南移养殖的刺参(Apostichopus japonicus)cDNA文库的构建及原肌球蛋白基因的研究

以南移养殖的刺参为实验材料,采用非均一化的Oliga-dT引物定向克隆技术构建了南移刺参混合组织的cDNA文库。对文库质量的分析结果表明,cDNA文库的库容量为2.2×107cfu,重组率达95.8%,平均插入片段长度750bp左右。挑取cDNA克隆进行5’端测序,成功测序185个反应,分析得到136个单基因簇(Unigene),其中包括40个重叠群(Contigs)、96个单拷贝EST(Singletons)。结果表明,克隆南移养殖的刺参原肌球蛋白(tropomyosin,Trp)cDNA全长序列为1112bp,ORF编码284个氨基酸,其预测蛋白的分子量为33.27kDa,等电点为4.56。该氨基酸序列与紫石海胆、南极大磷虾、锯缘青蟹、文昌鱼、河蟹、家蚕同源性分别为62%、51%、46%、49%、47%、46%。     

刺参肌肉组织cDNA文库的构建

用RNA提取试剂--TRIZOL Reagent提取刺参(Apostichopus japonicus)肌肉组织总RNA,用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库.经测定原始文库滴度达到 3.2×10~6,扩增后文库滴度达到 5.1×10~9,重组率达到96.7%,从扩增文库随机挑取12 个克隆进行PCR 扩增鉴定,结果显示,插入片段大小为0.5～2.5 kb.通过各项指标验证成功构建了刺参肌肉组织cDNA 文库.     

刺参(Apostichopus japonicus)幼参对高温和低盐协同胁迫的生理响应:生长和诱导型热休克蛋白基因表达

全球气候变化背景下的极端高温和强降雨频发天气导致的养殖池塘持续性的高温和低盐环境给刺参池塘养殖带来了严峻的挑战。为了研究刺参对高温和低盐环境的生理响应,本实验分析了高温和低盐协同胁迫对刺参幼参生长及诱导型hsp70和hsp90基因表达的影响。实验设置4个温度梯度（16℃、20℃、24℃和28℃）和3个盐度梯度（22、27和32）,共12个不同的胁迫组。经过40 d的长期胁迫,研究发现,随着温度的升高和盐度的降低,幼参的体重增加量减少,并在高温、低盐组出现体重负增长。长期胁迫提高了刺参幼参的诱导型hsp70和hsp90基因表达量,从而在一定程度上增强了对极端天气的抵抗能力。同时,高温下盐度22处理组刺参幼参诱导型hsp70和hsp90基因的表达量较盐度27条件下低。双因子方差分析结果显示,高温和低盐对幼参特定生长率和诱导型hsp70和hsp90基因表达量的交互作用均不显著,并且盐度对诱导型hsp70和hsp90基因表达量没有显著的影响。因此,相较低盐,高温对刺参幼参的影响更大,可作为刺参育种的选择压力。在高温期应该采取有效措施降低海水温度,并防止极端天气造成的养殖水体温度分层。该研究丰富了刺参生理生态学理论,可为刺参良种选育工作提供思路,并为指导极端天气下刺参生产实践活动提供一定的理论依据。     

低盐胁迫下凡纳滨对虾鳃丝抑制性消减杂交cDNA文库构建及差异ESTs分析

本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为对象,分别以低盐度胁迫下(4 ppt)凡纳滨对虾鳃丝cDNA为检测子,正常海水中凡纳滨对虾鳃丝cDNA为驱动予,采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建了急性低盐胁迫诱导下凡纳滨对虾鳃丝消减cDNA文库。文库的重组率均高于95%,插入片段集中在250~750 bp之间,随机测序后在线拼接得到15组片段重叠群和37个单一序列共52个非重复序列。同源检索发现30个非重复序列与GenBank中的已知基因序列有较高的相似性。按差异表达基因编码的蛋白具体功能可分为6小类,依次为:(1)离子通道及转运蛋白;(2)蛋白合成翻译及转录因子;(3)应激抗氧化因子;(4)能量代谢;(5)信号受体和转导;(6)细胞纤维及骨架蛋白,所占比例分别为23.3%、20.0%、20.0%、16.7%、10.0%和10.0%。经功能聚类分析发现文库中含有大量离子通道蛋白及功能转运酶、胞内信号传导分子、细胞骨架蛋白等渗透调节和应激适应性相关基因,表明急性低盐胁迫诱导凡纳滨鳃丝抑制性消减杂交cDNA文库构建成功。     

