基于玛氏骨条藻转录组的细胞死亡相关功能基因解析

本研究以玛氏骨条藻(Skeletonema marinoi)转录组信息为基础,发现玛氏骨条藻中存在26个与细胞死亡相关的酶以及37个编码这些酶的基因。这些编码基因的序列比对结果表明,其与假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)和大洋海链藻(Thalassiosira oceanica)的同源基因具有较高的一致性。对这些样品进行数字基因表达谱的差异基因分析,获得了不同生长时期时与细胞死亡过程有关的编码基因的差异表达数据。结果发现,在稳定期和衰亡期,与抗氧化胁迫作用相关的关键酶(如过氧化物酶5、铜锌超氧化物歧化酶)、与RNA的加工与降解过程有关的功能基因(如多核糖核苷酸核苷转移酶、5’~3’核糖核酸外切酶2)以及细胞死亡特异蛋白的基因表达量显著高于指数期。本论文主要是通过对转录组数据进行分析得到基因转录组水平差异表达结果,为蛋白水平研究提供一种可能性变化趋势和潜在数据依据,同时为以后研究提供数据基础及研究方向。本研究也为进一步探讨硅藻的细胞死亡机制奠定了基础,也为深入理解赤潮的消亡过程提供了新的视角。     

多形微眼藻在不同氮源条件下固碳途径的转录组解析及与其他微藻的比对

本研究通过转录组技术对不同氮源培养下的多形微眼藻(Minutocellus polymorphus)固碳途径进行分析。通过对转录本进行NR、NT、Swiss-Prot和KOG富集分类及GO、KEGG相关代谢途径和基因差异表达分析,构建了多形微眼藻固碳途径。研究发现该藻除具有C_3固碳途径外,还具有较完整的C_4固碳通路。在注释到的164个固碳相关编码基因中,有33个出现明显表达差异。根据基因的差异表达情况可以发现,在有机氮源中多形微眼藻C_3固碳途径的核酮糖-1,5-二磷酸再生阶段和C_4固碳途径的磷酸烯醇式丙酮酸再生阶段相关编码基因均有上调表达, C_4固碳羧化阶段相关编码基因均有下调表达。研究对比了多形微眼藻与假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)、三角褐脂藻(Phaeodactylum tricornutum)和抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)固碳途径的异同点,发现多形微眼藻与抑食金球藻有相似的C_4固碳途径,与三角褐脂藻有相似的C_3固碳途径。进一步分析多形微眼藻碳氮代谢途径基因表达情况,发现两种代谢途径相互支撑,存在协同效应。研究结果可丰富微藻的固碳通路研究,也可为深入分析褐潮暴发原因提供依据。     

栅藻全转录组测序与类胡萝卜素合成途径相关基因分析

栅藻(Desmodesmus sp.)是一种能产生重要次生代谢产物类胡萝卜素的海洋绿藻,为了深入了解栅藻类胡萝卜素代谢途径及关键酶基因,本研究通过Illumina高通量测序平台对栅藻进行转录组测序.利用Trinity软件对转录组数据进行从头组装,共获得37 634个Unigenes,经过与Nt、Nr、Swiss、Prot、KEGG、COG、GO数据库比对,共有23 235个Unigenes获得注释.GO分类中(level 2)注释最多的分别是代谢过程(metabolic process),细胞组分(cell part)和催化活性(catalytic activity),与KEGG数据库比对发现14 123个Unigenes与128条代谢途径相对应.根据组装和注释的转录组结果,鉴定了栅藻中与类胡萝卜素生物合成途径相关的基因,构建了栅藻类胡萝卜素代谢途径,获得的栅藻转录组数据有利于进一步研究类胡萝卜素代谢途径中相关基因的功能及调控.     

链状亚历山大藻铜胺氧化酶基因的克隆和表达分析

本文以链状亚历山大藻为实验材料,克隆了2个铜胺氧化酶基因,分别命名为cad-1和cad-2。对获取的基因序列进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR技术分析了cad-1和cad-2在链状亚历山大藻不同生长时期的表达。结果发现,cad-1开放阅读框全长1 023bp,编码340个氨基酸;cad-2开放阅读框全长1 800bp,编码599个氨基酸,含一个内含子1 065bp。2个基因编码的蛋白与颗石藻和抑食金球藻的铜胺氧化酶有较近的亲缘关系。荧光定量PCR分析结果显示,cad-1和cad-2在对数期和衰亡期分别是下调表达和上调表达。依据铜胺氧化酶的功能和链状亚历山大藻衰亡的相关研究,推测铜胺氧化酶可能通过催化多胺产生过量过氧化氢的方式参与链状亚历山大藻赤潮衰亡的过程。     

