条斑紫菜藻胆蛋白性质的研究Ⅲ.不同环境条件下R-藻红蛋白吸收光谱类型的转变

条斑紫菜的R-藻红蛋白在pH:5.8—8.4的几种缓冲液中保存,经过大约4个星期,其吸收光谱由原有的双峰型转变为三峰型;在pH=8.4的聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳后或在微量四甲基乙二胺作用下发生了同样的变化。但在变性剂SDS或尿素存在下,吸收光谱中540nm和565nm的峰强度比逐渐改变,直至565nm吸收峰消失,始终没有从双峰型转变为三峰型的迹象。显然,条斑紫菜R-藻红蛋白吸收光谱类型的转变不是变性引起的。     

钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋白和多管藻R-藻红蛋白的分离纯化及摩尔消光系数的测定

１９９３年１１月～１９９４年１月用简单的羟基磷灰石柱层析法从多管藻中分 离纯化了Ｒ－藻红蛋白和从钝顶螺旋藻中纯化了Ｃ－藻蓝蛋白，它们的纯度（指可见 光部分的最大吸收与 ２８０ｎｍ处吸收值之比）可分别达到 ６（Ｒ－藻红蛋白）和 ５． ５（Ｃ－ 藻蓝蛋白）。由于不同藻种的同种藻胆蛋白的摩尔消光系数不同，所以应用凯氏定 氮法并结合可见光的吸收值测定了上述两种藻胆蛋白的摩尔消光系数，钝顶螺旋 藻Ｃ－藻蓝蛋白为１．８５３ × １０６ｍｏｌ－１ｃｍ－１（６２０ｎｍ），多管藻Ｒ－藻红蛋白为１．７９６ × １０６ｍｏｌ－１ｃｍ－１（４９８ｎｍ），为藻胆蛋白的浓度测定提供了方便。     

坛紫菜R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的亚基组成和发色团含量

坛紫菜(Porphyra haitanensis T.J.Chang et B.F.Zheng)中的R-藻蓝蛋白在Bio-Rex 70柱上用脲溶液(pH3.0)解离和层析,得到了α和β两个亚基,用SDS-PAGE测定α和β亚基的分子量分别为18 400和20 500。变藻蓝蛋白的α和β两亚基均分子量经测定,分别为18 800和19 700。R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的分子量分别确定为117 000和112 000,两藻胆蛋白中α和β两个亚基的摩尔比都为1:1,确定两藻胆蛋白的亚基组成都为(αβ)_3。各亚基的发色团含量为:R-藻蓝蛋白中,α亚基含1个藻蓝胆素,β亚基含1个藻蓝胆素和1个藻红胆素。变藻蓝蛋白中,α和β亚基各含1个藻蓝胆素。     

坛紫菜R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的亚基组成和发色团含量

坛紫菜中的Ｒ－藻蓝蛋白在Ｂｉｏ－Ｒｅｘ７０柱上用脲溶液（ｐＨ３．０）解离和层析，得到了α和β两个亚基。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定α和β亚基的分子量分别为１８４００和２０５００，变藻蓝蛋白的α和β两亚基的分子量经测定，分别为１８８００和１９７００。Ｒ－藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的分子量分别确定为１１７０００和１２２０００，两藻胆蛋白中α和β两个亚基的摩尔比都为１：１，确定两藻胆蛋白的亚基组成都为（αβ）３。各     

坛紫菜藻红蛋白α,β亚基基因的克隆和序列分析

藻胆蛋白(Phycobiliprotein,PBP)是原核藻类和真核藻类进行光合作用的捕光色素蛋白,占藻体干重的2%左右,主要分为3类:藻红蛋白(phycoer-ythrin,PE)、藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)[1].藻胆蛋白一般由α亚基和β亚基组成,部分藻胆蛋白中还存在γ亚基.一般由α和β亚基形成稳定的单体(αβ),再由单体聚合为多聚体(αβ)_n.从蓝藻和红藻中分离的藻胆蛋白为三聚体(αβ)₃或六聚体(αβ)₆[2].     

