海藻硫酸多糖911抗乙脑病毒作用的观察

采用体外微量细胞病变抑制实验及体内半数致死量LD_(50)测定法,分别观察海藻硫酸多糖911对乙型脑炎病毒的作用。结果表明,海藻硫酸多糖911在体外适宜的浓度条件下,对乙型脑炎病毒有一定的抑制作用,但对病毒无中和作用。体内给药,911对乙型脑炎病毒无明显抑制作用。     

姬松茸提取物组分体外抗病毒感染活性的研究

为了探明姬松茸提取物的体外抗病毒感染活性及其作用方式,进而为水产养殖鱼类高效抗淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus,LCDV)感染活性物质的开发和鲆蝶类淋巴囊肿病的防治奠定基础,利用热水浸提和酒精沉淀法得到了5种姬松茸提取物组分(E1～5),并利用MTT、细胞病变程度观察等方法研究了5种组分对LCDV感染体外培养大菱鲆鳍细胞(turbot fin cells,TF细胞)的影响作用.细胞毒性实验结果显示,5种组分对体外培养TF细胞均无毒性.细胞病变程度结果表明,本文所得5种姬松茸提取物组分尤其是E5组分具有显著的抗LCDV感染TF细胞的活性.不同方式感染的实验结果进一步显示,5种姬松茸提取物组分抗LCDV感染TF细胞的作用可能主要是通过直接灭活病毒和/或阻断病毒吸附细胞来实现的.     

禽流感病毒抗原表位分析及H5N1亚型基因工程疫苗设计

以亚洲地区H5N1亚型禽流感病毒(Avian Influenze Virus)流行株为研究对象,利用计算机软件,对同源性较高的HA1(Hemagglutnin,HA,血凝素)和NP(Nucleocapsid protein,核衣壳蛋白)进行全基因序列分析,优选出HA1蛋白的主要T细胞表位和B细胞表位,以及NP蛋白的主要CTL(Cytotoxicity T lymphocyte,细胞毒性T淋巴细胞)表位.依据这些优选表位,设计了禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗.构建了基因工程疫苗表达载体pRSET-AIV,外源基因能够在大肠杆菌表达系统中得到良好表达.表达产物免疫小鼠后,血清中IgA和IgG抗体水平明显上升,在体外培养脾细胞可产生IL-2、IL-4和IFN-γ细胞因子.验证了该H5N1亚型基因工程疫苗的抗原性,证实该基因工程疫苗在免疫小鼠体内激发体液免疫的同时调动了细胞免疫.     

牙鲆原代肾细胞培养及其对牙鲆弹状病毒的易感性研究

为探索牙鲆弹状病毒(HIRRV)对敏感宿主牙鲆肾脏原代细胞的敏感性,本研究分别采用组织块移植法和胰酶消化法对牙鲆(Paralichthys olivaceus)肾脏细胞进行分离和原代培养。研究显示,采用组织块移植法进行培养后,会出现较多的成纤维样细胞,而采用胰酶消化法进行培养后,细胞呈现上皮细胞样且形态完整,7天后细胞的汇合率可达80%。采用胰酶消化法对牙鲆肾细胞进行原代培养,传代后进行病毒敏感性实验,实验表明牙鲆肾细胞接种HIRRV后,第3天出现了明显的CPE,病毒滴度达1×105.8 TCID50/mL;RT-PCR可从感染3天的细胞培养物中检测到HIRRV的特异性mRNA;利用抗HIRRV单克隆抗体结合免疫荧光试验可从感染24h的细胞中检测到特异性荧光信号,信号分布在细胞膜和细胞质中。研究结果表明,基于胰酶消化法建立的牙鲆肾脏原代细胞对HIRRV较敏感,HIRRV可成功侵染该细胞并在细胞内实现快速增殖。本研究为牙鲆弹状病毒的致病机制研究提供了材料和实验基础。     

利用牙鲆鳃细胞系分离和培养淋巴囊肿病毒

本文利用牙鲆鳃细胞系进行了养殖牙鲆淋巴囊肿病毒的分离及培养 ,并通过电镜对培养细胞中淋巴囊肿病毒的形态及感染循环进行了初步研究。将病鱼的淋巴囊肿组织无菌滤液接种牙鲆细胞系 ,细胞出现了明显的细胞病变 ( Cytopathic effect,CPE)。电镜观察在培养细胞的胞质中有病毒的包涵体 ,胞质中散在 6角形、5角形或圆形的病毒粒子 ,大小为 10 0～ 140 nm之间。在感染细胞的线粒体中也存在大量的病毒颗粒。     

