三角褐指藻Δ5去饱和酶基因的原核表达

Δ5脂肪酸去饱和酶(Δ5fatty acid desaturase)是合成花生四烯酸(AA)和EPA的关键酶。为了构建三角褐指藻Δ5脂肪酸去饱和酶基因(简称D5)的原核表达重组质粒,并实现在E.coli BL21(DE3)中的表达。本研究根据GenBank中三角褐指藻Δ5脂肪酸去饱和酶基因序列,设计引物,扩增该基因并插入到pET28a中,测序鉴定后,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明pET28a-D5构建成功,IPTG能诱导D5特异性表达。     

微藻脂肪酸去饱和酶及其基因表达的生态调控研究新进展

多不饱和脂肪酸 (ＰＵＦＡｓ)是指十六碳以上、含有两个以上双键的脂肪酸 ,有ｎ ６和ｎ ３两个系列 ,其中ｎ ６系列的γ 亚麻酸 (ＧＬＡ)、花生四烯酸 (ＡＡ)和ｎ ３系列的二十碳五烯酸 (ＥＰＡ)、二十二碳六烯酸 (ＤＨＡ)都是人体必需的脂肪酸 ,在营养强化、预防和治疗人类多种疾病方面具有重要作用 ,如预防动脉粥样硬化和心血管疾病、降低血浆中胆固醇和甘油三酯水平、减轻关节炎等炎症 ,还可能成为抗肿瘤的药物［１］。目前 ,海洋鱼油仍是ＰＵＦＡｓ的主要商业来源 ,但海鱼是通过食物链从海洋微藻中获得的 ,微藻才是自然界中ＰＵＦＡｓ的…     

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii)脂肪酸去饱和酶FAD2和延伸酶ELOVL5的克隆及表达分析

脂肪酸去饱和酶(FAD,fatty acyl desaturase)及延伸酶(ELOVL,elongases of very long chain fatty acids)在鱼类脂肪代谢过程中发挥了重要作用。利用RT-PCR克隆得到瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii)肝脏中控制高不饱和脂肪酸合成的(FAD2)和(ELOVL5)基因cDNA序列。瓦氏黄颡鱼FAD2cDNA片段长2041bp,编码447个氨基酸,含有3个组氨酸簇(HDx GH,Hxx HH,Qxx HH),含亚铁血红素结合基序(HPGG)的类似细胞色素b5结构域等。瓦氏黄颡鱼ELOVL5 cDNA片段长1065bp,编码294个氨基酸,含有组氨酸簇(Hxx HH)、内质网停留信号(K、R)和4个ELO共有的保守区域(Kxx Exx DT,Qxx FLHx YHH,Nxxx Hxx MYx YY,Txx Qxx Q)等结构域。荧光定量PCR分析表明,FAD2和ELOVL5 m RNA在瓦氏黄颡鱼脑、肝脏的表达量最高,显著高于肠道、脾脏、肾脏、鳃等组织。结果表明,瓦氏黄颡鱼具有合成高不饱和脂肪酸的关键酶FAD2和ELOVL5,且肝脏为合成高不饱和脂肪酸的主要场所。     

鳜鱼(Siniperca chuatsi)脂肪酸去饱和酶和延长酶基因全长cDNA序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肝脏中控制高不饱和脂肪酸合成的脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)和脂肪酸延长酶(fatty acid elongase,ELO)基因的全长cDNA序列。FAD基因的全长cDNA序列1882bp,编码445个氨基酸,该蛋白序列含有FAD全部的特征结构区,包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素b5结构域,与其它鱼类FAD氨基酸序列的同源性为66.5%-90.1%,系统树分析显示其与欧洲鲈鱼和金头鲷等海水鱼类的亲缘关系最近。获得的ELO基因全长cDNA序列1401bp,编码294个氨基酸,该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构,与其它几种鱼类ELO氨基酸序列的同源性为71.8%-86.7%,系统进化分析显示其与南方蓝鳍金枪鱼和金头鲷的亲缘关系较近。鳜鱼FAD和ELO基因全长cDNA序列的获得可为进一步研究其HUFA合成能力及调控机理奠定基础。     