龙须菜四分孢子体cDNA文库的构建

为了研究不同世代和性别基因表达谱的差异 ,本文构建了龙须菜 (Gracilarialemaneiformis)四分孢子体的 c DNA文库。总 RNA提取使用 RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen) ,c DNA文库构建使用 SMART c DNA Library Construction Kit(Clontech) ,包装蛋白购自 Promega公司。该c DNA文库含有 1 .2 8× 1 0 6个克隆 ,扩增文库的滴度是 1 .98× 1 0 9pfu/ m L,重组频率是 85.0 % ,插入片段几乎全部集中在 50 0～ 1 50 0 bp之间     

中国对虾6种组织cDNA文库的构建

以中国对虾血液、眼柄、卵巢、雌虾头胸部、雄虾头胸部和三倍体对虾头胸部组织为材料,采用异硫氰酸胍-酸酚法提取总RNA;用磁珠法纯化mRNA;用Uni ZAP cDNA合成试剂盒合成双链cDNA并进行修饰,将cDNA定向连接在UniZAP载体上;经Gigapack Gold Package包装试剂盒包装成为噬菌体颗粒,转染宿主XL1 Blue MRF’菌株细胞,形成初级文库.初级文库经转染进一步扩增,形成稳定的cDNA文库.6个文库的库容在0.2×106~1.3×106之间,重组率都超过90%.从各文库随机取出6~10个清晰的噬菌斑进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测,其插入片段长度为500~2500bp.由初步功能基因克隆获得阳性结果.多项指标表明,所构建的对虾cDNA文库质量较高,为进一步筛选目的基因、EST测序和制作基因芯片提供了有效的工具.     

大叶藻全长cDNA文库的构建

以3种不同盐度处理的大叶藻为材料,采用RNA转录本5’末端转换机制(SMART)构建了大叶藻叶片全长cDNA文库,原始文库滴度为8.675×106pfu/mL,重组率为97.19%,插入片段平均长度大于800bp,扩增后的文库滴度达到1.03×109pfu/mL。将部分原始λ噬菌体cDNA文库转化成质粒cDNA文库,PCR检测结果显示文库插入片段集中在750～2000bp之间。随机选取20个单克隆进行测序,其中13条序列包含完整的开放阅读框。结果表明所构建文库容量大,全长比例高,为深入开展大叶藻功能基因研究奠定了基础。     

刺参(Apostichopus japonicus)EST序列中微卫星分布分析及其标记的筛选

利用微卫星查找软件对现已公布的6632条刺参ESTs的数据库中2—6个碱基重复单元组成的简单序列重复进行筛选,进而对其微卫星的丰度和分布进行比较研究。共发现微卫星序列416个,占整个ESTs数据库的6.48%;其中含双碱基重复序列146个,数量最多,占ESTs数据库中发现微卫星序列总数的65.86%;三、四、五、六碱基重复序列分别占微卫星序列总数的26.68%、1.68%、0.24%、5.53%。对含有SSR位点符合微卫星引物设计的EST序列利用Primer软件结合人工方法设计合成引物21对,其中13对有扩增产物且均为多态位点。扩增产物变性聚丙烯酰胺胶电泳,统计每个微卫星标记等位基因数目,计算等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度等统计学指标的评价。结果表明,在13个微卫星位点上,等位基因的数目从3到8不等,等位基因长度从175—382bp,观测杂合度和期望杂合度分别为0.158—0.650和0.198—0.841,所筛选微卫星标记可于遗传分析。     

仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道菌群的地域性差异与共性研究

作为高附加值水产养殖物种,仿刺参(Apostichopusjaponicus)的病害和病原微生物研究受到人们关注,但对其共生菌群组成、地域性差异及与水体环境间交流等方面的研究仍十分有限。本研究收集了来自中国、日本和韩国共786例仿刺参肠道、水体和沉积物的16SrRNA基因高通量测序数据,比较细菌群落组成以探寻仿刺参肠道微生物与环境和地域之间的关系。分析结果显示,尽管仿刺参肠道、水体和沉积物中各细菌组分的比例不同,但共有菌属甚多,表明仿刺参可以从外界环境大量获取微生物。与水体和沉积物的样本类型相比,仿刺参肠道微生物多样性最低且所含菌属的种类最少,进一步提示仿刺参肠道对外界来源的微生物进行了富集和筛选,其中变形细菌门(Proteobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和利斯顿氏菌属(Listonella)的富集尤为明显。中国、日本和韩国来源的仿刺参肠道微生物Alpha多样性无显著差异,但主坐标分析将它们聚为不同的簇,且各自拥有独特的细菌门类。比较中国渤海和黄海两个海区的仿刺参肠道菌群获得了相似的结果,体现出广泛的地域性差异。基于细菌分类的功能预测发现三个国家仿刺参肠道微生物均具有发酵、化能异养和需氧化能异养功能,表明共生菌群在功能上存在共性,并可能对宿主生理产生相同的作用。本研究揭示了仿刺参肠道微生物在不同地域之间存在明显差异,并且与水体环境之间存在着密切的联系,能够为仿刺参共生微生物及其与宿主健康的相关性研究提供基础性资料,并可能在自然循环过程和渔业资源保护过程中发挥作用。     

