龙须菜UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆及其表达与琼胶产量的关系

对红藻龙须菜(Gracilarialei maneiformis)UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的表达与不同藻株中藻体琼胶产量之间的相关性进行研究。通过PCR扩增的方法得到了龙须菜UGPase的基因序列。该基因cDNA序列的全长为2 200 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸;龙须菜UGPase基因的氨基酸序列与其它物种的UGPase氨基酸序列相似性较高;该基因是单拷贝的,缺乏内含子;具有特殊的加尾信号。利用荧光实时定量PCR的方法检测UGPase基因相对表达量。结果表明,该基因的表达与琼胶含量存在显著相关性,即在高琼胶组藻株中的表达量显著高于低琼胶组藻株,对琼胶含量高低具有指示作用,显示了在产业化应用中的潜能。     

南移养殖仿刺参（StichopusjaponicusSelenka）铁蛋白基因的克隆及表达特征分析

采用cDNA文库、RACE、荧光定量PCR和Westernblot技术,克隆了南移养殖仿刺参铁蛋白基因的全长序列,并对其表达特征进行了研究。结果表明,南移养殖仿刺参铁蛋白cDNA全长1222bp,包括187bp的5’UTR;513bp的3’UTR和编码173个氨基酸残基的522bp的开放阅读框。诸如铁结合序列标签和铁调...     

脊尾白虾酚氧化酶原基因克隆及表达分析

利用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)酚氧化酶原(Prophenoloxidase,proPO)基因。该基因cDNA全长3092bp,开放阅读框2013bp,编码671个氨基酸,其预测分子量为74.82kDa。脊尾白虾酚氧化酶原基因推导的氨基酸序列与其他虾类酚氧化酶原氨基酸序列同源性较高(65%—78%),该氨基酸序列具有铜离子结合位点等酚氧化酶原基因所具有的典型特征位点。组织表达分析结果表明,proPO基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高,其次是鳃和肝胰腺组织,在肌肉中几乎不表达。利用荧光定量PCR分析了不同盐度胁迫下脊尾白虾血细胞和鳃组织中的表达变化规律,结果发现在不同盐度胁迫后血淋巴proPO表达量显著高于对照组,盐度胁迫初期鳃组织proPO表达量显著高于对照组。本研究结果表明脊尾白虾酚氧化酶原基因参与了盐度胁迫引起的机体应激反应。     

龙须菜UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆及其表达与琼胶产量的关系

对红藻龙须菜(Gracilaria leimanei formis)UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的表达与不同藻株中藻体琼胶产量之间的相关性进行研究.通过PCR扩增的方法得到了龙须菜UGPase的基因序列.该基因cDNA序列的全长为2 200 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸;龙须菜UGPase基因的氨基酸序列与其它物种的UGPase氨基酸序列相似性较高;该基因是单拷贝的,缺乏内含子;具有特殊的加尾信号.利用荧光实时定量PCR的方法检测UGPase基因相对表达量.结果表明,该基因的表达与琼胶含量存在显著相关性,即在高琼胶组藻株中的表达量显著高于低琼胶组藻株,对琼胶含量高低具有指示作用,显示了在产业化应用中的潜能.     

浙江枝吻纽虫(Dendrorhynchus zhejiangensis) 热休克蛋白70基因克隆与表达特征研究

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了浙江枝吻纽虫热休克蛋白70(DzHSP70)基因全长cDNA序列,并利用荧光定量PCR方法,分析了该基因在重金属胁迫下的表达特征。结果表明,DzHSP70cDNA全长2827bp,包括294bp的5’UTR、628bp的3’UTR和编码634个氨基酸残基的1905bp的开放阅读框。HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等特征元件在DzHSP70中高度保守。重金属离子Fe3+、Pb2+和Cd2+均可上调该基因的表达,其中Pb2+的毒理效应最强。研究结果表明DzHSP70可能参与了机体对于重金属的解毒过程。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)PP2A调节亚基B的基因克隆与表达分析