亚铁离子对赤潮异弯藻种群消长和部分生化特性的影响

研究了赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)在不同浓度的Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O(Fe1)和FeSO4.7H2O(Fe2)(浓度分别为:高铁150 nmol/L、低铁50 nmol/L,缺铁0 nmol/L Fe0)中的种群消长过程、单位细胞总多糖特征、光合色素chla、chlc变化以及NO3--N的吸收情况。结果表明,Fe2 浓度影响到赤潮异弯藻的消亡:缺铁组比高铁组种群消亡慢。在平台期和衰亡期时,Fe1各组单位细胞总多糖含量均明显高于Fe2各组。从平台期到衰亡期,各组单位细胞多糖含量明显增加,Fe2各组增量最大,Fe1各组多糖倍增与Fe0相似。亚铁离子浓度的进一步增加有利于单位细胞色素chla和chlc的积累。亚铁离子的不同化合物状态影响到多糖和光合色素的累积,但不影响种群生长率和对NO3--N的吸收。     

锦鲤组织细胞体外培养的初步研究

为建立来源于锦鲤的细胞系,本文采用组织块法,对来源于锦鲤(Cyprinus carpio)鳍条、吻端、肌肉、心脏、鳔、肠道、卵巢等组织的细胞进行原代培养和传代培养.在25℃下,添加20％胎牛血清、0.2μg/mL表皮生长因子(EGF)和25ng/mL成纤维生长因子(FGF)的L-15培养基中进行培养.结果显示,鳍条、心脏、鳔、吻端、肌肉、肠道、卵巢分别在原代培养第3、6、12、13、15、3、3天,有细胞从组织块迁出;对长至单层的鳍条、心脏、肌肉细胞进行传代培养,鳍条细胞已传至第39代,心脏和肌肉细胞分别传到第2代和第4代;鳍条、心脏和肌肉细胞分别呈现上皮细胞样、上皮细胞样和上皮细胞样与成纤维状混合型.第6代锦鲤鳍细胞的染色体计数,结果显示,细胞染色体数目分布范围为55～154条,2n=100.病毒敏感性实验,发现锦鲤鳍条细胞对草鱼出血病病毒(GCRV)和鲤春病毒血症病毒(SVCV)都敏感,且在24h内出现细胞病变(CPE);但对斑点叉尾鮰病毒(CCV)不敏感.锦鲤鳍条细胞系的建立为后期建立更多的锦鲤细胞系和鱼类病毒研究奠定了基础.     

褐藻多糖硫酸酯对脂多糖诱导大鼠肾小球系膜细胞NO产生量的影响

慢性肾衰的进程中伴随着肾脏炎症的发生,研究表明褐藻多糖硫酸酯具有抗炎作用,且对于慢性肾衰的早期治疗具有一定的作用。本文通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导,建立大鼠肾小球系膜细胞的炎症模型,用来源于海带的高分子质量褐藻多糖硫酸酯F1和低分子质量褐藻多糖硫酸酯F2对细胞进行处理,24 h后MTT法检测各组细胞活力,Griess法检测24 h及48 h后细胞培养液中NO的含量。结果表明,各组间细胞活力无明显差异;脂多糖可以诱导大鼠肾小球系膜细胞NO产量增加,F1和F2均可在一定程度上抑制脂多糖诱导的NO产量的增加,从而减轻细胞炎症反应。剂量为25μg/m L的F1和F2处理细胞48 h后,与模型组相比,F1和F2组细胞培养液中NO含量分别下降22.52%和38.65%,低分子质量褐藻多糖硫酸酯抗炎效果明显高于高分子质量褐藻多糖硫酸酯。     

大菱鲆红体病虹彩病毒体外增殖条件的研究

探讨大菱鲆病毒疫苗的研制,以牙鲆鳃细胞(FG细胞)为增殖体系,利用细胞病变效应(CPE)为判断指标,对大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)的体外最适增殖条件等进行了研究。结果表明,病毒接种量、病毒吸附时间、细胞培养条件对TRBIV的体外增殖均有明显的影响,以0.2 mL病毒液接种FG细胞、吸附2 h、用含10%胎牛血清的MEM培养液于22℃培养时,病毒的增殖速度最快。研究还发现,病毒的收获时间和病毒液冻融次数对所得病毒的感染力均有显著影响,在最佳增殖条件下,病毒在FG细胞中增殖至第4天时进行收获,且只冻融1次,其感染活性最强,反复冻融后病毒的感染活性会显著降低。     