α2,8-唾液酸转移酶Ⅵ过量表达影响小鼠乳腺癌细胞基因表达的研究

研究α2,8-唾液酸转移酶VI(Sixth type of α2,8-sialyltransferase, ST8Sia VI) 对乳腺癌细胞生物学功能的影响及其作用的分子机制.采用全基因组芯片技术检测ST8Sia VI过表达前后小鼠乳腺癌细胞4T1基因表达谱的差异;利用PathwayExplorer分析ST8Sia VI过表达前后对基因网络的影响.实验结果表明:ST8Sia VI过表达引起201个基因表达有差异,其中22个基因与肿瘤细胞的黏附、生长、运动、免疫和周期有关.另外,PathwayExplorer分析结果显示,差异表达基因涉及的最显著变化的基因网络是"依赖β-arrestin 的G蛋白偶联受体(GPCR)信号通路";进一步的实验结果证明该通路下游Raf蛋白的磷酸化水平在ST8Sia VI过表达细胞显著升高.上述结果为ST8Sia VI生物学功能的深入研究提供了前提.     

海藻酸钠凝胶(C_6H_7NaO_6)_x交联Ca~(2+)包埋风味酶的工艺优化及应用稳定性研究

以海藻酸钠为载体,Ca2+为交联剂,对风味酶进行固定化。以固定化酶活力回收率为指标,在单因素试验基础上,通过响应面分析方法优化了固定化风味酶的工艺,并考察了固定化风味酶使用的稳定性。通过对回归模型进行分析,确定最佳的固定化工艺参数为海藻酸钠浓度2.43%,加酶量(酶液体积/海藻酸钠体积)1:1.76,固定化时间2.89 h,此时固定化酶的活力回收率可达81.88%,考虑到实际操作时对参数精度的控制水平,将固定化酶的优化工艺确定为海藻酸钠浓度2.50%,加酶量(酶液体积/海藻酸钠体积)1:2,固定化时间3.00 h,固定化酶的活力回收率达到80.05%±1.33%。优化工艺下制得的固定化风味酶最适使用温度为60?C,热敏感性降低,稳定性提高;最适p H 8.0,比游离酶向碱偏移了1.0,酸碱适用范围增大;可多次使用,冷藏条件下储藏3周后活力依然保持在80%以上。     

基于孔压监测的强夯置换和砂井-强夯处理饱和软土地基试验研究

在青岛某饱和软土场区采用强夯置换和砂井-强夯2种不同方案进行试夯试验。在试验区距夯点不同距离、不同深度的土层中埋设孔隙水压力计,通过观测,分析试夯过程中超孔隙水压力的变化规律,得出以下结论:2 000~2 500kN·m夯击能作用下,点夯试验最佳夯击数为强夯置换14击、砂井强夯16击,且2种方案强夯有效加固深度均可达6m;强夯置换区块距离夯点越近,超孔隙水压力累积幅值越大,而砂井-强夯区块这一趋势则不明显;砂井-强夯区块较强夯置换区快地基具有更好的均匀性,但其夯后超孔隙水压力消散速度比后者慢;孔压监测是确定强夯参数,了解加固深度,评价加固效果的有效手段。     

用β-琼胶酶和NMR光谱法研究多管藻多糖的寡糖结构

于１９９０年３月用β－琼胶酶对多管藻的冷水提取多糖进行酶解，酶解液通过ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５和Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ６色谱柱分离，分离出２个带电荷的寡糖Ａ－Ｉ和Ａ－ＩＩ。经＾１Ｈ－ＮＭＲ和＾１３Ｃ－ＮＭＲ光谱法分析，确定结构式分别为６＾１，２＾２－二－Ｏ－甲基－６＾３－硫酸基－新琼四糖和６＾１，２＾２－二－Ｏ－甲基－６＾３，６＾５－二硫酸基－新琼六糖，证明它们构成多管藻多糖分子的单位组分。     

海洋细菌QY202产κ-卡拉胶酶的分离纯化和性质研究

为获得高效降解卡拉胶菌株,从青岛太平角海域采集的角叉菜表面分离到1株高产κ-卡拉胶酶的海洋交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)QY202,经硫酸铵沉淀、脱盐、DEAE阴离子交换层析等步骤从该菌株发酵液上清中分离纯化得到1种专一性降解κ-卡拉胶的κ-卡拉胶酶,并研究了该酶的基本酶学性质.结果表明该酶被纯化了23.1倍,回收率为43.9%,分子量大小为33.2 kDa.酶的最适反应温度为40 ℃,最适反应pH为8.0,在0～40 ℃,pH=7.0～8.0之间酶活力较稳定.酶对底物κ-卡拉胶的米氏常数Km值为1.6 mg/mL.Na~+、K~+对酶活有促进作用,而Hg~(2+)、Cu~(2+)强烈抑制酶的活性.酶解κ-卡拉胶的主产物为硫酸新κ-卡拉二糖和硫酸新κ-卡拉四糖.     

