褐牙鲆卵黄原蛋白免疫胶体金技术的开发及其在环境雌激素检测中的应用

为快速检测海洋环境雌激素,本研究利用20 nm胶体金颗粒和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus) Vtg单/多克隆抗体开发了夹心法免疫胶体金检测试纸条,并对胶体金标记条件、T线和C线抗体浓度等参数进行了优化,构建了褐牙鲆Vtg的快速检测技术。实验结果表明该胶体金试纸条工作范围为15.7～1 000 ng·mL^-1(R²>0.98),检出限为7.8 ng·mL^-1。本研究制备的胶体金试纸条检出限与目前常用的多种Vtg的ELISA方法相近,但是检测时间仅为15 min,比常规方法节省了约14 h。此外,该试纸条在存放30和90 d后,对Vtg的检测结果并无明显偏差,表现出较好的稳定性和可重复性。最后,通过测定多种常见环境雌激素(双酚A、雌二醇、乙炔雌二醇)暴露对雄性成年褐牙鲆血浆中Vtg的诱导情况,进一步验证了该试纸条在海洋环境雌激素活性检测中的应用。     

大泷六线鱼卵黄原蛋白的纯化鉴定及其ELISA检测方法的建立

海洋环境雌激素污染日益加剧,亟需建立可靠的生物检测技术,鱼类卵黄原蛋白(vitellogenin, Vtg)是国际上推荐的环境雌激素生物标志物。本研究采用凝胶过滤与离子交换层析技术从17β-雌二醇(E_2)肌肉注射后的雄性大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)血浆中纯化获得Vtg。经鉴定大泷六线鱼Vtg是分子量约为340 kDa的糖磷脂蛋白,SDS-PAGE显示其亚基分子量约为170 kDa。利用纯化的Vtg免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗血清,并且Western blot结果证实抗血清对Vtg具有很好的特异性。以纯化的Vtg与兔抗Vtg多克隆抗体建立了检测大泷六线鱼血浆Vtg的间接竞争酶联免疫吸附反应(ELISA)。该检测方法的工作范围为15.62～1 000 ng/mL,组内与组间差异分别为6.85%与6.79%,可用于大泷六线鱼血浆Vtg的准确定量。本研究建立的大泷六线鱼Vtg ELISA具有较高的敏感度、特异性与精确度,为中国海洋环境雌激素的生物监测提供了可靠工具。     

市政污水厂尾水对文蛤卵黄蛋白原的诱导效应研究

本研究目的是检验市政污水厂尾水排放对海洋双壳类动物文蛤的内分泌干扰效应,判断其血浆中卵黄蛋白原(Vtg)水平作为尾水受纳海域雌激素效应生物标志物可行性。将文蛤在不同浓度的尾水-海水混合液(0%、1%、5%、10%、20%、40%)中持续暴露培养20d,定期测定雄性文蛤血浆中Vtg含量,分析暴露期间Vtg水平随尾水体积比(EVR)和培养时间的变化趋势。结果表明,暴露培养10d后,尾水体积比40%的处理组中雄性文蛤的血浆Vtg含量明显上升(P0.05),随着培养时间延长到15和20d,在较低的EVR(10%、20%)下也能监测到尾水对文蛤Vtg的明显诱导,表明污水处理厂尾水中存在一定数量的内分泌活性物质,对雄性文蛤具有显著类雌激素效应;Vtg最大值出现在EVR20%的尾水暴露15d以及EVR40%的尾水暴露20d,分别比对照组增加45.86%和47.40%。如果采用笼养文蛤监测尾水受纳海域的类雌激素效应,适宜的暴露时间为20d,此时采集的雄性文蛤Vtg可指示较大范围尾水的影响。     

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)卵黄蛋白原的纯化、性质鉴定及ELISA检测方法的建立

腹腔注射17β-雌二醇(E2),使瓦氏黄颡鱼雄鱼在7天内产生卵黄蛋白原(Vtg)。采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从E2诱导的雄性瓦氏黄颡鱼血浆中分离、纯化出Vtg,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为Vtg,该Vtg在非变性条件下分子量约为240kDa,在SDS变性条件下分子量约为143kDa。纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg经检测显示可能含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清。用双向免疫扩散法测得抗血清的纯度较高,效价为1︰32;Western blotting检测显示抗血清的特异性较好。以瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清为抗体,以纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测瓦氏黄颡鱼体内Vtg的含量,标准曲线线性部分的线性方程为y=0.099x+0.4529(R2=0.9327),该方法检测的灵敏度为15.6ng/ml,工作范围为31.2—4000ng/ml,在此范围内,标准曲线具有良好的线性。     