基于转录组测序对两种氮素营养条件下多形微眼藻氮代谢途径的解析

探究微藻的氮代谢通路对了解其对不同氮源利用的分子机制具有重要意义。本研究利用Illumina高通量测序技术对两种氮素营养条件下(硝酸氮和尿素)多形微眼藻的转录组进行分析,通过基因功能注释及数字基因表达谱分析,研究了多形微眼藻细胞内氮代谢的调控机制。结果检测出15种参与氮代谢的酶,对应76个编码基因,构建了多形微眼藻的氮代谢通路图。其中10个酶编码基因在两种不同氮素营养条件下存在差异表达,最显著的是谷氨酸合成酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶相关基因。有机氮源(尿素)实验组中,多形微眼藻细胞内的硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶等基因的差异表达明显高于无机氮源(硝酸钠)实验组,表明当环境中的氮源为尿素时,会对多形微眼藻细胞内硝酸盐的转化和利用有一定影响。本研究初步阐述了硝酸盐、尿素的吸收转运对多形微眼藻细胞内氮代谢的影响机制,可为硅藻在不同氮素营养条件下的吸收利用机制及氮代谢响应研究提供依据。     

microRNA介导雨生红球藻在高光胁迫下次级细胞壁形成和虾青素积累的分子机制

雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是天然虾青素的最佳来源,它可以在高光胁迫等不利条件下转变成厚壁细胞并积累大量虾青素。然而,目前从微小RNA (microRNA, miRNA)层面来揭示在高光胁迫下雨生红球藻次级细胞壁形成和虾青素合成的机理研究尚未见报道。对高光处理下三个时间点的雨生红球藻样品进行microRNA测序,共鉴定出342个已知miRNA和283个新miRNA。在这625个miRNA中,其中有206个miRNA的表达量受高光影响,这些差异表达的miRNA的靶基因参与了淀粉与蔗糖代谢、甘露糖与果糖代谢、糖酵解和萜类骨架生物合成等重要代谢通路。结合转录组结果发现,高光胁迫下有6个miRNA调控了3个和次级细胞壁形成相关靶基因的表达,有5个miRNA调控了5个和虾青素生物合成相关靶基因的表达。以上结果揭示了雨生红球藻在高光下miRNA调控次级细胞壁形成和虾青素生物合成的潜在机制,为雨生红球藻虾青素的代谢工程奠定了理论基础。     

链状亚历山大藻组蛋白H3基因克隆与生长过程中的表达分析

链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)是一种典型的产毒赤潮甲藻。甲藻曾被认为没有组蛋白,但近年来在多种甲藻中检测到全部四个核心组蛋白的活跃转录,而目前对甲藻中组蛋白表达模式与具体功能还缺乏深入的研究。本文报道了链状亚历山大藻组蛋白H3变体之一H3.c的全长ORF序列的克隆和分析;分析了链状亚历山大藻生长过程中组蛋白H3在基因和蛋白水平的表达。目前研究发现的链状亚历山大藻H3变体共三个,其中H3.b在N末端序列与其他物种差异最大,为链状亚历山大藻特有的H3变体。对数生长期的组蛋白H3在基因与蛋白水平上均活跃表达,但表达量并不会随着爆发性增长而显著变化,其中H3.b的基因表达在对数末期呈现上调;培养至衰亡期,各H3变体表达均下调,尤其在蛋白水平上呈现明显衰减。结合前期研究,本文认为链状亚历山大藻三个H3均为复制非依赖型(RI)变体,一些变体可响应伴随藻不断生长而逐渐增强的细胞密度等复杂胁迫,推测其参与某些表观遗传修饰,调控生长进程;而衰亡期基于H3的表观遗传调控受到抑制。     

