单环刺螠硫醌氧化还原酶的表达、纯化和复性

硫化物是1种广泛分布的有毒物质。硫醌氧化还原酶(SQR)是硫化物代谢的关键酶。单环刺螠是1种生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物。本研究为了获得具有活性的单环刺螠SQR,将其基因的开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行重组蛋白的表达,后采用稀释复性的方法对重组蛋白进行复性。经IPTG诱导后该重组蛋白主要以包涵体形式存在。用8 mol/L的尿素溶解包涵体后,通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白。首次通过蛋白复性的方法获得具有活性的单环刺螠SQR,确定最佳稀释复性条件为pH=8.0,蛋白浓度20μg/mL,L-精氨酸浓度0.2 mol/L,还原型谷胱甘肽∶氧化型谷胱甘肽=10∶1,复性时间为96 h。     

单环刺螠硫醌氧化还原酶间接竞争ELISA检测方法的建立

硫醌氧化还原酶(Sulfide:quinone oxidoreductase,SQR),是线粒体硫化物代谢的关键酶。本研究以生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物—单环刺螠SQR重组蛋白为材料,建立了单环刺螠SQR间接竞争ELISA检测方法,为定量分析SQR蛋白水平表达奠定了基础。将SQR重组蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,检测效价高达1:64 000。采用免疫印迹实验,将该抗体与重组蛋白和体壁总蛋白杂交,均得到了单一的条带,表明该抗体特异性好。优化SQR间接竞争ELISA检测条件,得出最佳的抗原包被浓度为250ng/mL,一抗浓度为1∶20 000,二抗浓度为1∶12 000,此条件下建立的标准曲线检测范围为2.5～1 000ng/mL。精确度检测结果显示,批内差异在0.42%～7.27%、批间差异在2.58%～7.78%范围内,表明该条件下精确度具有良好的准确性和重复性。以上结果表明,已成功建立单环刺螠SQR间接竞争ELISA检测方法。     

单环刺螠耐硫机制研究进展

本文概述了硫化物的生理毒性,包括对生物体的有氧呼吸毒性,神经毒性,线粒体毒性,核酸和蛋白质毒性。总结了单环刺螠在硫化物胁迫下存在的应对机制,包括体壁分泌粘液,细胞凋亡过程中某些酶活性的升高和凋亡通路的放大;体内氧化酶活性的改变;体腔液某些成分含量及细胞器结构的变化,线粒体内相关酶系的氧化以及RNA、DNA结构和含量的变化等。     

单环刺螠染色体核型分析

染色体是细胞遗传学的研究基础,为了补充螠虫动物的核型资料,为单环刺螠(Urechis unicintus)的遗传育种和进化分类研究提供基础,以单环刺螠胚胎、幼体及成体体腔细胞、呼吸肠等为材料,经植物血球凝集素(PHA)和秋水仙素处理后,采用低渗和滴片常规方法制备染色体标本,对单环刺螠染色体数目和核型进行了研究.结果表明...     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化出的1组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活性和纤溶活性以及较好的生物安全性。根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3-’RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5-’RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp。该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsindomain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。     

单环刺螠对硫化物暴露的呼吸代谢适应

研究硫化物暴露后单环刺组织细胞色素氧化酶(CCO)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、延胡索酸还原酶(FRD)等呼吸代谢酶活性的变化,初步探讨了单环刺对硫化物的呼吸代谢适应。将虫体暴露于50,150μmol/L 2个硫化物组和不含硫化物的对照组水体中,分别于暴露后0,2,12,24,48 h和解除暴露后48 h取体壁、呼吸肠等组织进行酶活性分析。结果显示:暴露2 h时,硫化物组CCO活性上升。24 h时,150μmol/L组CCO活性显著低于对照组,到48 h时接近于0,而SDH活性显著低于对照组,FRD活性极显著高于对照组。解除暴露后48 h,虫体的呼吸代谢酶活性与对照组无显著差异。可见,硫化物暴露后,短期内虫体呼吸代谢提高,可能进行硫化物氧化解毒。而随着暴露时间的延长,虫体的呼吸代谢减弱,FRD活性极显著增高,推测体内可能存在将延胡索酸还原成琥珀酸的无氧代谢方式。解除硫化物暴露后,虫体具有较强的自我恢复能力。     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶( UFE)是由本实验室分离纯化出的l组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活件和纤溶活性以及较好的生物安全性.根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3'-RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5’-RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp.该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsin domain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶.     