斑马鱼卵黄原蛋白的纯化鉴定及其2种ELISA的开发

斑马鱼卵黄原蛋白(Vitellogenin,VTG)是检测环境雌激素活性的重要生物标志物。为了确定最佳的斑马鱼VTG检测方法,本研究利用纯化的斑马鱼VTG及其多克隆抗体同时建立了竞争ELISA与夹心ELISA,并比较了2种方法对VTG的敏感度与精确度。采用凝胶过滤与离子交换层析相结合的方法从17β-雌二醇暴露后的斑马鱼整体匀浆液中纯化获得了2种高分子量的糖磷脂蛋白,SDS变性电泳显示分子量为180与143kDa的两条主带,证实纯化的蛋白为斑马鱼VTG。Western blot结果表明制备的抗血清对斑马鱼VTG具有很高的特异性,利用纯化的VTG及其多克隆抗体建立了定量斑马鱼VTG的竞争ELISA和夹心ELISA。与竞争ELISA相比,夹心ELISA不需要抗原抗体共孵育的过程,操作更加省时、简便,其工作范围为3.9~250ng/mL,检出限约为2.2ng/mL,组内与组间变异系数则分别为2.1~5.7和3.0~7.3,表现出更高的敏感度与精确度,推荐该方法用于环境雌激素活性的检测。     

CPA矩阵—催化动力学光度法同时测定镍和铁混合双组分的分析方法研究

本文根据催化动力学原理和CPA矩阵法成功地建立1种新的能同时测定水体中痕量金属铁(Ⅲ)和镍(Ⅱ)混合双组分的分析方法,并将该方法应用于实际水体中铁(Ⅲ)和镍(Ⅱ)的测定。并确定了同时测定铁(Ⅲ)和镍(Ⅱ)的最佳分析条件是:pH=2.00,t=25.0℃,V(1,10-菲啰啉)=2.00 mL,c(KIO4)=1.2×10-4mol·L-1,c(RAWL)=5.00×10-5mol·L-1,反应时间t=10 min。在确定的最佳分析反应条件下,铁(Ⅲ)的线性范围为0~70.00 ng·mL-1,镍(Ⅱ)的线性范围为0~60.00 ng.mL-1,所建方法的相对标准偏差为0.61%~2.32%。对铁(Ⅲ)和镍(Ⅱ)质量浓度分别在5.00~60.00 ng·mL-1范围内的12组铁镍混合液进行测定,回收率在95.4%~104.4%。对自来水和黄河水水样的测定结果表明:铁(Ⅲ)和镍(Ⅱ)的回收率为95.5%~99.0%。     

深圳大鹏湾和大亚湾近岸海水及潮间带动物的有机锡污染

调查了深圳大鹏湾及大亚湾近岸海水及其潮间带动物有机锡的污染状况.结果显示,大鹏湾海水中三丁基锡(TBT)和二丁基锡(DBT)的含量分别为21.13-25.03和10.22-18.68ng·L-1;大亚湾中海水中TBT和DBT的含量分别为nd(低于检测限)-7.63和nd-8.56ng·L-1,所有水样均未检测出单丁基锡(MDT).大鹏湾潮间带软体动物(近江牡蛎Ostrea rivularis Gould、团聚牡蛎Ostrea glomerata Gould、单齿螺Monodonta labio等)体内TBT、DBT、MDT、三苯基锡(TPT)的含量分别为3.02-26.48、nd-2.65、nd-1.57、13.10-164.08ng·L-1(湿重);大亚湾潮间带软体动物体内TBT、DBT、MDT、TPT的含量分别为nd-17.67、nd-1.50、nd、nd-17.66ng·L-1(湿重).与国内外其他海港水体和软体动物的调查结果相比,大亚湾受有机锡污染的程度相对较轻,但大鹏湾的污染程度则不容忽视.由此可见,我国应尽早制定法规限制有机锡类化合物的应用.     