刺参(Apostichopus japonicus)高温胁迫应答基因应激表达特性的分析

采用实时荧光定量PCR技术对刺参高温胁迫抑制性消减cDNA文库中2个上调表达差异基因hsp70和l(2)efl,2个下调表达差异基因pcsk9和myp,在不同温度、不同胁迫时间以及不同组织中的应激表达特性进行了分析.在15-30℃范围内,温度越高hsp70和l(2)efl基因相对表达量越多;而pcsk9、myp基因随着温度升高其表达量下降.在30℃高温胁迫0-3h时间内,hsp70表达量的变化最为显著,表现为先升后降再升;l(2)efl在1h后开始明显的上调表达,在2.5h之后呈下降趋势;pcsk9和myp基因表现为表达下调,表达量最小值分别在3h和2h.常温下hsp70、l(2)efl和pcsk9均在体壁中的表达量最高,在呼吸树中表达量最少,myp在消化道中表达量最高,在纵肌中表达量最少;高温胁迫后hsp70、l(2)efl均在呼吸树中上调表达量变化最显著;pcsk9和myP分别在呼吸树和纵肌中下调表达量变化最显著.这4种基因通过表达产物量的变化或作为功能蛋白直接参与代谢调节,或作为调节蛋白调控胁迫功能蛋白的表达及活性来提高刺参对高温胁迫的耐受能力.     

基于FT-IR、GC及核磁共振的仿刺参(Apostichopus japonicus)消化道多糖结构解析研究

仿刺参(Apostichopusjaponicus)因其高营养价值并富含多种生物活性成分,具有重要的经济价值。为了充分利用仿刺参加工下脚料,提高养殖经济效益,本文采用复合蛋白酶解法提取仿刺参消化道多糖,研究了酶解温度、时间、pH及加酶量对仿刺参消化道多糖得率的影响,并通过正交实验对仿刺参消化道多糖提取工艺进行优化,利用DEAE-sepharoseFastFlow层析柱对多糖进行纯化,通过傅里叶红外光谱(FT-IR)、气相色谱(GC)及核磁共振(13C, 1H谱)对多糖的结构及组成进行分析。结果表明,复合蛋白酶在pH 7,加酶量1.2?104 U/g,温度60℃酶解6h;利用Sevage法脱蛋白提取得到的仿刺参消化道多糖纯度均一,效果最佳。通过FT-IR结果判断其为糖类化合物,含有β型葡萄毗喃糖苷键;利用气相色谱确定该多糖主要由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖六种单糖组成,其摩尔比为1︰32.86︰14.56︰1.66︰0.78︰10.43,其中岩藻糖的含量最高;核磁共振综合分析结果进一步证实仿刺参消化道多糖含有β型毗喃已糖,且主要是以l, 4-糖苷键相连接。     

镉诱导隆线溞(Daphnia carinata)生殖转化基因差减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性差减杂交方法进行了镉诱导下隆线溞生殖转化基因的抑制性差减cDNA文库的构建研究。结果显示,其差异表达基因被富集了210倍左右,PCR鉴定发现95%的克隆均含有200—800bp的插入片段;测序获得的252个有效EST中,与细胞分裂相关的有4个,与细胞结构和功能相关的有52个,与细胞代谢相关的有34个,与信号传导相关的有16个,与细胞防御相关的有10个,与基因和蛋白质表达相关的有76个,未知功能的EST有22个,在GenBank中找不到任何同源序列的EST有38个。结果表明,构建的差异表达cDNA文库具有很强的差减效率,可较好地反映镉诱导下隆线溞差异表达的生殖转化基因信息。     