基于正交实验的高含量藻红蛋白紫菜丝状藻体优化调控培养条件研究

丝状藻体在紫菜养殖的人工苗种生产中非常重要,在利用于分离提取高价值的藻红蛋白方面也具有潜在的利用价值。本研究采集了成熟紫菜叶状体的果孢子释放的初始丝状藻体,基于3因子3水平的正交实验设计方案[采用具有分析交互作用的正交表L₂₇(3¹³)],确定了丝状藻体藻红蛋白含量对环境因子的响应以及优化的调控培养条件。结果表明,温度、光照强度和盐度因子对丝状藻体藻红蛋白含量均有显著影响(P≤0.048 1),并且温度和光照强度或盐度因子间存在交互作用(P ≤0.043 1),但光照强度和盐度因子间的交互作用不显著(P=0.469 8)。获得的优化调控培养条件为:温度18 ℃、光强1 500 lx、盐度20或25。优化调控培养条件下的丝状藻体藻红蛋白含量高达64.73 mg/g.dw(平均值±标准偏差SD为58.24±5.07 mg/g.dw)。     

用高碘酸钠氧化法制备多管藻R-藻红蛋白和钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋白的共价交联物

从海洋红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)和蓝藻钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)中分别纯化了R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白，然后用高碘酸钠氧化法将二共价连接。交联反应液经Sephadex G-200凝胶过滤纯化共价交联物。光谱分析表明，共价交联体内部存在着从R-藻红蛋白到C-藻蓝蛋白的能量传递。     

钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋白和多管藻R-藻红蛋白的分离纯化及摩尔消光系数的测定

１９９３年１１月￣１９９４年１月用简单的羟基磷灰石柱层析法从多管藻中分离纯化了Ｒ－藻红蛋白和从钝顶螺旋藻中纯化了Ｃ－藻蓝蛋白，它们的纯度（指可见光部分的最大吸收与２８０ｎｍ处吸收值之比）可分别达到６（Ｒ－藻红蛋白）和５．５（Ｃ－藻蓝蛋白）。由于不同藻种的同种藻胆蛋白的摩尔消光系数不同，所以应用凯氏定氮法并结合可见光的吸收值测定了上述两种藻胆蛋白的摩尔消光系数，钝顶螺旋藻Ｃ－藻蓝蛋白为１．８５３×１     

条斑紫菜杂交重组品系(A-18)的筛选与特性分析

为筛选出藻体生长快且颜色与野生型色泽相近的条斑紫菜新品系,本研究从条斑紫菜绿色突变体和红色突变体种内杂交产生的后代中,分离出了优良品系A-18。日龄60 d时的叶状体平均长度、长宽比和单株湿质量,A-18品系分别为84.95 cm、49.46和0.52 g,分别是条斑紫菜野生型品系（WT）的3.12、7.01和1.36倍。日龄60 d时叶状体的叶绿素a和总藻胆蛋白含量,A-18品系分别为8.37和53.81 mg/g,均与WT品系较接近。日龄60 d时的叶状体平均厚度,A-18品系仅为20.22 μm,比WT品系降低了29%。另外,A-18品系的壳孢子放散总量为916.01万个/贝壳,是WT品系的1.55倍。综上所述,A-18品系具有生长快、长宽比值大、藻体薄、壳孢子放散量大等优良特性,且藻体颜色与野生型色泽相近,有望在生产中运用。     