采用RT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹PP2A调节亚基B(PP2A-B)的cDNA全序列,全长2040bp,开放阅读框(ORF)为1332bp,可编码443个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与其它一些物种具有很高相似性,推测PP2A-B基因具有很高的保守性。经荧光定量PCR检测,PP2A-B基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑、卵巢、鳃中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,PP2A-B基因在卵巢未发育期(I期)表达量最高,此后各期逐渐下降,推测PP2A-B在卵巢中可能以PP2A全酶的形式存在,抑制卵巢发育。     

缢蛏（Sinonovacula constricta）GST和HSP90基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达特征分析

克隆获得缢蛏(Sinonovacula constricta)谷胱甘肽S-转移酶(Sc-GSTσ)和热休克蛋白90(Sc-HSP90)基因的cDNA全长,分析了它们的组织表达差异及其在氨氮胁迫下的表达特征。结果表明,Sc-GSTσ的全长cDNA为1 414 bp,含有639 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码212个氨基酸,Sc-GSTσ氨基酸序列与其他物种的GST氨基酸序列同源性为31.88%～43.40%;而Sc-HSP90的全长cDNA为2 752 bp,ORF为2 181 bp,编码726个氨基酸,其氨基酸序列与其他物种HSP90的氨基酸序列同源性为76.77%～87.05%。荧光定量PCR分析发现,Sc-GSTσ和Sc-HSP90在缢蛏各组织中均有表达,两者均在肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后,Sc-GSTσ和Sc-HSP90 mRNA在肝胰腺中表达均显著上调(p<0.05),表明氨氮胁迫引起机体的应激反应,2个基因可能参与机体解毒或防御过程。但胁迫后期表达量下降推测是机体的防御能力有限,不足以完全保护宿主免受应激诱导的细胞损伤。     

浙江枝吻纽虫（Dendrorhynchus zhejiangensis）凝溶胶蛋白和肌动蛋白基因的克隆与序列分析

利用已构建的浙江枝吻纽虫cDNA文库,通过PCR技术扩增得到gelsolin和actin基因的全长cDNA序列。其中,gelsolin的cDNA全长1947bp,5′-非翻译区62bp,3′-非翻译区778bp,开放阅读框1107bp,编码369个氨基酸;actin的cDNA全长为1830bp,5′-非翻译区167bp...     

泥蚶HDAC1基因cDNA全长、内含子克隆及时空表达特征分析

HDAC1作为HDACs家族中重要成员,可使组蛋白去乙酰化进而调节基因表达,在细胞分化和胚胎早期发育中起重要作用。本文利用SMART RACE技术克隆得到泥蚶HDAC1(Tg-HDAC1)基因的cDNA全长序列,并对其内含子进行扩增及不同组织、不同发育时期的定量表达。结果发现:Tg-HDAC1基因的cDNA序列全长为2275 bp,开放阅读框(ORF)1587 bp,编码528个氨基酸;Tg-HDAC1蛋白序列与斑马鱼、鸡、小鼠等的相似性都在80%以上,表明该蛋白氨基酸序列在物种进化过程中具有保守性;在Tg-HDAC1基因中扩增出13个内含子,均存在于开放阅读框中,且都遵循GT-AG原则;荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果显示,Tg-HDAC1基因在成体血液、内脏团、外套膜、鳃、斧足和闭壳肌6个组织中均有表达,而在足中的表达量最高,且与其余5组织中的表达量有极显著差异(P<0.01),说明它对该组织生长具有重要作用。不同发育时期的表达差异结果表明,Tg-HDAC1基因在担轮幼虫期表达量最高,显著高于其他发育时期(P<0.05)。     

