利用流式细胞仪技术研究杂色鲍血细胞的吞噬率

利用流式细胞仪（FCM）技术检测了杂色鲍血细胞在体内和体外对不同含量荧光微球悬液的吞噬率.其结果表明体内注射法测定吞噬率的方法不可行.在体外吞噬中,当荧光微球含量为血细胞含量的68.2倍时吞噬率达98.43%±1.27%,随着荧光微球含量的降低血细胞吞噬率也随着降低.当荧光微球含量为血细胞含量的6.82倍时吞噬率为63.45%±6.05%,以这一含量进行血细胞吞噬率的测定比较恰当.利用这一含量测定了正常鲍与经过低盐（S=18）海水胁迫24 h后鲍的血细胞吞噬率的变化,正常鲍的吞噬率为68.71%±10.05%,经低盐海水胁迫后鲍的吞噬率为49.49%±10.18%,吞噬率出现了显著的下降（p〈0.05）.实验结果表明利用流式细胞仪技术相比传统的显微镜镜检记数法检测杂色鲍血细胞吞噬率更为方便可靠.     

杂色鲍血细胞免疫特点及免疫功能的研究

杂色鲍Haliotis diversicolor感染病毒后血细胞总浓度呈现上升趋势, 颗粒细胞与无颗粒细胞浓度与百分比均呈现不同的变化;感染鲍抗菌活力在第24h时最高, 说明病毒感染刺激病鲍血细胞产生抗菌活性, 第36h时的抗菌活力大大下降;感染鲍在第6h时, 溶菌活力大大下降, 且一直持续至36h;血细胞内的活性氧总体呈明显的上升趋势;受感染的血细胞出现细胞器空泡化和分解.说明病毒感染对杂色鲍血细胞免疫功能的影响非常明显.     

杂色鲍血细胞的分类及显微与超微结构研究

对杂色鲍血细胞进行了显微、亚显微及超微观察,根据细胞大小、特性等将其分为颗粒细胞和无颗粒细胞,颗粒细胞的特征是细胞较大,大多数细胞呈圆形或略呈椭圆形,细胞核呈圆形或卵圆形,细胞大小为11.79±1.09μm,核质比为0.56,细胞内具有均质的大颗粒;无颗粒细胞的特征为细胞圆形或卵圆形,细胞较小,核质比为0.71,包含一个或两个明显的透明细胞质区域,细胞大小为6.37±0.49μm.     

氯霉素暴露对杂色鲍免疫活性的影响

杂色鲍的免疫机能主要是由血细胞以吞噬的方式来完成．本研究将杂色鲍分别暴露在1、2、5Ixg／cm3不同含量氯霉素的水体中60d（每天暴露4h）,检测其主要免疫指标的变化．实验结果表明,经氯霉素暴露实验后,杂色鲍的主要免疫指标出现了下降．对照组与各药物含量组（1、2、5μg／cm3）中杂色鲍血细胞对溶藻弧菌的吞噬率分别为89．83％±3．66％、75．33％±4．89％、68．67％±5．05％和37．00％±9．21％;其吞噬指数分别为3．84±0．27、2．54±0．35、2．12±0．47和1．18±0．32;其血细胞密度分别为（2．72±0．33）×10’、（1．87±0．09）×10^7、（1．46±0．17）x10^7、（1．03±0．14）×10^7个／cmA^3．对照组与各药物含量组在水温3l℃高温胁迫下杂色鲍半致死时间（,Jk）分别为10、8、6、4h．各实验组的壳长、体重生长率、成活率与对照组比较,高含量组均显著小于对照组．含量为lμg／cm^3和2μg／cm^3的氯霉素暴露对杂色鲍的生长有轻微的促进作用．各实验组酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活指标变化与氯霉素的暴露含量无明显相关性．     