南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L过氧化氢酶的热胁迫响应

为了研究南极冰藻的热胁迫应答机制,本文根据转录组测序得到的冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L过氧化氢酶CiCAT基因分析了其编码蛋白的特征,同时研究了CiCAT基因表达和过氧化氢酶活性在培养温度升高时的响应变化情况。结果表明:CiCAT基因序列全长为2 066 bp,编码492个氨基酸。在过氧化氢酶的系统进化树中,南极冰藻与其他绿藻聚类为一个分支。CiCAT编码的蛋白序列与盐藻和红球藻的过氧化氢酶序列相似性较高,分别为80.5%和78.9%。当南极冰藻处于热胁迫条件下,CiCAT基因的相对表达量和过氧化氢酶活均呈现出先上升后下降的趋势,但在胁迫24 h时CiCAT基因的表达量变化不明显,而实验组的酶活显著高于对照组。在胁迫72 h时,基因表达量和酶活均达到最高值。研究初步表明,与在常温藻类和高等植物中的功能相似,在经受热胁迫的情况下,南极冰藻中的抗氧化酶系统也发挥着重要作用。     

病毒感染海洋球石藻Emiliania huxleyi的转录组分析

海洋球石藻Emiliania huxleyi及其特异性裂解病毒E. huxleyi virus (EhVs)在调节海洋碳、硫循环及全球气候变化中起着重要作用,也是开展真核生物病毒–宿主相互作用研究的良好模型系统之一。为了探究病毒感染条件下E. huxleyi基因表达水平的变化,以海洋球石藻E. huxley–BOF 92及其专一性裂解病毒EhV-99B1为研究对象,利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术,分别对E. huxleyi病毒感染组(Exp)和非感染对照组(Con)6 h和45 h的藻细胞样品进行转录组测序分析。共得到32 909条平均长度为1 153 bp的基因。病毒感染6 h和45 h分别得到2 617和5 229个差异表达基因,其中共差异表达基因465个。随机选取10条差异表达基因,采用qRT-PCR进行实验验证,结果证实转录组分析可靠。GO功能注释和KEGG通路富集,发现大量基因与氧化应激反应、脂类代谢、碳水化合物代谢及信号转导等代谢过程相关,其中变化最显著的是谷胱甘肽代谢途径。从病毒感染球石藻转录组中筛选出部分与氧化应激反应相关的基因,其中9个基因显著上调,11个基因显著下调,表明宿主能够通过体内的氧化应激反应响应病毒胁迫。     

海洋微拟球藻对共培养三角褐指藻的分子生理学响应机制

本研究运用多物种混合转录组测序(msRNA-seq)法分析了对数生长期海洋微拟球藻响应相同细胞数指数末期三角褐指藻共培养的生理机制。两种藻的细胞总数在8 d内基本不变。三角褐指藻转录组结果中存在与生长有关的基因的表达,且难以与响应共培养的生理过程区分。因此,我们只分析微拟球藻响应共培养的转录组变化及其揭示的生理学机制。分析发现在共培养的初始24 h内共有8 235个基因表达,其中,809个为显著差异表达基因,351个下调表达,458个上调表达。这些差异基因被富集到7条KEGG通路中。其中,在DNA复制和同源重组通路上所富集的基因呈下调表达,而在氨基和核苷酸糖代谢通路、Focal adhesion、PI3K-Akt、cAMP、ErbB信号通路上所富集的基因呈上调表达。结果表明海洋微拟球藻响应三角褐指藻共培养时发生了一系列生理学变化。这是应用多物种混合转录组测序分析微藻间互作的初步尝试,建立的方法也适用微藻和其它微生物的互作机制研究。     

雨生红球藻sir基因克隆及在硫代谢中的功能分析

亚硫酸还原酶是硫代谢的关键酶。本文首次从雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中克隆了亚硫酸还原酶基因(sir),发现该sir的DNA序列由3 885个核苷酸组成,包括9个内含子,cDNA序列全长为2 079 bp,编码692个氨基酸,属于NiR/SiR铁氧还蛋白超家族。系统发育分析表明,雨生红球藻中的sir基因与其他淡水绿藻的亲缘关系最近。在0～50 mmol/L Na_2SO_3浓度范围内,sir基因转录水平与Na_2SO_3浓度呈正相关,说明雨生红球藻中sir基因与亚硫酸盐代谢直接相关。对不同硫浓度条件下sir的转录水平分析表明,雨生红球藻sir的转录水平会随培养时间呈周期性变化,0.5 g/L MgSO_4·7H_2O组sir基因的转录水平在前4天明显上调,显著高于其他各组。培养基中不同硫浓度对雨生红球藻生长的影响表明,0.5 g/L MgSO_4·7H_2O组表现出明显的生长优势,在第10天表现出最高的细胞密度。因此,0.5 g/L MgSO_4·7H_2O更适宜作为雨生红球藻培养中的硫酸盐添加量。     