圆紫菜人工色素突变体的诱导与分离

为获得圆紫菜人工色素突变体,本文使用一定剂量的紫外线辐照其叶状体,培养数天后,在叶状体上出现了少量颜色变异细胞,它们呈斑点状无规则地分布在野生型细胞中间。再培养2~3周,这些色素变异细胞分裂形成了不同颜色的细胞块,其颜色呈浅绿黄、橄榄色、草绿、绿褐、黄褐、浅褐、深紫红和浅紫红色等。在辐照强度0~80 μW/cm2范围内,叶状体上色素变异细胞块出现的频率随辐照强度的增加而增加,但增加至80 μW/cm2以上时,随着辐照强度的增加,色素变异细胞块出现的频率反而下降,这表明80 μW/cm2为有效的辐照强度。将色素变异细胞块切下,置入充气瓶内充气培养,待其释放出单孢子,随后从单孢子萌发体中挑选出了黄褐、橄榄色、红色、褐红等纯色的突变体,并利用叶状体单性生殖分别获得它们的遗传纯合丝状体（品系）。各突变品系的F₁叶状体与各自母体的颜色一样,说明其颜色是可稳定遗传的。与野生型品系相比,各色素突变品系的F₁叶状体的生长速度、活体吸收光谱、3种主要光合色素和色素蛋白的含量及它们相互间的比值均发生了明显改变。     

条斑紫菜丙酮酸羧化酶基因表达对不同碳源的响应

丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase,PYC)在非光合生物中催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸(oxaloacetate,OAA),作为糖异生的第一步,在动物维持代谢稳态中具有重要作用。研究发现,PYC在光合生物中也发挥重要作用。为了探究PYC在潮间带大型海藻中的作用,我们从条斑紫菜叶状体中扩增获得PYC基因全长序列(命名为PyPYC),并分析了其序列特征。通过对系统进化树分析表明PyPYC与来自细菌的PYC具有较近亲缘关系。针对条斑紫菜叶状体生长环境所面临的碳源变化,设置了不同类型和不同浓度的无机碳培养条件,采用实时荧光定量(RT-qPCR)检测了该基因对这些无机碳源的响应。结果表明,高浓度的CO₂能显著上调PyPYC基因的表达,而高浓度的HCO₃^-对其影响较小。由此,我们初步认为,当紫菜叶状体暴露在空气中时, PYC在其无机碳利用中发挥一定作用。     

条斑紫菜栽培过程中有害藻类的分离与鉴定

针对条斑紫菜栽培过程中出现的有害藻类问题,进行了叶状体和丝状体有害藻类分离与鉴定等相关研究。通过形态学分析和分子生物学鉴定,发现叶状体中的杂藻主要有大型绿藻(浒苔、曲浒苔)、大型红藻(红毛菜)以及微型绿藻和硅藻,丝状体中的杂藻主要为褐藻、微型绿藻和硅藻。针对部分微型杂藻进行了抑制剂处理实验,结果表明低浓度的抗生素可以有效抑制部分硅藻和绿藻的生长,二氧化锗对硅藻生长具有显著的抑制效果。研究结果为系统、全面认识条斑紫菜栽培过程中的有害藻类提供了科学依据。     

适用于条斑紫菜的双向电泳样品制备方法

为了建立适于条斑紫菜(Porphyra yezoensis)蛋白质组学分析的的样品提取方法, 作者以条斑紫菜叶状体为材料, 比较了饱和硫酸铵沉淀法、三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚提取方法3 种方法对条斑紫菜叶状体总蛋白的提取效果。结果表明, 针对条斑紫菜叶状体细胞中含有大量多糖, 多酚化合物, 色素等干扰物质的特点, 通过酚提取方法能有效去除这些干扰杂质, 得到清晰、稳定、干净的双向电泳图谱和相对较多的蛋白质点数, 为提高其他大型海藻的总可溶性蛋白提取效率提供了重要参考。     