杂色鲍人工育苗的初步研究

鲍是一类经济价值很高的海产软软体动物,也是我国海产药用生物的重要种类之一。鲍的足部相当发达,占体重40%左右;堪称海味之冠。鲍売又名石决明,是我国医药史上应用很早的药品,具有平肝明目的显著功效。 杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)在我国广东、福建、台湾都有分布,但数量不大；福建沿海主要分布于东山和平潭两地,漳浦、龙海、晋江近海也有,数量亦很少。杂色鲍对栖息环境有一定的选择能力,一般栖息于低潮区至水深20米左右,潮流畅通、水色清晰、海藻繁茂的岩礁地带;有淡水注入、透明度低的河口或泥沙质底则不适于鲍的生长,因而鲍的分布比较集中于某些特殊海区。 由于鲍的经济价值高,产鲍国家十分重视研究鲍的增殖。在这方面,日本的有关工作者做了较多的工作,他们已由自然采捕发展到蓄养、移殖以至近10年来的人工控制采苗和重要种的养殖。日本的村山(1935)研究了Haliotis gigantean的早期幼体发育过程,猪野(1953)研究了H. discus和H. sieboldii的增殖生物学,大场(1964)报告了H.diversicolor supertexta 的增殖基础,同年菊地对皱纹盘鮑H. discus hannai 的生活史及幼鲍的饲养也进行了研究。 我国过去对鲍的研究做的较少,1958年,沿海产鮑区渔民和有关研究机构曾经开展过鲍的人工育苗、移殖以及人工养殖试验,为进一步开展鲍的养殖工作积累了宝贵的经验。无产阶级文化大革命以来,在毛主席的革命路线指引下,鲍的研究工作有了新的进展。1970年6月,在福建省商业局、水产局和东山县革命委员会的领导下,在东山县开展了杂色鲍人工育苗和养殖试验,于1971年首次在国内培育出杂色鲍苗;1972-1973年进一步探索了杂色鲍的繁殖规律、生态习性,同时对辽宁产的皱纹盘鲍进行了南移和人工育苗的研究。本文即是这些研究工作中的一部分,其它部分今后将陆续发表。     

流式细胞术检测脂多糖对罗氏沼虾血细胞活性和免疫功能的影响

1引言 革兰氏阴性菌是虾类的一大致病菌,深入了解虾类对革兰氏阴性菌的免疫防御机制以及革兰氏阴性菌对虾类的致病机理,对虾类健康养殖有着重要的科学和实践意义.     

流式细胞术检测虾类血细胞活性氧含量方法的建立

建立和优化了流式细胞术检测虾类血细胞活性氧含量的方法。以2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)为ROS特异探针,以斑节对虾(Penaeus monodon)血细胞为材料,用流式细胞仪检测不同染料浓度和不同染料孵育时间下血细胞的荧光强度、细胞形态特征和细胞活性的变化。结果表明,利用FCM检测虾类血细胞ROS含量的适宜的染料浓度和最佳的孵育时间分别为10μmol/L和30 min。     

杂色鲍碱性磷酸酶在醇、醛和酮溶液中的失活作用

报道了杂色鲍碱性磷酸酶(ALP)在甲醇、乙醇、丙醇、甲醛、丙酮等溶液中的失 活动力学．结果表明:酶的剩余活力随着有机溶剂浓度的增大而迅速下降．测得上述 5种有机溶剂对该酶的半抑制率(IC50)分别为5．41、3．07、1．80、31．0×10-3、2．30 mol／dm3．在这些有机溶剂溶液中酶的失活过程都是可逆反应．检测醇、醛、酮对该酶 的失活作用机理,结果表明甲醇、乙醇、丙醇对杂色鲍ALP的失活作用均为非竞争性 机制,其抑制常数分别为5．36、3．02、1．80mol／dm3．甲醛、丙酮对杂色鲍ALP的失活 作用都呈现为混合型抑制,其对游离酶的抑制常数(K1)分别为24．7×10-3、1．66 mol／dm3;对酶-底物络合物的抑制常数(KIS)分别为56．2×10-3、5．40mol／dm3．     

哈维弧菌和鲍类疱疹病毒刺激对杂色鲍免疫相关因子的影响

以哈维弧菌(Vibrio harveyi)、鲍类疱疹病毒(Abalone herpesvirus,Ab HV)悬液对杂色鲍(Haliotis diversicolor)注射刺激,研究其血淋巴中可溶性总蛋白浓度,免疫相关酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AKP)活性的变化,杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺、腹足中血蓝蛋白(Hemocyanin,Hc)基因Hc1、Hc2相对表达量的变化以及感染后杂色鲍无细胞血浆的抑菌性。结果显示:(1)杂色鲍血淋巴中可溶性总蛋白浓度变化显著,呈现出先升高后降低的趋势。(2)无细胞血浆中的SOD、ACP、AKP活性与对照组相比变化显著,哈维弧菌注射组的SOD活性在感染后第6小时显著升高;Ab HV注射组SOD活性与对照组比较在注射后的各个时相均呈下降趋势,从注射后6 h各个时相的SOD活性与对照组相比均差异显著(P0.05)。哈维弧菌注射组ACP活性在注射后的第48小时显著升高;Ab HV注射组ACP活性在注射后的第12小时显著升高。哈维弧菌注射组AKP活性在注射后48 h显著升高;AbHV注射组AKP活性在注射后第12小时显著升高。(3)杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺以及腹足中血蓝蛋白两个基因Hc1、Hc2的相对表达量均在注射后的不同时间点出现升高。(4)杂色鲍无细胞血淋巴对哈维弧菌、创伤弧菌和溶珊瑚弧菌这三种贝类病原均表现出了不同程度的抑菌性增强的作用。这些结果表明细菌和病毒的刺激引起了杂色鲍免疫相关因子的变化,使得血淋巴的抑菌性增强。本研究为今后进一步研究杂色鲍的非特异性免疫以及在生产实践中应用免疫技术防治病害提供参考。     