酚类污染物对金鱼卵黄蛋白原诱导的雌激素效应研究

以雌二醇为阳性对照,通过雄性金鱼卵黄蛋白原的诱导实验研究壬基酚、辛基酚、双酚A和2,4-二氯酚4种酚类污染物的雌激素活性,同时探讨金鱼作为实验生物的敏感性。不同浓度梯度的酚类污染物暴露14d后,以酶联免疫吸附法(ELISA)测定金鱼血浆中的卵黄蛋白原含量,同时测定肝脏指数。结果表明,4种酚类污染物均可诱导金鱼体内卵黄蛋白原的合成并且提高其肝脏指数。雌二醇、壬基酚、辛基酚和双酚A诱导雄性金鱼卵黄蛋白原合成的最低可见效应浓度分别为0.005,15,5,10μg/L,且诱导量随暴露浓度的升高呈明显的剂量-效应关系,可以采用Weibull函数进行非线性拟合,其半效应浓度EC50分别为0.078,255.7,79.6和113.4μg/L。2,4-二氯酚诱导能力较弱,最大诱导量比阳性对照组低4个数量级,4种酚类化合物的雌激素活性强弱顺序为辛基酚双酚A壬基酚2,4-二氯酚。可见金鱼可以作为类雌激素化合物筛选和检测的敏感实验生物。     

Cu2+对序批式反应器中活性污泥胞外聚合物产量及其组分的影响

研究了长期暴露条件下Cu2+对序批式反应器(SBR)性能及其活性污泥胞外聚合物(EPS)特性的影响。结果表明,进水中加入10 mg·L-1的Cu2+后,在SBR运行的第16~55天,COD和NH+4-N的去除率保持稳定;在第56~75天,COD和NH+4-N的平均去除率与进水Cu2+浓度为0 mg·L-1时相比分别下降了3.88%和6.41%。浓度为10 mg·L-1的Cu2+长期作用下,活性污泥中EPS、松散附着EPS(LB-EPS)和紧密附着EPS(TB-EPS)产量及LB-EPS和TB-EPS中蛋白质(PN)含量增加。傅里叶变换红外光谱分析表明10 mg·L-1 Cu2+的长期暴露导致TB-EPS中PN的C=O键、N-H键和C-O键相对含量降低。X射线光电子能谱(XPS)测试结果显示在10 mg·L-1 Cu2+长期暴露条件下,LB-EPS和TB-EPS中元素Cu和O百分含量增加。     

激素诱导花鳗鲡精巢发育成熟期间性激素水平及相关细胞的超显微结构

通过注射人类绒毛膜促性腺激素(HCG)诱导雄性花鳗鲡性腺发育成熟,每7d注射一次(剂量为500U·(体重)kg-1),共注射6次.检测此期间血清中促性腺激素(GtH)和性类固醇激素(T、11-KT、E2)的水平,以及相关细胞超显微结构的变化.结果表明,对照组雄性花鳗鲡性腺发育处于Ⅰ―Ⅱ期,GSI(Gonadosome Index)为0.17±0.06%,血清中GtH、T、11-KT水平较低,并且T浓度低于0.1ng(试剂盒测定范围为0.1―20ng·mL-1);注射第3次后,实验组鱼性腺发育处于Ⅲ期,GSI为7.0±0.03%,血清中GtH、T、11-KT的水平均明显上升;排精后的实验组鱼GSI为9.57±2.1%,GtH、T、11-KT的水平比注射第3次的实验组鱼有所下降,但仍然高于对照组;在整个催熟过程中,血清中E2水平持续降低,从对照组的2.36ng·mL-1下降到排精后的0.83ng·mL-1.超显微结构的观察证明,与对照组相比排精后的实验组鱼脑垂体中GtH细胞的小颗粒减少,内质网池扩大,出现分泌并释放促性腺激素后留下的空泡.对照组鱼肝细胞富含糖原,几乎没有脂肪泡的存在,细胞核位于细胞中间,排精后的实验组鱼肝细胞脂肪泡增多变大,脂肪泡的形成导致细胞核偏位.     