硫应激单环刺螠差异表达的初步研究

采用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)研究了100μmol/L硫化物环境与正常海水中耐硫生物单环刺螠mRNA的表达差异,初步筛选出7条体腔液细胞的差异表达基因,其中1个cDNA克隆片段与其它物种的MAP kinase kinase kinase(MAPKKK)有较高同源性。进一步采用RT-PCR技术对其在硫化物刺激前后的表达进行了检测,结果显示该基因在对照和应激后2 h6、h的个体中表达较弱;刺激12 h后表达量增高,并随应激时间增加,呈明显上调趋势。表明单环刺螠MAPK信号通路可被硫化物刺激激活,进而通过该信号通路调节下游生理反应,为进一步研究单环刺耐硫特性的分子机制奠定了基础。     

单环刺螠育苗养殖及综合利用研究进展

单环刺螠(Urechis unicinctus)是我国北方沿海常见的一种海洋底栖无脊椎动物,也是具有较好市场开发前景的新型海水养殖品种之一。本文概述了单环刺螠的基础生物学、人工育苗和养殖现状,以及高附值开发潜力,并提出了构建单环刺螠新型海水养殖产业链的可行性。     

单环刺螠Bcl-xL基因的鉴定及对硫化物的应激反应

Bcl-xL是Bcl-2家族中一类重要的抗凋亡因子,其功能主要是抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生。为了探知Bcl-xL在生物硫化物应激中的作用,本实验以耐硫生物单环刺螠(Urechis unicinctus)为研究对象,RACE扩增获得一个长度为1 426 bp的单环刺螠Bcl-xL全长c DNA序列,推导的氨基酸序列包含Bcl-xL4个保守的BH结构域和1个跨膜区域。使用该c DNA的完整开放阅读框序列,构建了原核表达载体p ET28a-Bcl-xL,体外诱导表达该重组蛋白;镍柱纯化得到纯度为90%的纯化蛋白,并制备多克隆抗体。Western blotting结果显示:单环刺螠暴露于50μmol/L硫化物中2 h-24 h内其呼吸肠中Bcl-xL含量显著增加(P0.05),然而在150μmol/L硫化物中48 h-72 h内其呼吸肠Bcl-xL含量显著降低(P0.05),暗示Bcl-xL抑制细胞凋亡途径在单环刺螠应对低浓度硫化物暴露时发挥作用,而在高浓度硫化物暴露下Bcl-xL不能发挥抑制细胞凋亡的作用。     

单环刺螠生物学及生态学研究进展

单环刺螠(Urechisunicinctus)是中国沿海分布的唯一无管螠目(Xenopneusta)种类,具有较高的营养价值和经济价值。近年来由于过度捕捞,单环刺螠自然资源破坏严重,亟待开展人工养殖以满足人们的需求。本文综述了单环刺螠生物学和生态学方面的研究进展,同时提出了单环刺螠的研究方向,并分析了其养殖前景。     

基于线粒体COI序列莱州湾单环刺螠遗传多样性分析

为系统地了解莱州湾单环刺螠(Urechis unicinctus)遗传多样性,作者基于线粒体COI序列利用基因测序技术研究了莱州湾3个单环刺螠不同群体的遗传多样性。实验结果显示,84个莱州湾单环刺螠样本有变异位点数125个,其中包括43个单一变异位点,82个简约信息位点;48个单倍型,单倍型多样性0.977;核苷酸多样性指数0.01048;平均核苷酸差异数量13.725;莱州湾单环刺螠遗传多样性水平较高;个体聚类并没有体现出和地理位置相关。     

