褐牙鲆卵黄原蛋白免疫胶体金技术的开发及其在环境雌激素检测中的应用

为快速检测海洋环境雌激素,本研究利用20 nm胶体金颗粒和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus) Vtg单/多克隆抗体开发了夹心法免疫胶体金检测试纸条,并对胶体金标记条件、T线和C线抗体浓度等参数进行了优化,构建了褐牙鲆Vtg的快速检测技术。实验结果表明该胶体金试纸条工作范围为15.7～1 000 ng·mL^-1(R²>0.98),检出限为7.8 ng·mL^-1。本研究制备的胶体金试纸条检出限与目前常用的多种Vtg的ELISA方法相近,但是检测时间仅为15 min,比常规方法节省了约14 h。此外,该试纸条在存放30和90 d后,对Vtg的检测结果并无明显偏差,表现出较好的稳定性和可重复性。最后,通过测定多种常见环境雌激素(双酚A、雌二醇、乙炔雌二醇)暴露对雄性成年褐牙鲆血浆中Vtg的诱导情况,进一步验证了该试纸条在海洋环境雌激素活性检测中的应用。     

斑马鱼卵黄原蛋白的纯化鉴定及其2种ELISA的开发

斑马鱼卵黄原蛋白(Vitellogenin,VTG)是检测环境雌激素活性的重要生物标志物。为了确定最佳的斑马鱼VTG检测方法,本研究利用纯化的斑马鱼VTG及其多克隆抗体同时建立了竞争ELISA与夹心ELISA,并比较了2种方法对VTG的敏感度与精确度。采用凝胶过滤与离子交换层析相结合的方法从17β-雌二醇暴露后的斑马鱼整体匀浆液中纯化获得了2种高分子量的糖磷脂蛋白,SDS变性电泳显示分子量为180与143kDa的两条主带,证实纯化的蛋白为斑马鱼VTG。Western blot结果表明制备的抗血清对斑马鱼VTG具有很高的特异性,利用纯化的VTG及其多克隆抗体建立了定量斑马鱼VTG的竞争ELISA和夹心ELISA。与竞争ELISA相比,夹心ELISA不需要抗原抗体共孵育的过程,操作更加省时、简便,其工作范围为3.9~250ng/mL,检出限约为2.2ng/mL,组内与组间变异系数则分别为2.1~5.7和3.0~7.3,表现出更高的敏感度与精确度,推荐该方法用于环境雌激素活性的检测。     

大泷六线鱼卵黄原蛋白的纯化鉴定及其ELISA检测方法的建立

海洋环境雌激素污染日益加剧,亟需建立可靠的生物检测技术,鱼类卵黄原蛋白(vitellogenin, Vtg)是国际上推荐的环境雌激素生物标志物。本研究采用凝胶过滤与离子交换层析技术从17β-雌二醇(E_2)肌肉注射后的雄性大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)血浆中纯化获得Vtg。经鉴定大泷六线鱼Vtg是分子量约为340 kDa的糖磷脂蛋白,SDS-PAGE显示其亚基分子量约为170 kDa。利用纯化的Vtg免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗血清,并且Western blot结果证实抗血清对Vtg具有很好的特异性。以纯化的Vtg与兔抗Vtg多克隆抗体建立了检测大泷六线鱼血浆Vtg的间接竞争酶联免疫吸附反应(ELISA)。该检测方法的工作范围为15.62～1 000 ng/mL,组内与组间差异分别为6.85%与6.79%,可用于大泷六线鱼血浆Vtg的准确定量。本研究建立的大泷六线鱼Vtg ELISA具有较高的敏感度、特异性与精确度,为中国海洋环境雌激素的生物监测提供了可靠工具。     

环境内分泌干扰物诱导鱼类产生卵黄原蛋白的研究进展

目前已经被确认的环境内分泌干扰物达100余种,其中能够诱导鱼类产生卵黄原蛋白(Vitellogenin, VTG)的环境内分泌干扰物包括农药、多氯联苯类化合物、邻苯二甲酸酯类化合物等几大类.由于环境内分泌干扰物结构的复杂性,其诱导机制成为近年研究的热点.本文综述了能够诱导鱼类产生VTG的环境内分泌干扰物的种类、筛选方法及作用机制.     