翘嘴鲌(Culter alburnus)TMEM-57基因的克隆、组织表达和单核苷酸多态性分析

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了翘嘴鲌TMEM-57蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为2822bp,其中5′-UTR区93bp,3′-UTR区731bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1998bp,编码665个氨基酸。NJ法系统进化分析将同科或属中TMEM-57基因分成一个分支,表现出种属间的高度保守性。利用荧光定量PCR(qPCR)技术检测了不同组织的表达量,发现在卵巢中表达量最高,其次为心脏和脑。用直接测序法对TMEM-57基因部分区段单核苷酸多态性(SNP)进行了检测,寻找到11个新的SNP位点。     

红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD4和CD4-2基因克隆与诱导表达

应用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD4和CD4-2基因,并分析了它们在健康鱼不同组织的表达分布及免疫刺激物诱导后的表达变化。CD4基因c DNA序列全长2216bp,包含180bp的5′UTR(untranslated regions)、605bp的3′UTR和1431bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码476个氨基酸;红笛鲷CD4-2基因c DNA序列全长为1520bp,包含62bp的5′UTR、525bp的3′UTR和933bp的ORF,编码310个氨基酸。CD4分子由信号肽、4个免疫球蛋白样结构域(D1—D4)构成的胞外区、跨膜区和胞浆区组成,CD4-2分子由信号肽、2个免疫球蛋白样结构域(D1—D2)构成的胞外区、跨膜区和胞浆区组成。荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR,q PCR)分析显示红笛鲷CD4和CD4-2基因在健康鱼的胸腺中表达量最高,其次是中肾、鳃、皮肤、脾、头肾和肠。红笛鲷头肾淋巴细胞体外经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)刺激12h后,CD4和CD4-2表达量显著上调(P0.05)。哈维氏弧菌疫苗免疫24h后鳃、头肾、脾脏和肠的表达量显著上升(P0.05)。研究结果为进一步研究鱼类CD4和CD4-2在抗菌免疫反应中的作用提供了基础资料。     

脊尾白虾蜕皮抑制激素基因全长cDNA的克隆及其对环境胁迫的响应

为研究脊尾白虾蜕皮抑制激素基因(MIH)在环境适应中的作用,本文采用RACE技术从蜕皮间期脊尾白虾眼柄中克隆获得MIH-like基因全长c DNA序列,命名为Ec MIH。该基因全长1218bp,包括360bp的开放阅读框,420bp的5'端非编码区和394bp的3'端非编码区;开放阅读框编码120个氨基酸,包括41个氨基酸组成的信号肽和79个氨基酸组成的成熟肽,预测蛋白分子量为13.71k Da,理论等电点p I为8.02。同源性比较分析发现,脊尾白虾MIH-like基因与日本沼虾和罗氏沼虾同源性最高,分别为87%和86%。荧光定量PCR分析结果表明,脊尾白虾MIH-like基因在眼柄中的表达量最高,在卵巢中的表达量最少,而在肝脏、肌肉、鳃和血细胞中不表达。环境胁迫后该基因具有明显的时序性。p H6.5胁迫后24h和48h,眼柄和腹神经节中MIH-like基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05);4mg/L氨氮浓度组胁迫后12h和24h,眼柄和腹神经节中MIH-like基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05);盐度39胁迫后12h和24h,眼柄和腹神经节中MIH-like基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05)。本研究结果表明脊尾白虾mih基因参与了环境胁迫后的机体应激反应。     

链状亚历山大藻组蛋白H3基因克隆与生长过程中的表达分析

链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)是一种典型的产毒赤潮甲藻。甲藻曾被认为没有组蛋白,但近年来在多种甲藻中检测到全部四个核心组蛋白的活跃转录,而目前对甲藻中组蛋白表达模式与具体功能还缺乏深入的研究。本文报道了链状亚历山大藻组蛋白H3变体之一H3.c的全长ORF序列的克隆和分析;分析了链状亚历山大藻生长过程中组蛋白H3在基因和蛋白水平的表达。目前研究发现的链状亚历山大藻H3变体共三个,其中H3.b在N末端序列与其他物种差异最大,为链状亚历山大藻特有的H3变体。对数生长期的组蛋白H3在基因与蛋白水平上均活跃表达,但表达量并不会随着爆发性增长而显著变化,其中H3.b的基因表达在对数末期呈现上调;培养至衰亡期,各H3变体表达均下调,尤其在蛋白水平上呈现明显衰减。结合前期研究,本文认为链状亚历山大藻三个H3均为复制非依赖型(RI)变体,一些变体可响应伴随藻不断生长而逐渐增强的细胞密度等复杂胁迫,推测其参与某些表观遗传修饰,调控生长进程;而衰亡期基于H3的表观遗传调控受到抑制。     