微生物粘膜对杂色鲍幼虫附着和变态的影响

为了探讨广泛存在于海中基质表面的微生物粘膜对鲍幼虫附着和变态的诱导作用,研究了不同年龄微生物粘膜 ( 1 ～ 6 d ) 对杂色鲍幼虫附着和变态的影响.结果表明:1 ～ 6 d微生物粘膜均显著地诱导幼虫附着,其中 3, 5 和 6 d 微生物粘膜还显著地诱导幼虫变态;幼虫的附着率和变态率分别与微生物粘膜中的藻类密度和细菌密度呈显著的正相关性,推测藻类和细菌可能在幼虫的附着和变态中起着重要作用.垂直基质选择性试验结果表明,90 % 以上的幼虫附着在具 23 d 微生物粘膜的载玻片表面且变态率达 70 % 以上,进一步证实了微生物粘膜可以诱导杂色鲍幼虫的附着和变态,同时也证实了幼虫具备选择附着基质的能力.     

杂色鲍与盘鲍杂交F1的早期生物学表现

比较研究杂色鲍(Haliotis diversicolor)(S)与盘鲍(H.discus discus)(J)正反交F1及其亲本自繁后代的卵裂速度和孵化速度,以及杂色鲍与盘鲍杂交F<,1>及杂色鲍自繁幼体的成活率.在22～23℃下,杂色鲍自繁后代的早期发育速度快于盘鲍自繁后代.杂色鲍和盘鲍2细胞期分别为授精后45.3...     

温度和pH 对杂色鲍消化酶活力的影响

采用酶学分析方法研究了温度和pH对杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)肝胰腺和消化道中胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶4种主要消化酶活力的影响。结果表明,在设定的温度和pH范围内,杂色鲍各消化酶的活力均随着温度或pH的升高呈现先升后降的变化趋势。其中,肝胰腺和消化道中胃蛋白酶的最适温度均为50℃,适宜pH分别为2.6～3.0、2.6～3.4;类胰蛋白酶在肝胰腺中的最适温度为40℃、适宜pH为8.6～9.0,在消化道中的最适温度为50℃,适宜pH为8.2;肝胰腺和消化道中淀粉酶的最适温度分别为40、30℃,最适pH分别为6.8、7.2;纤维素酶在肝胰腺中的适宜温度为40～50℃,最适pH为5.2,在消化道中的最适温度为40℃,适宜pH为4.8。在最适温度和pH范围内,肝胰腺中纤维素酶、淀粉酶活力均显著高于消化道中,具有器官特异性,而胃蛋白酶和类胰蛋白酶活力在肝胰腺和消化道中差异不显著,无器官特异性。同种消化器官内,各消化酶的活力也存在差异。     

福建沿海米氏凯伦藻赤潮对皱纹盘鲍鳃组织抗氧化酶活性的影响研究

本文初步研究了在较低赤潮密度(低于107个/m L)下,一株米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)鳃内几种抗氧化酶,如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的毒性效应,以期分析米氏凯伦藻对鲍鱼生命活动可能的胁迫方式。研究表明,米氏凯伦藻对SOD、CAT酶活性均造成不利影响,并未对GSH-Px酶造成不利影响,其酶活性显著高于对照组。米氏凯伦藻对SOD酶活性的影响表现为"先诱导后抑制"效应,24 h内,各处理组(0.1个/m L,0.5个/m L,1.0×104个/m L)中,酶活性急剧增高,分别是对照组的1.2,1.3,1.3倍,之后酶活性迅速下降,分别是对照组的77%,77%,73%。SOD能够清除机体体内多余的自由基,其活力变化反映了机体抵制自由基损伤能力已受到明显抑制。此外,米氏凯伦藻处理组中,CAT酶活性则处于"被抑制"状态,48 h内酶活性持续下降,分别降低至对照组的58%,51%,37%。CAT可以清除SOD歧化超氧阴离子自由基产生的H2O2,其活力的下降也可能造成机体内过氧化物的累积及氧化损伤。结果表明,即使未达到较高赤潮密度(不超过107个/m L)时,米氏凯伦藻短时间内仍可对鲍鱼鳃内关键抗氧化酶活性造成显著抑制效应,这极有可能导致鲍鱼机体抗氧化系统遭受严重损伤。     