一株单环刺螠致病弧菌的分离鉴定、生长特性研究及药敏分析

对患病的单环刺螠幼体3 000～4 000只/kg肠道内病原菌进行分离鉴定、生长特性研究及药敏分析,为人工养殖单环刺螠幼体过程中出现的疾病提供治疗依据。对患病幼体肠道内的病原菌进行分离纯化、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析、人工回接感染试验、生长曲线测定、最适生长温度、pH、盐度的探究;采用K-B纸片扩散法对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、头孢唑林、四环素中度敏感,对阿奇霉素、新霉素、万古霉素、利福平、红霉素、克林霉素、阿莫西林进行药敏试验;并对抑菌效果最好的药品进行安全性检测。分离纯化后经生理生化鉴定获得一种弧菌命名为菌株SX-1,16S rRNA基因序列分析极有可能为新喀里多尼亚弧菌(Vibrioneocaledonicus),人工回接感染试验表明SX-1是单环刺螠幼体从沙底钻出,活动能力减弱,体表变红症状的致病菌,生长特性研究表明其最适生长温度、pH、盐度分别为30℃, 6.0, 35;药敏试验结果表明, SX-1对氯霉素、羧苄西林、氧氟沙星、头孢曲松高度敏感,安全性检测实验表明,氧氟沙星抑菌治疗效果明显,并对单环刺螠无伤害。从单环刺螠肠道内分离获得了一种极有可能为新喀里多尼亚弧菌(Vibrio neocaledonicus)的致病菌SX-1。对于感染该种弧菌的单环刺螠,氧氟沙星抑菌治疗效果明显,并对单环刺螠无伤害。我们的实验结果对于预防并治疗人工养殖过程中单环刺螠患病提供理论依据和治疗模式,因而具有实际指导意义。     

单环刺螠线粒体基因组全序列的获得——长PCR 结合鸟枪法测序

由于具有单基因所不可比拟的优势,线粒体基因组现已成为后生动物种群遗传和分子系统发育研究中一个重要的信息来源。本研究选取螠虫动物的代表物种——单环刺螠(Urechis unicinctus),详细阐述了利用长PCR方法扩增其线粒体DNA,获得约15 kb的扩增产物,进而构建shotgun文库,最终成功获得单环刺螠线粒体基因组全序列的流程。本实验流程样品需求量少、设备要求低、简便快捷。     

耐高温球等鞭金藻(Isochrysis galbana)藻种的选育与饵料特性初步分析

通过显微操作技术从海水饵料微藻培育池中分离出4株球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)藻株,测试其在高水温(33°C,40°C)下的生长性能;对藻株的颗粒大小和粗蛋白含量进行了测定;筛选出一株生长速度较快的球等鞭金藻PHY7004,优化了其培养条件;分析了单环刺螠幼苗对其的摄食能力。结果表明,分离出的4株球等鞭金藻可在水温33°C下生长,其中PHY7004生长速率最快;分离出的各藻株细胞的平均直径为5.5—7.5μm;耐受33°C的4株藻株平均鲜重蛋白质含量为34.29 mg/L,其中PHY7003蛋白质含量最高,为41.80mg/L;优化后的最适培养条件为pH=7,N/P=14:1;单环刺螠幼苗对PHY7002的摄食强度较高。本实验为耐高温饵料藻种的筛选提供参考,也可为单环刺螠育苗所用的饵料微藻的选择提供依据。     

单环刺螠(Urechis unicinctus)微卫星标记开发及5个地理种群遗传结构分析

采用高通量测序法从单环刺螠基因组中开发微卫星标记,并通过一个秦皇岛单环刺螠野生群体对其进行多态性评价,利用获得的多态性引物对秦皇岛、烟台、潍坊、青岛、大连5个不同海区的野生单环刺螠群体进行了遗传多样性及遗传结构分析。结果表明:本实验设计的50个微卫星标记能稳定扩增的有38个,其中22个微卫星位点在5个群体中均表现为高多态性,等位基因数(Na)介于24—44之间,多态信息含量(PIC)介于0.921—0.967之间。5个群体总的平均有效等位基因数(N_e)范围为6.629—8.850,平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)范围分别为0.790—0.912、0.851—0.896,大连群体的杂合度最大(H_e=0.8962),潍坊群体的最小(H_e=0.8510),其中有12个微卫星位点在不同群体中出现显著偏离Hardy-Weinberg平衡的现象。平均遗传分化指数(FST)表明,群体分化水平处于中等分化水平(FST值为0.0880—0.1136);聚类分析显示烟台群体先与青岛群体聚为一支,再与秦皇岛群体聚类,然后跟潍坊群体聚为一支,大连群体单独聚为一支;遗传距离模式(IBD)显示单环刺螠群体的地理距离与遗传距离间不存在显著的线性关系。本研究开发的22对微卫星标记可以用于单环刺螠遗传结构分析研究,为下一步单环刺螠种质资源保护和人工繁育提供参考依据。     

糖原含量与糖原磷酸化酶基因(GPH)和己糖激酶基因(HK)的表达在福建牡蛎生殖周期中的相关性分析

Glycogen, a polymer of glucose, is an important means of storing energy. It is degraded by glycogen phosphorylase (GPH) and hexokinase (HK), glycogen phosphorylase, and hexokinase cDNAs (Ca-GPH andCa-H...