentrations were present in the hepatopancreas of scallops. Extracts of control shellfish (tested biotoxin free and not fed O. siamensis) were toxic to mice, and there was no definitive evidence that feeding shellfish with O. siamensis at the levels employed in the present experiment increased the toxicity of shellfish tissue extracts to mice.     

5种南海海藻醇提取物活性初步研究

海藻是海洋生物代谢产物的主要来源之一,能产生丰富多样的生物活性物质.为了更好地利用中国南海的海藻资源,分别对采自中国湛江硇洲岛的1种绿藻基根硬毛藻Chaetomorpha basiretorsa Setchell和4种红藻刺状鱼栖苔Acantophora spicififera (Vahl) Boerg、三列凹顶藻Laurencia tristicha Tseng, Chang et Xia、紫杉状海门冬Asparagopsis taxiformis (Delile) Trevisan、鸡毛菜Pterocladia tenuis Okam进行了生物活性研究,分别对细胞毒活性(KB、Bel-7402、PC-3M、Ketr3和MCF-7)、Na~+,K~+-ATPase抑制活性以及犬血管平滑肌细胞增殖抑制活性进行了筛选,部分海藻提取物表现出一定的生理活性.     

Chemical defenses against generalist fish predators and fouling organisms in two invasive ahermatypic corals in the genus Tubastraea

The introduction of exotic marine species has caused considerable economic and ecological damage around the world. Some of these species possess adaptations such as secondary metabolites which facilitate their successful invasion into new areas. In this study we tested two hypotheses: (i) crude extracts produced by two invasive hard corals Tubastraea coccinea and Tubastraea tagusensis, introduced to the southwest Atlantic, inhibit predation by generalist fish; (ii) substances found in the crude extracts of both species reduce or enhance the settlement of other organisms. In an in situ palatability bioassay the extract of T. tagusensis reduced predation by generalist fish. The extracts of both species of coral showed species‐specific effects on fouling organisms in in situ gel plate bioassays. Control and extract plates had similar total cover, although plates with extracts had significantly fewer Cladophora sp., and Lithophyllum sp. was only detected on control gels. In contrast, a hydrozoan was only found on plates with extracts and overall community ordination demonstrated clear differences in the fouling communities between treatments. These results demonstrate that both coral species have chemical substances which can bring about a negative interaction with potential fish predators and competitors such as algal and invertebrate foulers and the advantage gained could explain their success in invading new regions to the detriment of local fauna and flora.