酚类污染物对金鱼卵黄蛋白原诱导的雌激素效应研究

以雌二醇为阳性对照,通过雄性金鱼卵黄蛋白原的诱导实验研究壬基酚、辛基酚、双酚A和2,4-二氯酚4种酚类污染物的雌激素活性,同时探讨金鱼作为实验生物的敏感性。不同浓度梯度的酚类污染物暴露14d后,以酶联免疫吸附法(ELISA)测定金鱼血浆中的卵黄蛋白原含量,同时测定肝脏指数。结果表明,4种酚类污染物均可诱导金鱼体内卵黄蛋白原的合成并且提高其肝脏指数。雌二醇、壬基酚、辛基酚和双酚A诱导雄性金鱼卵黄蛋白原合成的最低可见效应浓度分别为0.005,15,5,10μg/L,且诱导量随暴露浓度的升高呈明显的剂量-效应关系,可以采用Weibull函数进行非线性拟合,其半效应浓度EC50分别为0.078,255.7,79.6和113.4μg/L。2,4-二氯酚诱导能力较弱,最大诱导量比阳性对照组低4个数量级,4种酚类化合物的雌激素活性强弱顺序为辛基酚双酚A壬基酚2,4-二氯酚。可见金鱼可以作为类雌激素化合物筛选和检测的敏感实验生物。     

对虾病毒IHHNV衣壳蛋白的克隆表达及新型双抗夹心ELISA的高效检测

通过利用分子生物学手段克隆IHHNV衣壳蛋白基因并构建原核表达载体,筛选抗原特性好的多肽免疫兔以制备高效的特异性IHHNV多克隆抗体,最终建立高效的检测对虾IHHNV的新型双抗夹心ELISA方法.实验结果表明该方法成功表达了对虾病毒IHHNV衣壳蛋白基因的抗原多肽,并制备出了高灵敏性的多克隆抗体.将抗原多肽及多克隆抗体用于ELISA的检测,抗体的效价在1∶12 800以上,最低可检测到1 pg的抗原蛋白,表明已成功建立高效的双抗夹心ELISA方法,对于对虾的海水养殖及IHHNV病毒性疾病的防控具有重要的参考价值.     

大菱鲆卵黄原蛋白的分离纯化及Native-PAGE、SDS-PAGE性质鉴定

采用5 mg/kg 17β-雌二醇对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行肌肉注射,一周后尾静脉取血,离心分离获得血浆,经Sephacryl S-300(高分辨)分子筛纯化卵黄原蛋白,对卵黄原蛋白进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳,考马斯亮蓝染色和糖、磷、脂的特征性基团染色.结果表明,17β-雌二醇能诱导大菱鲆产生卵黄原蛋白,以N-ative-PAGE方法计算得到大菱鲆卵黄原蛋白的分子质量为538 ku,以SDS-PAGE方法得出其两种亚基的分子质量分别为100 ku和82 ku.分子筛凝胶过滤能较好地纯化大菱鲆血浆中的卵黄原蛋白.     

日本鳗鲡UNAG蛋白的克隆及其在非结合胆红素检测中的应用

血清中非结合胆红素含量升高与新生儿脑损伤的发展相关,但目前临床上没有方法可以直接测定非结合胆红素的血清水平.从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中成功克隆了其UNAG基因,在原核细胞中成功表达UNAG重组蛋白,并通过Ni~(2+)-NTA进行纯化得到含量为1.8 mg/cm~3的UNAG目的蛋白,银染检测说明其纯度较高.利用该基因可以与非结合胆红素结合并发光的特异性,设计了一种新型的非结合胆红素检测方法,结果表明UNAG发光值与胆红素浓度呈良好的线性关系,回归方程为Y=17.96 X+4.333 3(R=0.994 9).该法可用于胆红素浓度的测定.     