雌二醇、壬基酚和三丁基锡对斑马鱼雌激素响应基因表达的影响

为研究天然雌激素、环境拟雌激素和环境抗雌激素共存条件下的雌激素效应,分别以雌二醇(17β-estradiol, E2)、壬基酚(Nonylphenol, NP)和三丁基锡(Tributyltin, TBT)为代表,采用实时荧光定量PCR和相对定量分析法,测试并分析了3种污染物单独和不同组合联合暴露条件下成年雄性斑马鱼(Danio rerio)肝脏组织中雌激素响应基因vtg1、esr1、esr2a和esr2b mRNA的相对表达情况。结果显示:E2和NP的联合暴露,会显著诱导vtg1和esr1 mRNA的表达,且其相对表达量远高于两者单独暴露时的表达量之和。E2和TBT的联合暴露中,当TBT浓度较高(100 ng/L)而E2浓度较低(10 ng/L)时,TBT能够抑制E2对vtg1和esr1 mRNA表达的诱导作用。NP和TBT的联合暴露,会导致vtg1和esr1 mRNA的相对表达量远小于两者单独暴露时的表达量之和。而在E2、NP和TBT三者共同暴露中,当TBT浓度较高(100 ng/L),且E2和NP浓度较低(E2 10 ng/L, NP 25μg/L)时,TBT能抑制E2和NP对vtg1 mRNA表达的诱导作用。由此可见,不同类型环境雌激素共存条件下的联合效应与各组分的浓度配比有关,本研究结果为探索多种环境雌激素类污染物共存条件下的生物效应和生态风险提供了科学依据。     

单环刺螠中肠和后肠交替氧化酶对硫化物的应激反应

外源性硫化物可通过抑制或阻断线粒体电子传递经典途径而对生物体产生损伤甚至致死,交替氧化酶(Alternative Oxidase,AOX)是线粒体硫化物氧化电子传递分支途径中的1个关键酶。为了研究硫化物环境中单环刺螠的生存对策,本文利用间接竞争性ELISA和酶活性分析等技术检测了单环刺螠在硫化物应激前后中肠和后肠中AOX的蛋白含量以及活性的变化。结果显示:在未处理的单环刺螠中,后肠的AOX蛋白含量和酶活性均高于中肠。当单环刺螠暴露在硫化物(50和150μmol·L-1)环境中时,2个器官的AOX含量和酶活性水平均随着硫化物浓度的提高和暴露时间的延长而提高,并且150μmol·L-1硫化物处理组的单环刺螠2个器官AOX蛋白含量和酶活性普遍高于相同处理时间下的50μmol·L-1组。结合已报道的单环刺螠硫化物应激下细胞色素c氧化酶活性的变化,提出单环刺螠体内存在线粒体电子传递分支途径;提高组织线粒体中AOX活性是其应对环境硫化物毒性的对策之一。     

雄性半滑舌鳎GH基因多态性与激素水平及生长性状相关性分析

以雄性半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究材料,分析了其GH基因外显子区域的多态性,同时分析了各基因型与其体重、体长、激素水平等的关联性。PCR-SSCP和测序结果表明,外显子4有1个突变位点382bp(c.T382C)为非同义突变(p.Phe106Leu)。单因素方差分析显示,382bp位点与体重、去内脏重和血浆T3水平显著相关(P0.05)。通过多重比较,CC基因型体重和去内脏重((234.58±8.11)g和(210.23±7.55)g)显著高于TT基因型((201.64±13.04)g和(180.21±12.13)g);CC基因型(3.01±0.07)ng·mL-1的T3水平极显著高于TT基因型(2.12±0.12)ng·mL-1。结果表明,半滑舌鳎中GH基因的突变可以影响其激素水平和生长性状,382bp位点可以用作分子标记,从遗传学角度辅助半滑舌鳎优良品种的分子选育。     