工厂化养殖杂色鲍致病菌副溶血弧菌的分离鉴定及其生理特性

从广东汕尾地区工厂化养殖的患病和死亡的杂色鲍(Haliotis diversicolor)及养殖海水中分离到3株优势菌,经回归感染试验,证实所分离的细菌为杂色鲍的致病菌。经形态、生理、生化等多项指标鉴定,该菌株为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),并经ATB微生物自动鉴定系统证实鉴定结果。在中国大陆,由副溶血弧菌使杂色鲍致病并大量死亡的事件,本文属首次报道。     

杂色鲍血蓝蛋白多克隆抗体的制备与血蓝蛋白35kDa片段鉴定

以杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)为研究对象,通过密度梯度离心方法纯化得到高纯度血蓝蛋白,以其作为抗原皮下注射免疫新西兰大白兔,从而获得高效价的兔源多克隆抗血清。进一步通过Protein A抗原亲和纯化的方法对该抗血清纯化,最终获得效价更高、检测特异性更好的血蓝蛋白多克隆抗体。应用该抗体进行Western检测发现,鲍血淋巴中存在着多样的血蓝蛋白衍生产物;进一步结合质谱技术对其中35 kDa条带进行鉴定发现,其来源于血蓝蛋白I型亚基的H结构域。     

利用贝壳颜色标记分析皱纹盘鲍苗种繁育中的无意识选择

利用皱纹盘跑（Haliotis discus hannai）贝壳颜色与摄食饵料相关且贝壳生成后色调不再改变等特点,以幼鲍贝壳顶部摄食底栖硅藻期间形成的褐红色部位的壳长指示它剥离时的壳长,将贝壳颜色用作形态标记,首次在皱纹盘鲍苗种繁育中观察到无意识选择。在投喂人工配合饵料后的第3天与第30天,分别从遗传背景不同的8组样本...     

不同水交换量下皱纹盘鲍转录组测序与分析

养殖过程的循环水交换量能够显著影响皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)的生理状态, 进而影响其养殖存活率和生长率, 然而不同循环水量对于皱纹盘鲍的生理状态影响的分子机制尚不明确。本实验以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)为研究对象, 将鲍分别置于循环水交换频率为1次/d、2次/d、4次/d的条件下(编号为C0、T2和T4组)暂养3 d, 然后利用Illumina Hiseq 2500技术测定不同处理组鲍鱼的肌肉组织中转录组表达情况。结果表明, 单次换水组(C0)和多次换水组(T2和T4)间差异表达的基因个数较多, 分别为4 095和3 617个, 而T2与T4组之间的差异表达基因个数则较少, 仅为232个。对差异表达基因进行GO和KEGG功能分析显示, 单次换水组(C0)和多次换水组(T2和T4)间差异表达的基因主要集中在能量代谢和免疫反应相关通路或基因, 随机选取10个差异基因进行荧光定量PCR验证, 定量PCR结果与转录谱结果一致, 证实了转录组测序结果的可靠性。本研究说明了更高的水交换量下, 鲍的代谢和免疫相关通路被激活, 可能有助于鲍鱼维持较好的生理和免疫状态, 从而表现出更好的生长、存活等表型。     

粤东养殖区分离的2株海洋弧菌及其胞外产物对皱纹盘鲍致死毒性的初步分析

2011年秋,福建和广东地区养殖的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)相继暴发死亡。同年12月,我们从广东汕头病区取样分离得到2株弧菌,其中bb3为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), bb4为哈氏弧菌(V. harveyi)。本研究以bb3、bb4作为供试菌株对1龄皱纹盘鲍进行侵染实验,获得如下结果：20℃条件下,供试菌及其胞外产物粗提液注射处理均可致受试鲍死亡,浓度2.5×107 cfu/mL 的 bb3与2.0×107cfu/mL的bb4悬液注射可分别引发43.33%和78.02%的受试鲍死亡;供试菌株的致死毒性与注射弧菌的总量正相关,与受试幼鲍的壳长、全湿重负相关;注射或浸泡-创伤两种处理方式均可导致受试鲍死亡,并且因注射供试弧菌而死亡的幼鲍软体部组织被健康鲍取食后也可引发取食者死亡;从侵染实验死亡的受试鲍软体部组织中可重新分离得到这2种供试弧菌。上述结果表明,溶藻弧菌 bb3和哈氏弧菌bb4是皱纹盘鲍的病原菌。药敏试验表明, bb3、bb4均已对抗生素具有一定程度的耐药性,在测试的20种抗生素中,仅有头孢曲松和丁胺卡那霉素是这2株弧菌同时高度敏感的抗生素,但bb3和bb4却对8种抗生素同时表现出抗性。