温度和盐度对紫刺参(Apostichopus japonicus Selenta)稚参存活、生长和着色的影响

采用实验生态学方法,以紫刺参为研究对象,分别研究了6个温度条件下(14oC,18oC,22oC,26oC,30oC,34oC)和5个盐度条件下(23,27,31,35,39)紫刺参稚参和对照组普通刺参稚参的存活、生长及体色变化情况。结果表明:水温22oC实验组紫刺参在不同水温实验中的成活率最高,为87.0%,水温18oC和34oC时的紫刺参成活率高于普通刺参;水温高于22oC实验组的紫刺参体长增长显著高于普通刺参,以水温为14oC实验组的紫刺参SGR最低,为4.63%/d。盐度31实验组紫刺参在不同盐度实验中的成活率最高,为86.3%;紫刺参与普通刺参SGR随盐度的升高均呈现先上升后下降的趋势,在盐度39实验组中,紫刺参SGR为5.47%/d,显著高于普通刺参;在不同环境条件下,刺参开始着色到变色完成的时间为7—23d,当水温为22oC、盐度为31时,紫刺参在32—48日龄完成变色,随着盐度或水温的改变,变色时间逐渐从16d延长至22d。紫刺参相比普通刺参有更广的适温范围和耐高盐能力。     

刺参(Apostichopus japonicus)不同组织基因组甲基化状态MSAP分析

利用MSAP技术分析成体刺参的呼吸树、肠、肌肉和体壁等组织的基因组DNA甲基化水平,获得了四个组织基因组甲基化率.甲基化水平由高到低依次是呼吸树、体壁、肌肉和肠,分别是35.77％、33.51％、32.72％和28.0％,其中全甲基化位点各占19.46％、18.39％、19.18％和15.97％.统计学分析结果显示肠组织的甲基化水平与其它组织的差异显著(P＜0.05),其余三个组织间差异不显著(P＞0.05),但呼吸树与肌肉的半甲基化水平差异显著(P＜0.05).由MSAP分析差异位点克隆得到四个甲基化特异性片段,经测序分析功能未知,推测为刺参基因足非编码区或新功能基因序列.     

泥蚶(Tegillarca granosa) cDNA 文库的构建及铁结合蛋白基因(Ferritin)序列分析

取正常泥蚶肌肉组织获得总RNA,纯化mRNA后,利用含SfiⅠ酶切位点的CDSⅢ引物逆转录合成cDNA第一链,通过LD—PCR合成cDNA双链,经胶回收除去短片段,与pDNR—LIB载体进行连接,电转化到大肠杆菌DH10B中,构建形成原始文库,进行滴度测试和重组率鉴定。结果表明原始文库的滴度为3．17×10^5cfu／ml,重组率为86．3％,插入片段多在500--2500bp间。随机挑选458个克隆测序,经分析获得94种已知基因及87种未知基因。其中包括铁结合蛋白（Ferritin）的全长cDNA序列。该基因序列全长895bp,5’-端非编码区为163bp,3’-非编码区为213bp,开放阅读框为519bp,编码172个氨基酸。推测其蛋白分子量和等电点分别为20kDa和4．89。氨基酸序列与皱纹盘鲍、太平洋牡蛎、血红扇头蜱、文昌鱼、中华蟾蜍、非洲爪蟾、小家鼠以及人等的同源性有62％-82％。比对结果表明,铁结合蛋白基因在动物进化中高度保守。     

仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道源乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的分离鉴定及其益生特性分析

利用MRS固体培养基从南移仿刺参肠道中分离得到1株优势乳酸菌,命名为AJC-XP-15,其最适生长温度为30°C,最适生长pH为6.5;其表面疏水性和自聚率分别为34.56%和35.61%,经16S RNA基因序列分析,并结合形态学和生理生化特性将其鉴定为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。拮抗实验结果显示,菌株AJC-XP-15及其发酵上清液对塔氏弧菌(Vibriotubiashii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus, VP)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等病原菌具有很好的抑制作用;体外益生实验表明,菌株AJC-XP-15对人工胃肠液的耐受性很好,在pH3.0的模拟人工胃液处理3 h后的存活率为71.43%,在pH 6.8的模拟人工肠液处理3 h后的存活率为92.1%;抗氧化能力结果显示,菌株AJC-XP-15的无细胞提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除能力最强,分别为(82.67±6.92)%和(15.36±2.95)%,其发酵上清液对超氧阴离子自由基的清除能力最强,为(26.36±...     

南移养殖刺参(Apostichopus japonicus)原肌球蛋白基因的原核表达研究

本研究克隆和表达了刺参原肌球蛋白(Tropomyosin,TRP)基因,进一步研究刺参再生过程中重要分子的功能.结果表明,TRP基因序列总长为1203bp,5 ′非翻译区为105bp,3 ′非翻译区为240bp,该序列包含一个855bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码284个氨基酸,分子量为33.27kDa,等电点为4.56.利用Escherichia coli对TRP进行了体外重组表达,在1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导,能产生分子质量约为38kDa的重组蛋白,Western blot证明重组TRP与鼠抗刺参原肌球蛋白的多克隆抗体能特异性结合.