3-溴-2-(2′,3′-二溴-4′,5′-二甲氧基苯甲基)-4,5-二甲氧基苯甲酸甲酯的合成及其PTP1B 酶抑制活性研究

为了研究海洋溴系列化合物的生物活性,以香兰素(1)为起始原料,经过溴代、还原、氧化、傅克酰基化及酯化等反应,成功的合成了新化合物3-溴-2-(2′,3′-二溴-4′,5′-二甲氧基苯甲基)-4,5-二甲氧基苯甲酸甲酯(9),总收率为19.6%。通过1H-NMR,13C-NMR等方法对目标产物进行了结构表征。通过比色法对目标化合物进行了PTP1B酶抑制活性测定,结果显示化合物浓度为20 mg/L时,PTP1B酶抑制率为55.84%,表明该化合物有一定的PTP1B酶抑制活性。     

超嗜热古菌耐热酸性α-淀粉酶的发酵条件和酶学性质研究

对一株分离自深海热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp.HJ21)菌株进行了α-淀粉酶发酵条件的优化和酶学性质的研究.该菌株发酵9h后到达产酶高峰,产酶温度范围为60-90℃,其最适产酶温度为80℃.产酶pH范围为5.0-9.0,最适产酶pH为7.5.产酶NaCl浓度范围为0.5-4.0%,2.5%为最适宜NaCI浓度.糖原、淀粉、麦芽糖、酵母膏和蛋白胨促进产酶.该菌株产生的α-淀粉酶的分子量为51.4 kDa,酶的最适作用温度为95℃,在100℃仍有60%的酶活力.酶在90℃的半衰期为5 h,在100℃ 2 h仍有40%的残余酶活,酶的热稳定性不依赖Ca2+.酶的最适作用pH为5.0,pH 4.5仍有80%的酶活力,pH在5.5-7.0较稳定(80℃ 4 h).金属离子1 mmol/L的Mg2+、Co2+、Sr2+、Ba2+、K+、Na+对酶有激活作用,Cu2+、Pb2+、Hg2+、zn2+、Al3+对该酶均有抑制作用.     

斑马鱼体细胞核移植-头肾细胞和尾鳍细胞核移入成熟具核卵子发育能力的初步研究

将经直接消化的斑马鱼头肾细胞或经短暂培养的尾鳍细胞核移植到同种成熟具核卵子中 ,移核卵可发育到原肠晚期 ;将移核卵发育成的囊胚细胞核作供体进行第 2次核移植 ,受体卵可发育到尾芽期或肌肉感应期。流式细胞仪测定 DNA含量表明 ,受体卵发育形成的囊胚细胞 DNA含量与正常囊胚细胞 DNA含量相同 ,由此可知 ,移核卵中的雌原核没有参与移核胚胎的发育。     

基于网络药理学和分子对接技术研究黄芪-白花蛇舌草治疗非小细胞肺癌的作用机制

目的：通过网络药理学和分子对接技术,探讨黄芪-白花蛇舌草抗非小细胞肺癌（NSCLC）的潜在活性成分和作用机制。方法：利用TCMSP和Uniprot数据库获取黄芪-白花蛇舌草的主要活性成分及靶点基因;GeneCards、OMIM数据库获取NSCLC靶点基因;绘制韦恩图得到疾病和活性成分共同靶点;STRING数据库构建中药成分靶蛋白-疾病靶蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;Cytoscape 3.9.1软件绘制成分-靶点网络图,通过网络拓扑分析筛选出关键靶点及成分;DAVID数据库及Bioinformatics平台进行基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析;PyMol软件和AotoDock软件绘制相应的分子对接图。结果：经筛选共得到653个黄芪-白花蛇舌草活性成分靶点和6178个疾病靶点,两者交集靶点154个。GO功能富集到747个生物过程、83个分子功能和150个细胞组分,KEGG通路富集分析得到167条信号通路。分子对接结果显示,PTGS1蛋白与活性成分槲皮素、山柰酚、芒柄花黄素均结合稳定。结论：黄芪-白花蛇舌草可能通过槲皮素、山柰酚、芒柄花黄素等成分,PTGS1、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、白细胞介素-6（IL-6）等靶点,丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶 B（PI3K-Akt）等信号通路治疗NSCLC,初步预测了黄芪-白花蛇舌草对NSCLC的作用机制,为深入揭示其治疗NSCLC的分子机制提供了理论基础。