裙带菜(Undaria pinnatifida)配子体培养条件的优化

以日本三陆地区的裙带菜(Undaria pinnatifida)配子体为实验材料,采用双因素完全交叉分组实验,研究了温度(18℃、21℃、24℃、27℃)、光照强度(50μE·m~(-1)·s~(-1)、80μE·m~(-1)·s~(-1)、110μE·m~(-1)·s~(-1)、140μE·m~(-1)·s~(-1))、培养方式(静置培养、磁力搅拌培养、充气悬浮培养)、接种密度(0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L)对裙带菜配子体生长的影响。结果显示,光强和温度等环境因素以及两者的交互作用对配子体生长有较大影响。21℃、50μE·m~(-1)·s~(-1)的条件组合是实验中配子体培养的最佳条件。在培养的第5d到第10d之间,裙带菜配子体克隆的细胞增长率最大,可在第10d对配子体进行继代培养,使其保持较高的增长率。培养方式和初始接种密度以及两者的交互作用对配子体生长有较大影响,初始接种密度为0.1~0.2g/L的充气培养条件是配子体培养的最佳条件组合。本实验得出,日本三陆裙带菜雌配子体克隆扩培的最适培养条件为:温度21℃、光强50μE·m~(-1)·s~(-1)、接种密度0.1~0.2g/L,充气悬浮培养。     

三角褐指藻对铜离子长期暴露的生理响应

探讨了不同浓度Cu2+长期暴露对三角褐指藻生长、光合作用、呼吸作用和色素含量等生理特性的影响。结果表明:三角褐指藻在较低浓度下(0.25mg·L-1,0.5mg·L-1)生长受到刺激,而在高浓度下(1.5mg·L-1)则下降。叶绿素荧光参数有效光化学效率(Yield)与最大光化学效率(Fv/Fm)对Cu2+非常敏感,它们均随Cu2+的升高而显著下降;Cu2+暴露对光合作用速率也具有抑制作用;而在Cu2+长期暴露下,类胡萝卜素含量比对照组高,但提高的程度随Cu2+浓度升高而下降。这些结果说明,叶绿素荧光参数可以作为三角褐指藻受到Cu2+胁迫的灵敏指标;光合作用与生长并不耦合;类胡萝卜素含量和呼吸作用速率升高可能能够降低Cu2+对三角褐指藻的毒性。     

石油烃暴露对栉孔扇贝(Chlamys farreri)组织生物转化酶及DNA损伤的影响

为探讨海水中石油烃对栉孔扇贝生物转化酶和DNA损伤的影响,将栉孔扇贝分别置于含4个浓度梯度(0.1mg·L-1,0.3mg·L-1,1.0mg·L-1和3.0mg·L-1)石油烃的海水中进行为期30d的暴露实验,取消化盲囊和鳃丝分别测定其7-乙氧基异吩恶唑脱乙基酶(7-Ethoxy-Resorufin-O-Deethylase,EROD)、谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)活性和DNA损伤F值。结果显示,除0.1mg·L-1浓度组各指标变化不明显外,其余各处理组各指标随时间都出现不同程度的变化。消化盲囊和鳃丝EROD活力相对于对照组都明显被激活,消化盲囊EROD活力随时间内一直呈现上升趋势,在第30d达到最大值,而鳃丝EROD活力从3d后趋于稳定;消化盲囊和鳃丝GST酶活性在0.3mg·L-1处理组明显被激活,在其余两个高浓度组呈现先激活,最后显著被抑制的趋势,鳃丝GST酶活性被较早的抑制;消化盲囊和鳃丝DNA损伤F值在各浓度组随时间明显下降,呈现剂量-效应和时间-效应关系,鳃丝下降幅度较为明显。结果表明,扇贝对0.3mg·L-1以下浓度石油烃暴露具有一定的耐受性,可以通过提升自身生物转化酶活性等功能进行解毒,而对于1.0mg·L-1以上浓度的石油烃暴露,机体显示出明显的致毒效应,鳃丝受到损伤程度较消化盲囊明显,三种指标结合在一起研究能够反映机体受石油烃影响解毒和受损伤的过程,是较好的反映海水石油烃污染程度的生物学指标。     