银鲳(Pampus argenteus)胰岛素基因的分子鉴定及其与卵黄原蛋白基因的关联表达

胰岛素(Insulin, Ins)作为动物体内最保守的小分子蛋白,是调控血糖、脂肪和蛋白质代谢的重要激素,同时也对卵生动物的卵黄合成发挥着重要作用,但在鱼类中研究相对较少。为探讨银鲳胰岛素对卵黄合成的影响,从转录组数据中获得了银鲳3个胰岛素insulin(ins)、insulin-like(ins-like)和insulin-2(ins-2)基因全长cDNA序列。序列分析表明,银鲳3个胰岛素基因的氨基酸序列具有胰岛素基因的典型特征,包含NH-2端分泌的信号肽和由B链、C链和A链组成的IIGF。系统进化树分析表明,哺乳类ins单独为一簇,鱼类ins和ins-2成一簇及鱼类ins-like单独成一簇。组织表达特征分析表明,银鲳胰岛素家族3个基因ins、ins-2和ins-like在各个组织中广泛表达,但是不同组织的3个基因表达水平不相同。对不同发育阶段的银鲳肝脏和卵巢组织中3个胰岛素基因和3个卵黄蛋白原(vitellogenin, vtg)基因的表达量进行了分析,结果显示,所有银鲳ins和vtg基因在肝脏和卵巢中的表达趋势一致,从Ⅱ期至Ⅳ期肝脏和卵巢中逐渐升高,并在Ⅳ期达到最高值,从Ⅳ期至...     

ELISA技术在水产养殖病害诊断和海洋生物毒素检测中的应用进展

对ELISA技术原理及在水产养殖细菌性病害、病毒性病害及海洋生物毒素检测中的应用情况作一综述。ELSIA技术基础是抗原抗体特异性反应,样品与酶标记物和抗体在板孔中反应,洗去未结合的酶标记物,加入发色剂进行孵育,结合的酶标记物使发色剂颜色发生变化,最后加入终止液,在合适的波长下测定吸光度值。水产养殖中常见的细菌性病原为弧菌和嗜水气单胞菌,利用已建立的ELISA技术对大黄鱼肝脏中副溶血性弧菌含量进行测定,检出率为70%。嗜水气单胞菌的单克隆抗体技术分析也取得了较大进展,对于分泌抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的细胞株,ELSIA分析可为快速、准确诊断鱼类嗜水气单胞菌提供可靠方法。20世纪90年代末,已有学者利用ELISA技术测定了草鱼出血病病毒(GCHV)的毒力,30 min内即可从未经提纯的毒液中检测出抗原,比较Dot-ELISA和SPA-CoA测定效果,发现灵敏度比SPA-CoA提高了10倍。对于虾类病毒性病原,ELISA测定主要涉及杆状病毒和白斑综合症病毒,其中对中国对虾杆状病毒检测灵敏度可达到60 ng,对同一个池白斑综合症发病率检测,检出率可达61.8%。利用ELSIA技术测定海洋生物毒素要求快速、方便、准确,日本于20世纪90年代初率先研制出检测DSP主要毒素软海绵酸(OA)的ELISA方法,美国和德国使用抗石房蛤毒素(saxtoxins,STX)和抗neo-STX多克隆抗体建立ELISA法测定PSP,可同时检测STX和neo-STX,灵敏度为40μg/(100 g)。虽然利用ELISA技术测定海洋生物毒素已经取得了一定进展,但是在检测过程中容易发生抗体交叉反应、系列标准毒素缺乏等因素仍然限制该方法的深入应用。     

间接ELISA技术在病原性鳗弧菌SMP1快速检测中的应用

以大菱鲆(Scophthalmus maximus)出血症的病原菌——鳗弧菌(Vibrio anguillarum)SMP1为抗原,制备兔抗血清,测定了抗血清的工作浓度和对抗原的特异性,建立了在大菱鲆肝肾组织中检测SMP1的间接ELISA方法。SMP1人工感染大菱鲆,用建立的间接ELISA对大菱鲆肾脏和肝脏进行检测,结果肾脏的阳性检出率为87.7%,肝脏的阳性检出率为90%。该方法的建立有助于快速准确地鉴定由SMP1引起的大菱鲆疾病。     