钝顶螺旋藻藻蓝蛋白和多糖的抗肿瘤免疫活性研究

对钝顶螺旋藻藻蓝蛋白 (PC)和多糖 (PSP)的抗肿瘤免疫活性进行了研究。采用免疫酶标技术、MTT法及定量溶血分光光度测定法等免疫分析实验 ,从免疫器官、免疫细胞、免疫分子 3个水平上进行藻蓝蛋白和多糖的抗肿瘤免疫活性检测。结果显示 ,藻蓝蛋白和多糖处理组小鼠瘤块直径及瘤体重量均小于对照组 ,T细胞及 B细胞活性明显增强 ,体液抗体量显著提高 ,螺旋藻藻蓝蛋白比多糖抑制肿瘤细胞生长和提高机体免疫力的作用更明显。     

深海热液真菌Fusarium sp. SCSIO 06196中抗病毒聚酮类化学成分研究

从西太平洋深海热液沉积物来源的镰刀菌SCSIO 06196中分离鉴定了6个色原酮类化合物(1~6), 通过核磁共振光谱、质谱及旋光等多种分析测试方法确定了色原酮类化合物的结构。抗病毒活性筛选发现, 化合物1~3展示出显著的抗肠道病毒EV-71活性, IC₅₀分别达到26.7μmol•L^-1、19.8μmol•L^-1和22.0μmol•L^-1 (阳性对照药物利巴韦林为177μmol•L^-1)。此外, 化合物1还显示出弱的抗流感病毒H3N2活性, IC₅₀为8.6μmol•L^-1 (阳性对照药物达菲为18.5nmol•L^-1)。     

不同氮、磷浓度及配比对铜藻(Sargassum horneri)幼苗生长的影响

采用铜藻(Sargassum horneri)幼苗为实验对象,分别以Na NO3和Na H2PO4为氮源和磷源,研究了不同氮磷质量浓度及氮磷配比对铜藻幼苗生长的影响。进行了氮、磷单因子实验、双因子实验以及不同氮磷配比实验,实验时间为8d。结果表明:氮和磷对铜藻幼苗生长影响极显著(P0.01),且当氮、磷的质量浓度分别为8mg/L、0.4mg/L时,铜藻幼苗的特定生长率最大;交互作用影响不显著(P0.05),不同质量浓度的氮为主效应;不同氮磷质量浓度比影响极显著(P0.01),且当氮磷比为10:1时,铜藻幼苗的特定生长率最大。研究结果为铜藻幼苗培育过程中营养盐的合理调控提供了理论依据。     

Development and characterization of a cell line from the embryos of half smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis)

A new cell line,CSEC,has been successfully established from embryos at gastrula stage of a cultured marine fish,half smooth tongue sole(Cynoglossus semilaevis).CSEC cells grow actively and stably more than 50 passages for over 200 d in DMEM medium supplemented with 15% FBS(fetal bovine serum),2.5 ng/cm 3 bFGF(basic fibroblast growth factor),1 ng/cm 3 LIF(leukemia inhibitory factor) and 50 mmol/dm 3 2-ME(2-mecaptoethanol).The cells grew well in the temperature range of 24-30 ℃ and the optimal growth temperature was 24℃.FBS and bFGF concentrations are the two key components for CSEC cells proliferation.Chromosome analysis reveals that CSEC cells have a normal diploid karyotype with 2n=42t.The significant fluorescent signals were observed in CSEC after transfection with the GFP reporter gene,suggesting that the CSEC cell line can be used as a useful tool for transgenic and genetic manipulation studies.CSEC cells showed the cytopathic effect(CPE) after infection with lymphosystis disease virus(LCDV) in 2 d.Moreover,the LCDV particles can be observed in the cytoplasm of virus-infected cells by electron microscopy.It suggests that CSEC could be potentially used for the study of aquatic virus.     