红毛菜与坛紫菜光合作用和品质的比较分析

为研究两种经济红藻红毛菜(Bangia fucscopurpurea)和坛紫菜(Pyropia haitanensis)的光合作用和品质差异,选取一株野生型红毛菜CY和一株野生型坛紫菜NSD35作为实验材料,分别测定二者在相同培养条件下的关键光合参数和营养成分指标。结果显示：红毛菜的最大电子传递速率、净光合速率、藻红蛋白含量分别比坛紫菜高29.6%、96.8%、60.5%;必需矿质元素钾、钙、镁、铁、锌的含量分别比坛紫菜高59.5%、39.5%、34.1%、86.2%、68.4%;红毛菜的必需氨基酸和风味氨基酸含量都高于坛紫菜。此外,二者的呼吸速率、最大光量子产率、叶绿素a、总糖、总蛋白和碘含量没有显著差异。研究结果表明,与坛紫菜NSD35相比,红毛菜CY的光合速率更快,矿质元素积累能力更强,必需氨基酸和风味氨基酸含量更高。研究结果有助于了解红毛菜和坛紫菜的光合作用和品质特点,为开发红毛菜种质资源提供数据参考。     

条斑紫菜类囊体膜蛋白质组双向电泳研究方法

以蓝绿温和胶电泳为工具,首次在国内用于条斑紫菜(Porphyra yezoensis)类囊体膜色素蛋白质复合物的研究。结果显示:(1)利用非离子型去污剂十二烷基麦芽糖苷(DM)增溶条斑紫菜类囊体膜,DM/Chla(w/w)15︰1产生的效果较好,在BN-PAGE胶中可以分离到较多较清晰的条带。(2)选取蔗糖密度层50%条带制备得到的类囊体膜样品进行第一向BN-PAGE和第二向SDS-Urea-PAGE电泳实验。第一向电泳分离出4个蛋白复合物,对第二向电泳胶上的15个蛋白点切取做质谱鉴定,检测到PSⅡ47ku,PSⅡ44ku,cytochrome f,PSⅡD2,PSⅡD1等蛋白。本实验证实了温和胶电泳与SDS电泳结合对于条斑紫菜这种原始红藻的类囊体膜研究方面应用的可行性。     

紫菜纳豆菌发酵物中醇提物和多糖生物活性的初步研究

纳豆菌(Bacillus natto)发酵后的条斑紫菜经稀释、离心后上清液用一定浓度的乙醇处理获得醇沉物和醇溶液。将醇沉物去蛋白得到粗多糖,进行抗氧化活性的研究;将醇溶液旋转蒸发得到浸膏,将浸膏按极性大小分相萃取分别得到石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相浸膏,探讨分相浸膏对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、四联微球菌的抑菌效果。通过测定多糖和分相浸膏对羟自由基(·OH)和DPPH自由基的清除能力评价其抗氧化能力。结果表明:醇溶物对金黄色葡萄球菌具有抑制作用,且随着浓度的升高各相浸膏对羟基自由基的清除率随之升高,其中,正丁醇相浸膏在质量浓度为0.5 mg/m L时对羟自由基的清除率达到91.6%,说明条斑紫菜经纳豆菌发酵可能产生了活性化合物;与对照组相比,利用纳豆菌发酵紫菜发酵物中多糖提取率增加了0.24%,发酵得到的多糖在质量浓度为5.0 mg/m L时对羟自由基的清除率达到了95.7%。     

条斑紫菜SSU 中内含子分析

根据GenBank中已知的条斑紫菜(Porphyra yezoensis)SSU和LSU r RNA基因序列分别设计引物,分别以混合个体和单个个体的基因组DNA以及c DNA为模板进行扩增,测序分析后推测SSU r RNA基因中的内含子转录后加工可能仍被保留,而在LSU r RNA基因上游序列中没有发现内含子。长511bp的内含子位于SSU r RNA基因序列的上游,其插入位点为TCTGGTG-CCAGCAGCC,内含子5′和3′端的核苷酸序列分别为AAC-和-ATGG。该内含子的剪接位点以及保守区P,Q,R,S与I型内含子是不同的。研究发现,在同种紫菜中,不同个体SSU基因中内含子的有无、分布及结构特征是不同的,说明内含子对于分类是不太适合的。但是内含子的长度以及核苷酸序列在种间又具有一定的特异性,可以为红藻种间以及种内亲缘关系较远的亚种和不同地理群的区分和鉴定提供参考。