盐藻的一种盐诱导碳酸酐酶基因转录起始点的确定及表达载体的构建

采用5′RACE和巢式PCR的方法确定盐藻(Dunaliella salina)一种盐诱导碳酸酐酶基因的转录起始位点,通过序列分析得出转录起始位点为A,从而确定核心启动子及上游调控区的位置。应用巢式PCR技术分别扩增盐藻这种碳酸酐酶基因上游调控区的2个片段,长度大约分别为0．8和1．2kb,序列经测定无误后分别与带β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因的载体相连接,经酶切鉴定这两种表达载体构建正确。用基因枪法将这两个载体导入盐藻细胞中,经染色检测,GUS基因在转化藻株中得到瞬时表达。     

链状亚历山大藻不同生长状态差异表达microRNA的筛选和验证

从链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)延迟期、对数期2个小RNA文库中选择了2个差异表达的microRNA(osa-miR2876和rgl-miR5139),设计f/2培养下延迟期、对数期和高氮、高磷、高锰对数期5个条件,用qPCR的方法对其表达进行了检测。研究建立了以5.8srRNA为内参基因,以SYBR Green I为荧光染料,用加尾法荧光定量PCR检测microRNA在不同生长状态相对表达的方法。microRNA的表达量在对数期和诱导下对数期均低于延迟期,高锰条件下对数期均为最低,且延迟期的表达量分别是高锰条件表达量的18.63和14.12倍。microRNA负调控靶基因的表达,而osamiR2876和rgl-miR5139在对数期均为下调表达,说明其靶基因参与的细胞生理过程:DNA复制、修复、嘌呤、嘧啶碱基的代谢、RNA聚合酶的代谢等过程呈现激活状态,而上述生理过程的激活均有利于藻细胞增殖。这些结果表明:osamiR2876和rgl-miR5139可能在链状亚历山大藻的快速分裂和增殖中发挥着非常重要的调控作用。本文研究结果为甲藻兼性营养型正确性提供了进一步的证据,同时rgl-miR5139在细胞快速生长阶段的下调表达提示在该阶段下异养营养型可能占优势。本研究说明了microRNA在链状亚历山大藻快速生长过程中可能发挥着重要的调节作用。也为其他物种microRNA的研究和检测提供了快速简便、特异性好的研究方法。     

龙须菜UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆及其表达与琼胶产量的关系

对红藻龙须菜(Gracilarialei maneiformis)UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的表达与不同藻株中藻体琼胶产量之间的相关性进行研究。通过PCR扩增的方法得到了龙须菜UGPase的基因序列。该基因cDNA序列的全长为2 200 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸;龙须菜UGPase基因的氨基酸序列与其它物种的UGPase氨基酸序列相似性较高;该基因是单拷贝的,缺乏内含子;具有特殊的加尾信号。利用荧光实时定量PCR的方法检测UGPase基因相对表达量。结果表明,该基因的表达与琼胶含量存在显著相关性,即在高琼胶组藻株中的表达量显著高于低琼胶组藻株,对琼胶含量高低具有指示作用,显示了在产业化应用中的潜能。     

龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)中两种分支酸代谢酶对温度和水杨酸的响应及其原核表达研究

龙须菜(Gracilariopsislemaneiformis)在我国主要用作鲍饵料和琼胶生产原料,但是南方夏季高温限制了龙须菜的栽培和产业化。抗逆植物激素水杨酸(salicylicacid,SA)与分支酸代谢之间存在着密切的联系。本文以两种分支酸代谢酶——异分支酸合成酶(isochorismate synthase,ICS)和分支酸变位酶(chorismatemutase,CM)为研究对象,分析了23℃(常温)和33℃(高温)条件下添加SA对龙须菜中两种分支酸代谢酶编码基因转录水平的影响。结果表明高温和SA不同程度地刺激了两种分支酸代谢酶转录水平的表达,如在3—12h,SA添加后ics表达量分别提高到常温对照组的2.84—4.76倍和高温对照组的1.25—1.62倍;在24h时,cm表达量分别提高到常温对照组的2.73倍和高温对照组的1.82倍。然后,我们将两种酶的编码基因分别转化到原核表达载体pET28a中,结果得到了多以包涵体形式大量表达的重组ICS和CM蛋白,其最佳诱导条件为0.1mmol/LIPTG在16℃诱导24h,并用镍柱初步纯化了重组蛋白。该研究为阐明温度和外源SA对龙须菜中两种分支酸代谢酶的影响规律,以及为从蛋白水平研究这两种代谢酶提供了资料。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢发育不同时期转录组分析