草鱼出血病病毒株的筛选

为筛选适用草鱼出血病细胞疫苗工厂化生产的病毒株，于１９８７－１９８９年，在浙江湖州地区采集了１２个具典型草鱼出血病症状的病鱼材料，通过比较它们的毒力，对细胞的适应性，免疫原性，研究病毒在细胞内的增殖动态，细胞病变特征，毒株保存。结果表明，筛选出的ＺＶ－８８０２和ＺＶ－８９０９两毒株，其毒力高，免疫原性强，并能在细胞中大量增殖。应用这两株毒株制备的细胞疫苗，其免疫保护率在８５％以上。     

不同培养条件对三角褐指藻生长及其生物活性成分积累的影响

以三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)为研究材料,比较了Na NO3、NH4HCO3和CO(NH2)2为氮源的两种培养基(m L1和ASW培养基)对其生长和生物活性成分(岩藻黄素、金藻昆布糖和二十碳五烯酸(C20:5,EPA))时相积累的影响,同时分析了脂肪酸组成和总脂含量的变化。结果表明:以m L1培养基培养时,三角褐指藻的生物质质量浓度明显高于ASW培养基培养时的生物质质量质量浓度,尿素优于其他两种氮源,最大生物质质量质量浓度为3.7 g/L。不同培养条件下岩藻黄素含量的时相变化规律一致,均随着培养时间的延长呈现先增加后减少的趋势,其最高积累量分别为:13.27 mg/g(Na NO3)、13.23 mg/g(CO(NH2)2)和13.89 mg/g(NH4HCO3)(m L1);13.2 mg/g(Na NO3)、14.92 mg/g(CO(NH2)2)和13.6 mg/g(NH4HCO3)(ASW),由此可知氮源对岩藻黄素积累量影响不大。金藻昆布糖含量随着培养时间延长逐渐增加,其最大积累量分别为9.82 mg/g(NH4HCO3)(m L1)和8.59 mg/g(Na NO3)(ASW)。不同培养条件下其总脂含量变化不显著,均在培养末期达到最大值,分别为24.18%(NH4HCO3)(m L1)和23.79%(Na NO3)(ASW);其主要脂肪酸组成为:豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、花生一烯酸(C20:1)、木焦油酸(C24:0)和EPA,其中,EPA含量随着培养时间延长逐渐下降,尿素最有利于EPA的积累。     

基于海洋细菌为受试生物的海洋防污剂快速筛选方法

本文研究探索了一种快速简单易行的海洋防污剂室内评价筛选方法。将待测防污剂均匀分散于凝胶溶液中,然后均匀涂布到一定面积的玻璃板上,固化得到含防污剂凝胶测试板,将其置于接种有三种分离自舟山以东海域的优势海洋菌种(编号为Y-16,W-1和F-6)的人工加富海水中,连续培养24h后显微镜下可发现凝胶板表面上细菌菌落,将凝胶板表面细菌淋洗、定容,测定其光密度(optical density,OD)值,计算平均抑菌率,得到吡啶硫酮锌(ZPT)为38.87%,吡啶硫酮铜(CPT)为41.24%,三甲基氧化锡(TBTO)为65.19%,N,N-二甲基-3,4-二氯苄胺(DCDMA)为30.88%,敌草隆(Diuron)仅为15.29%,抑菌性大小为TBTOCPTZPTDCDMADiuron。实验结果表明5种受试防污剂的抑菌性大小为TBTOCPTZPTDCDMADiuron。采用绘制OD-t生长曲线法,分别得到5种防污剂对3种海洋细菌的最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),TBTO对三种菌的MIC均为0.5×10–3mg/mL;CPT对W-1和F-6的MIC为0.97×10–3mg/mL,对Y-16的MIC为1.93×10–3mg/mL;ZPT对W-1和Y-16的MIC为1.91×10–3mg/mL,对F-6的MIC为0.96×10–3mg/mL;DCDMA对W-1和F-6的MIC为8.46×10–3mg/mL,对Y-16的MIC为×10–342.29mg/mL。其中,Diuron对细菌的生长几乎没有抑制作用。其抑菌性与室内短期挂板结果具有一致性,表明经OD-t生长曲线得到的MIC可作为溶剂可溶型防污剂评价的辅助方法。另外,将本文中室内短期挂板方法应用于不同粒径的氧化亚铜的防污评价,也取得了与文献一致的结果。     