企鹅珍珠贝Creb2基因的克隆及表达分析

CREB(cAMP response element binding protein)是一种真核生物中广泛存在的调控因子。为了探讨企鹅珍珠贝(Pteria penguin)Creb基因的序列和表达特征,为进一步阐述Creb的生理功能提供科学依据,本研究利用RACE-PCR技术克隆到企鹅珍珠贝一个Creb基因的全长序列,分析其理化性质和进化地位;利用荧光定量PCR分析Creb基因在各组织中的表达特征。结果表明,该企鹅珍珠贝Creb基因的c DNA全长为1484 bp,其中开放阅读框(ORF)为1071 bp,编码356个氨基酸,5′非编码区为218 bp,3′非编码区为195 bp,C端包含一个碱性亮氨酸拉链结构(basic region leucin zipper,b ZIP)。预测其分子质量为39.49 k D,等电点为4.43。序列比对显示该企鹅珍珠贝Creb基因与欧洲平牡蛎(Ostrea edulis)和太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的Creb2同源性(identity)最高,分别为46.3%和46.1%,故命名为pp Creb2;系统进化树分析结果与传统形态学分类结果相吻合。荧光定量PCR分析显示,pp Creb2在企鹅珍珠贝的各个组织中组成性表达,其中在足中表达量最高,鳃中其次。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)蛋白二硫键异构酶基因的分子克隆与表达分析

蛋白二硫键异构酶(PDI)是内质网中的关键酶, 参与蛋白合成过程中二硫键的形成、还原和异构。本文首次从拟穴青蟹(Scylla paramamosain)克隆获得了PDI基因cDNA全长, 该序列长度为2015bp, 开放阅读框为1452bp, 编码483个氨基酸。荧光定量PCR检测发现PDI存在于拟穴青蟹的多个组织中; 在拟穴青蟹卵巢发育过程中, PDI基因的表达量在前4个时期逐渐上升, 到了第5期(成熟期)表达量则下降, 表明PDI参与了卵巢发育的蛋白合成过程。免疫组化表明, 拟穴青蟹卵母细胞存在PDI阳性反应, 进一步为该分子参与卵巢发育提供了形态学证据。     

斑节对虾GPx3a基因的分子克隆及表达分析

谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)是生物体内重要的抗氧化酶,能防止过氧化氢对生物体的氧化应激。该研究利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)GPx3a(PmGPx3a)的全长c DNA序列,进行了相关生物信息学分析。作者利用荧光定量PCR方法研究了PmGPx3a在斑节对虾不同组织的表达情况。探究了PmGPx3a在不同胁迫条件下(盐度、重金属和细菌)的表达情况。结果表明PmGPx3a c DNA全长1135 bp,其中开放阅读框(ORF)长651 bp,预测编码216个氨基酸。PmGPx3a推导的氨基酸序列与其他动物的GPx3a氨基酸序列具有高度一致性。实时定量PCR结果显示,在高低盐胁迫下,PmGPx3a在肝胰腺中相对表达量都为上升的(p0.05)。在铜、锌、铬胁迫中,鳃中的PmGPx3a的相对表达量总体呈现下降趋势,在肝胰腺中呈现上升趋势。在哈维弧菌(Vibrio harveyi)刺激下,PmGPx3a在血淋巴中的相对表达量总体呈现上升趋势,24 h后表达量最大,显著高于对照组2.2倍(P0.05)。以上研究结果表明,PmGPx3a基因参与了斑节对虾对环境胁迫和氧化应激的适应性反应。     