以污泥提取液为生长介质的纤细角毛藻培养与CO2生物固定

污水污泥(MSS)中含有大量的氮磷营养盐,以其替代传统培养基作为微藻的营养来源,将显著降低微藻吸收固定CO2的成本,增强微藻在工业碳减排中的应用潜力。本研究以污水污泥提取液与海水的混合液作为纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)的生长介质,同时通入高浓度(5%～20%)CO2,在优化培养条件的基础上,将微藻接种到螺旋管式光生物反应器中进行动态试验,并逐日测定相应的藻生物量和固碳能力。结果表明,在污泥提取液和海水的混合体系中,纤细角毛藻的最适生长条件为:通入10%CO2气体,污泥提取液和海水按照1∶29比例混合,温度为30℃,光照强度为6 000lx。当保持10%CO2的通入速度为20mL·min-1时,生物反应器的适宜运行条件为:藻接种量1×106cells·mL-1,循环流量1 200mL·h-1。在上述优化条件下,最大藻生物量产率(0.36g·L-1·d-1)和最高固碳速率(0.67g·L-1·d-1)出现在循环培养第5d;此外,培养液中氮、磷营养盐的利用程度较高,NO3--N、NH4+-N、NO2--N、PO43--P的去除率分别达到96.9%、93.3%、78.0%和88.5%。     

珠江口水域化学耗氧量(COD)的分布特征

2002年5月和8 月对珠江口伶仃洋水域水质化学耗氧量(COD)进行了调查研究,结果表明:该水域近期 COD 含量变幅在 0.41 ～ 2.72 mg·L-1 之间,平均值为 1.21 mg·L-1;区域分布呈北部向南部水域逐渐递减以及近岸水域含量大于远岸的变化趋势;夏季 COD 的含量高于春季;以我国Ⅰ类海水水质 COD 含量≤2 mg·L-1 标准评价,超标率为 15 %;COD 含量与同期(春、夏季)的悬浮物含量呈正相关性,与无机氮和活性磷酸盐含量在夏季呈负相关性。     

南黄海中部海水、间隙水和沉积物中多环芳烃的分布及源分析

利用液液萃取、固相微萃取及快速溶剂萃取法对2007年9月南黄海中部海洋环境调查采集的31个调查站位的表层、30 m层、底层海水及表层沉积物样品进行前处理,并采用气相色谱-质谱检测其中的多环芳烃(PAHs).结果显示:站位表层、30 m层和底层海水中总PAHs的质量浓度分别为37.77～233.39 ng·L-1,39.45～213.27 ng·L-1,15.76～202.55 ng·L-1;表层沉积物(干重)总PAHs的质量比为16.33～229.58 ng·g-1,间隙水和上覆水中总PAHs的质量浓度为11.98～386.66 ng·L-1.间隙水的总PAHs普遍高于上覆水的,而沉积物和间隙水中的大于表层、30 m层及底层海水中的.经特征PAHs组分分析判定南黄海中部海水中PAHs的来源主要为石油及其产品,而表层沉积物中PAHs的主要来源可能为高温燃烧后的矿物燃料残余物.     

抗杂交鳢(Channa argus×C. maculate)弹状病毒卵黄抗体制备及ELISA检测方法的建立

为确定杂交鳢(Channa argus×C. maculate)弹状病毒卵黄抗体效价水平消减规律并验证抗体对病毒的中和能力,采用杂交鳢弹状病毒灭活疫苗免疫蛋鸡,使用醋酸-醋酸钠-辛酸法制备卵黄抗体,建立间接ELISA检测方法以监测卵黄抗体产生过程抗体水平消减情况,以中和试验评估卵黄抗体中和杂交鳢弹状病毒效果。结果显示, ELISA检测方法 最佳条件为抗原包被浓度0.5×10^5.8 TCID₅₀/0.1 mL, 37℃包被2 h, 37℃封闭2 h。与大口黑鲈蛙虹彩病毒卵黄抗体、SPF蛋黄提取物、免疫前蛋黄提取物以及MBC空细胞均无交叉反应。以S/N(sample/negative)>2.1且敏感性最高为标准确定阳性、阴性样品。卵黄抗体于首免后28 d产生效价,四免后达到最高水平,效价为1︰25 600,平台期可持续40～60 d,通过中和抗体检测结果证明平台期内抗体中和效价在免疫周期内最高,约为46.3。通过ELISA检测方法对卵黄抗体产生规律进行监测,通过中和检测方法评估卵黄抗体中和病毒效果。高滴度卵黄抗体具有被开发为新型抗杂交鳢弹状...