饲料中添加壳寡糖对花鲈(Lateolabrax japonicus)幼鱼的生长、消化和血清生化指标的影响

本试验旨在研究壳寡糖对花鲈（Lateolabrax japonicus）幼鱼生长,肠道消化,血清生化指标及肠道菌群的影响。本试验选用360尾规格一致的花鲈幼鱼（19.37 g左右）为研究对象。壳寡糖饲料添加浓度设为6组:0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。设3个平行组,养殖周期45 d。结果显示:（1）生长性能:添加0.6%和0.8%两组的增重率、特定生长率与对照组相比有提高（P>0.05）;（2）肠道消化酶:添加0.6%~1.0%的壳寡糖显著（P<0.05）提高胰蛋白酶活性,0.4%~0.8%的壳寡糖显著（P<0.05）提高了脂肪酶活性;（3）肠道菌群:0.6%~1.0%的壳寡糖显著降低了沙门氏菌数量（P<0.05）,大肠杆菌的数量在0.8%时显著降低（P<0.05）,双歧杆菌的数量在0.2%~0.6%时显著增加（P<0.05）;（4）血清生化指标:壳寡糖显著提高血清总蛋白和高密度脂蛋白胆固醇含量（P<0.05）;（5）血清非特异性免疫:添加0.6%的壳寡糖显著降低丙二醛（P>0.05）,0.2%的壳寡糖增强超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶和过氧化物酶活性,添加壳寡糖使溶菌酶的活性显著增强（P<0.05）。研究结果表明:饲料中添加0.6%~0.8%的壳寡糖对花鲈幼鱼生长性能、血脂及肠道健康影响效果最佳。     

Biological identification and determination of optimum growth conditions for four species of Navicula

Four species in the genus Navicula were isolated using the serial dilution method. Based on scanning electron microscopy(SEM) and sequence comparisons of two segments of genes(small ribosomal subunit and large subunit of Rubisco), the species were identified as Navicula perminuta, N. pseudacceptata, N. vara, and N. rhynchocephala. Based on phylogenetic analysis and culture trials, there was a close relationship between N. perminuta and N. vara. Growth of these species was evaluated using measurements of optical density at 680 nm(OD680) under various environmental factors. Results showed that the optimum culture conditions were 25℃, 50–100 μmol photons m-2 s-1, pH 8.0, and salinities from 25 to 30. However, the favorable salinity for N. perminuta was surprisingly high at 35. Nutrient requirement analysis demonstrated that growth of Navicula depended on the availability of SiO32-. Their relative growth rates(RGR) peaked at the highest tested level(0.25 mmol/L). The optimal concentrations of NO3- and PO43- were 3.6 mmol/L and 0.18 mmol/L, respectively. Culture of these Navicula species for abalone or sea cucumber aquaculture should take these factors into consideration.     

大黄鱼(Larimichthys crocea)ISG15基因单核苷酸多态性及与抗病性状的相关性研究

由哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)等细菌感染引起的弧菌病对我国大黄鱼(Larimichthys crocea)的养殖造成了严重危害。通过哈维氏弧菌人工感染大黄鱼建立易感组和抗病组,采用PCR扩增和直接测序法对大黄鱼干扰素刺激基因ISG15双拷贝(ISG15-1和ISG15-2)进行单核苷酸多态性(SNPs)检测和分型,并与其哈维氏弧菌抗性进行关联分析。结果表明,从大黄鱼ISG15-1和ISG15-2基因中分别筛选到10个和4个SNP位点并进行了成功分型。经统计分析,ISG15-1基因的186G/C和318C/T位点以及ISG15-2基因的297G/T位点的基因型频率和等位基因频率在易感群体和抗病群体中均存在极显著差异,表明这3个SNP位点与大黄鱼哈维氏弧菌抗性显著相关。连锁不平衡分析结果显示,ISG15-1的SNPs可形成1个单倍块和11种单倍型,而ISG15-2的SNPs可形成1个单倍块和5种单倍型。其中,ISG15-1基因的单倍型H2(CCCCGGTACC)、H6(TCCCACTGTC)和H9(TCCCAGTGCC)与大黄鱼哈维氏弧菌抗性显著相关;ISG15-2基因的单倍型H1(CCCG)和H4(TCCG)与大黄鱼哈维氏弧菌抗性极显著相关。这些ISG15-1和ISG15-2基因的SNP位点以及单倍型可以作为抗哈维氏弧菌病大黄鱼选育的候选分子标记。