宽体沙鳅(Botia reevesae)β-肌动蛋白基因的cDNA克隆与表达分析

利用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了宽体沙鳅(Botia reevesae)-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1795bp,由长100bp的5非翻译区(untranslated region,UTR)、570bp的3非翻译区和1125bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成,编码375个氨基酸。宽体沙鳅-actin氨基酸序列包含1个糖基化位点、9个N-豆寇酰化位点、3个actin信号位点等主要结构区域。PSI-BLAST比对表明,宽体沙鳅-actin氨基酸与真鲷、罗非鱼、虹鳟等鱼类同源性达99%。NJ法系统进化分析显示宽体沙鳅-actin首先与鲢聚在一起,然后与、尖头等鱼类聚在一起。荧光定量PCR检测-actin基因在宽体沙鳅脑、鳃、心脏、肝、胃等12个组织的表达无显著差异(P<0.05),具有良好的稳定性。     

条斑紫菜丝裂原活化蛋白激酶PyMAPK3基因的克隆及胁迫条件下的功能分析

本研究从条斑紫菜中克隆了一个丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase)基因,命名为PyMAPK3。该基因全长2155bp,开放阅读框(ORF)1401bp,编码466个氨基酸,含有两个内含子。氨基酸序列分析表明,PyMAPK3磷酸化位点的氨基酸基序为TDY,其等电点为7.17,蛋白分子量为51.6KDa,亚细胞定位于叶绿体。荧光定量PCR技术对该基因在不同非生物胁迫条件下的转录差异分析结果显示,极端胁迫条件下基因表达量显著增加。蛋白免疫印迹技术对蛋白在不同胁迫条件下的表达量分析结果显示,在不同的胁迫条件下其翻译水平的表达模式表现出与转录水平的不一致性。本研究为深入了解条斑紫菜在逆境适应机制中MAPK蛋白的作用奠定基础,同时为条斑紫菜抗逆品系的选育提供理论指导。     

脊尾白虾肌球蛋白重链和肌球蛋白轻链基因的克隆与表达分析

肌球蛋白重链和肌球蛋白轻链是粗肌丝的重要组成单位,其表达量的高低影响肌纤维的组成和肌肉生长。为了解析肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MHC)和肌球蛋白轻链(Myosin light chain,MLC)基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)生长发育中的作用,采用RACE技术,克隆了脊尾白虾EcMHC2、EcMLC1全长cDNA序列,采用实时荧光定量PCR方法分析了EcMHC2、EcMLC1在脊尾白虾不同组织、不同幼体发育时期及大小差异个体在不同生长时期的表达特征。研究显示,脊尾白虾EcMHC2基因(GenBank:MG545144)全长5 929bp,开放阅读框5 727bp,编码1 909个氨基酸;脊尾白虾EcMLC1基因(GenBank:MG545145)全长1 506bp,开放阅读框459bp,编码153个氨基酸。脊尾白虾肌球蛋白重链和肌球蛋白轻链在系统进化上与其它十足目甲壳动物的关系较近。脊尾白虾EcMHC2、EcMLC1在各组织中均有表达,但主要在肌肉组织内表达。在脊尾白虾幼体发育的不同时期,EcMHC2、EcMLC1在溞状幼体Ⅱ期的表达量显著高于溞状幼体的其它时期;仔虾第一天,EcMHC2、EcMLC1的表达量显著高于其它时期。在脊尾白虾生长的四个阶段中,大个体组EcMHC2的表达量均显著的高于小个体组;60、80和120日龄时期,大个体组的EcMLC1表达量显著的高于小个体组;在大个体和小个体组中,EcMHC2、EcMLC1在80日龄的表达量最高。脊尾白虾EcMHC2、EcMLC1在大个体组与小个体组的差异表达提示它们在脊尾白虾生长发育过程中发挥重要作用。