胸腺素α1间接ELISA测定方法的建立及其在转基因蓝藻中的应用

利用胸腺素α1（Tα1）－小牛血清白蛋白融合蛋白免疫新西兰兔获得的抗体，建立了Tα1间接酶联免疫吸附滴定法（ELISA），以定量检测转Tα1基因聚球藻7942外源基因表达产物胸腺素α1，实验结果表明该方法灵敏度高，专一性强，重复性好，可用于转基因微藻Tα1表达量的定量检测，同时表明Tα1基因能在聚球藻7942中稳定表达。     

原位PCR及其在海洋细菌检测中的应用

原位PCR技术在海洋生物研究中应用较少,尚无规范的方法步骤。将原位PCR技术应用于海洋细菌功能基因检测,通过实践探讨了影响原位PCR的关键因素,指出细胞的固定和消化是影响其成败的关键;探讨了有关的实验条件;并展望了在检测海洋细菌,尤其是对目前尚无合适方法定量检测的典型海洋功能细菌等的检测方面,原位PCR有望发挥重要作用。     

硬骨鱼类雌激素受体及其在生殖调节中的作用研究

在脊椎动物中,雌激素的生理作用是通过雌激素受体(ER)介导的,这种转录因子属于类固醇激素核受体家族成员.从哺乳动物到硬骨鱼类,均存在2种ER类型,即ERα和ERβ.与高等脊椎动物不同的是,由于基因重复等原因,硬骨鱼类ERβ存在异型体结构,称为ERβ1和β2或者ERβ和γ,它们在鱼类胚胎发育和性腺发育过程中表现为不同的组织分布和表达类型.一般认为,雌激素主要调节雌性个体的生理功能.然而,鱼类的精巢也表现明显的雌激素受体活性,说明雌激素也参与调节硬骨鱼类精巢的生理功能.     

雌激素对水生生物的影响及其检测方法研究进展

综述了雌激素对水环境的污染现状及其对水生生物的影响,介绍了目前雌激素的检测方法,详细阐述了气相色谱和液相色谱及其联用技术在雌激素测定方面的最新研究进展,并对雌激素的研究方向进行了展望。     

海水液压传动技术及其在海洋开发中的应用

海水液压传动技术是国际上近年来为适应海洋开发而发展起来的一门新技术,是液压传动技术的一个重要发展方向,由于其抗燃性好,特别是和海洋环境相容、没有环境污染、效率高,而越来越受到人们的重视。本文主要论述海水液压传动技术的突出优越性,并介绍国内外关于海水液压传动技术的研究及在海洋开发中的应用情况,供我国海洋开发工作者参考．     

环境经济损益分析在海洋油气开发工程环评中的应用

在海洋油气开发工程中进行环境经济损益分析,可衡量该项目需要投入的环保投资与经济实效。文章研究了海洋油气开发工程项目环境影响评价的经济损益分析,并加以实例分析,以便更好地为决策部门提供科学依据。     

核酸探针技术及其在海洋浮游植物检测中的应用

在海洋生态系统中,浮游植物是初级生产者,通过其生命活动影响和改变着海水的理化性质;反过来海水环境的污染和破坏也会作用于浮游植物个体、种群和群落.     

光纤光谱仪的研制及其在海水营养要素检测中的应用

基于交叉非对称的czerny-Turner结构, 研制了一种微型光纤光谱仪, 采用光栅分光、线阵CCD探测光, 基于复杂可编程逻辑器件及PC104设计CCD数据采集电路, 采样结果通过PC104总线上传至PC104工控机, 光谱仪及数据采集电路集成为一光谱仪模块, 约为96mm(宽)×104mm(长)×18mm(高), 该模块与PC104工控机之间通过PC104总线以“针”和“孔”形式层叠连接, 在具有体积小、功耗低、采样速度快等优点的同时还具有极好的抗震性, 非常适合于野外恶劣工作环境下的在线使用。将其应用于海水中铁等痕量元素及营养盐在线检测仪, 试验结果良好。     

碱解旋法及其在检测DNA损伤中的应用

碱解旋法（DNA alkaline unwinding assay,DAU)是一种快速，灵敏，简便，廉价的检测DNA单链断裂的方法，目前已应用于检测辐圾化学物质引起的DNA损伤。本文对该实验技术的发展，检测分析方法，基本理论及其在遗传毒理学研究，环境生物监测等方面的应用前景作了简要介绍。