为发掘罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)卵巢发育过程中的重要功能基因,采用IlluminaHiSeqTM4000高通量测序平台对罗氏沼虾卵巢发育四个时期卵巢组织进行转录组测序。所测序列经质控、组装后比对到NR、String、Swiss-prot、Pfam、GO、KEGG数据库中注释,并进行差异基因聚类分析。结果显示,四个样品共产生221580604个Cleanreads,拼接获得95379个Unigenes。分别对四个样品测序文库进行两两比较,共检测到6605个差异表达基因,其中显著上调基因2410个,显著下调基因4195个。GO功能分类显示,共有6422条unigenes可分为分子功能、细胞组分、生物学过程3大类59分支,差异基因主要涉及糖类转运、氨基酸合成、酶活性、细胞膜组成等。通过KEGG通路注释,共有8423条unigenes被注释,涉及184种代谢途径,有7个代谢通路与卵巢发育相关,差异基因的KEGG富集结果显示,药物代谢细胞色素P450通路、氨基丁酸神经元突触、鞘糖脂生物合成、氮素代谢等通路富集显著。此外,对SSR与SNP分子标记进行了鉴定。研究结果为进一步探索罗氏沼虾卵巢发育机制提供了基础信息。     

三角褐指藻Δ5去饱和酶基因的原核表达

Δ5脂肪酸去饱和酶(Δ5fatty acid desaturase)是合成花生四烯酸(AA)和EPA的关键酶。为了构建三角褐指藻Δ5脂肪酸去饱和酶基因(简称D5)的原核表达重组质粒,并实现在E.coli BL21(DE3)中的表达。本研究根据GenBank中三角褐指藻Δ5脂肪酸去饱和酶基因序列,设计引物,扩增该基因并插入到pET28a中,测序鉴定后,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明pET28a-D5构建成功,IPTG能诱导D5特异性表达。     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因克隆、分析及叶绿体表达载体构建

β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶。根据GenBank中所收录的雨生红球藻BKT的cDNA序列设计特异性引物,以高光照处理的雨生红球藻细胞的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法克隆出了β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)。序列测定结果表明,bkt全长960bp编码320个氨基酸。克隆的bkt序列与GenBank收录的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一个碱基。并对其编码的氨基酸进行了二级结构的预测和疏水性分析。同时将所克隆的bkt构建入衣藻叶绿体表达载体p64Dbkt,为基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。     

玉米素和水杨酸对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生长及虾青素积累的影响

虾青素是一种具有强抗氧化活性的类胡萝卜素,而雨生红球藻是天然虾青素的主要来源。本文以雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为材料,研究了植物激素玉米素和水杨酸对雨生红球藻的生长、虾青素含量及相关基因表达的影响。分别添加5种浓度的玉米素或水杨酸,结果发现0.05mg/L玉米素或25mg/L水杨酸处理5d后雨生红球藻虾青素积累最多。该浓度玉米素或水杨酸可显著提高光胁迫下藻细胞密度,最高分别达到3.4×10~5cell/mL和3.0×10~5cell/mL;同时玉米素与水杨酸组中虾青素含量显著上升,分别为1.7%和1.6%,比对照组分别增加29.2%和25.6%。玉米素缓解了高光逆境条件下光合作用基因——Rubisco大亚基(rbcL)及其活化酶(rca)、碳酸酐酶(ca)的下调表达,但对虾青素合成途径β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)的表达量没有显著影响;而水杨酸则相反,在胁迫后期不能缓解光合作用相关基因的下调表达,但可使bkt基因显著上调,最高可达对照组的2.5倍。本研究首次比较了玉米素和水杨酸对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响,发现玉米素比水杨酸具有更好的促进雨生红球藻中虾青素积累的效果。     

类胡萝卜素合成酶基因及海洋微藻合成类胡萝卜素的研究进展

类胡萝卜素在生物体内起着十分重要的作用,C5化合物异戊烯基焦磷酸IPP及其异构体二甲丙烯焦磷酸DMPP是所有类胡萝卜素合成的前体,过去一直认为异戊烯基焦磷酸IPP是通过传统的甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway)合成的,而新的研究发现在微生物、绿藻及高等植物中还存在着另一条IPP合成途径.该文综述了类胡萝卜素生物合成的主要途径及重要的酶编码基因,并简要介绍了海洋微藻合成类胡萝卜素的研究现状.