香鱼(Plecoglossus altivelis)致病性类志贺邻单胞菌的分离与生化药敏鉴定

香鱼(Plecoglossus altivelis)是名贵洄游性鱼类,由于高密度养殖等因素导致病害频发。2021年7月强台风"烟花"过境后浙江省宁海县养殖香鱼暴发体表溃烂病,死亡严重。病鱼皮肤、肌肉溃烂并伴有周围皮肤充血。组织切片观察显示病鱼患处肌纤维断裂,周围红细胞、炎性细胞浸润;鳃丝和鳃小片中红细胞增多;肝细胞核呈空泡,部分细胞核染色质边集;脾脏内红细胞数量减少,部分白细胞聚集;肠黏膜上皮细胞脱落。从患病香鱼肠中分离到一株菌(编号NH21),其菌落低突、边缘光滑表面湿润,该菌株为革兰氏阴性菌,菌体呈短杆状、端圆。经生化特性和16S rDNA序列分析鉴定NH21菌株为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。用该菌株对健康香鱼进行回归感染后,人工感染香鱼呈现与本次体表溃烂病香鱼相似的症状,经计算NH21菌株对香鱼的半致死剂量(LD₅₀)为2.51×10⁷ CFU/mL。25种抗生素的药敏试验显示NH21菌株对阿奇霉素、头孢氨苄、新生霉素、多黏菌素B、头孢西丁、呋喃唑酮6种抗生素敏感。从NH21菌株中检出了毒力基因9个、耐药基因8个。综合分析表明,分离得到的类志贺邻单胞菌NH21菌株是本次宁海县香鱼体表溃烂病的病原菌,研究结果为香鱼出现类似病症的预防和治疗提供了基础资料。     

海豚链球菌(Streptococcus iniae)胞外产物对斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的致病性

采用硫酸铵盐析法提取海豚链球菌DGX07菌株的胞外产物(ECPs),通过平板扩散法对其主要酶成分进行初步研究,对酶热稳定和溶血活性进行测定;并对腹腔注射接种海豚链球菌(S.iniae)胞外产物的斑点叉尾进行组织病理学观察。结果显示,菌株胞外产物具有蛋白酶、DNA酶和溶血活性;DNA酶表现出一定的热稳定性,而蛋白酶和溶血活性在80℃或100℃作用10min均丧失;胞外产物对人(O型)、兔、斑点叉尾、草鱼、鲤鱼、鲫鱼、黄颡鱼和长吻的红细胞均表现出不同程度的溶血活性;人工感染试验显示,0.222mg/ml的S.iniaeECPs对斑点叉尾具有明显的致病性,死亡率达100%;临床特点表现为:游动缓慢、体表褪色、鳍条边缘褪色,内脏器官肿胀并伴有腹水;组织学病变主要表现为全身性多组织、器官炎性水肿,伴有组织内出血,实质细胞变性和坏死,尤以肝胰脏、脾脏、肾脏、肠道和心脏的损伤最为严重。试验结果表明海豚链球菌胞外产物含有多种毒力因子,与该菌的致病性密切相关。     

温度及pH对杀鲑气单胞菌生长的影响研究

利用A值法与活菌平板计数法,测定了杀鲑气单胞菌在不同条件下的生长曲线,研究了不同温度及pH对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicha)生长的影响。结果表明,活菌计数法更能真实的反映细菌数量的动态变化。在28℃,15℃,10℃,5℃条件下,随着温度降低,杀鲑气单胞菌生长速率明显下降;在pH6.0~8.0时,酸性条件能明显抑制杀鲑气单胞菌的生长;在28℃、pH7.5条件下,杀鲑气单胞菌生长速率最快,达到稳定期时细菌数量也最多。在养殖生产过程中,为了抑制杀鲑气单胞菌的生长繁殖,建议在不影响鱼类正常生长的条件下,尽量降低养殖水体温度并合理控制水体pH,以降低养殖鱼类发病率。     

小黄鱼(Larimichthys polyactis)鰤鱼诺卡氏菌的分离及鉴定

为探明舟山海域网箱养殖小黄鱼(Larimichthys polyactis)暴发的以体表溃疡、眼球溃烂、内脏出现白色结节为主要症状的疾病病因, 对患病小黄鱼体表溃疡处和结节病灶处采集组织样本, 在血琼脂平板上划线培养, 通过分离、纯化到同一优势菌株ZHNK2101。经形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因片段扩增及序列比对,确定该菌株为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)。药敏试验结果显示, 菌株ZHNK2101对哌拉西林、头孢曲松、丁胺卡那、庆大霉素等16种抗生素敏感。回归感染试验表明, 该菌株可以感染小黄鱼并引起和自然感染相同的症状, 半致死浓度LD₅₀为7.28×10⁴ CFU/尾。另外,该病株会引起小黄鱼鳃、肝、肾和脾脏发生病理变化, 主要表现为鳃丝紊乱,肝脏、肾脏、脾脏组织细胞纤维化形成病理性结节。试验首次报道了小黄鱼感染鰤鱼诺卡氏菌的病例, 并从理化特性、药敏试验、回归感染及组织病理变化等方面对该菌株的特性进行了初步研究, 为小黄鱼养殖过程中由鰤鱼诺卡氏菌引起的内脏白点病的早期预防和治疗提供基础数据。     

斑点叉尾(Ictalunes punctatus)源鲁氏耶尔森氏菌的分离鉴定及系统发育分析

从发病的斑点叉尾肝脏和肾脏均分离到一高致病性的菌株(FF003),感染该菌后斑点叉尾表现为体表多处点状出血,特别是在下颌、腹壁、体侧处,各内脏器官不同程度出血,尤其是腹内膜和鳔内膜斑块状出血。该菌为非发酵型需氧,革兰氏阴性杆菌,对除麦芽糖、甘露糖、果糖、海藻糖、D-甘露醇以外的多种糖类不利用产酸,氧化酶阴性,精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶阳性,MR阳性。在以该菌16S rDNA序列(GenBank登录号为FJ908709)和GenBank数据库内同源性较高的细菌16SrDNA序列构建的系统发育树中,分离菌FF003株与鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)聚为一个分支,结合形态和生理生化特点将其鉴定为鲁氏耶尔森氏菌。药敏实验结果表明氟哌酸、环丙沙星、强力霉素、氯霉素对其高度敏感,头孢拉定、克拉霉素、磺胺甲基异唑、庆大霉素、麦迪霉素等药物不敏感。     

龙须菜(Gracilariopsis)/江蓠(Gracilaria)的生长和种质特性分析

龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是具有重要经济价值和生态效益的大型红藻, 主要用作琼胶提取原料和鲍的饵料。本研究利用生理生化、液相色谱-质谱联用和氨基酸分析等方法, 比较了龙须菜(Gp. lemaneiformis) (wt、981、Gl-1、Gl-s、Gl-g)、异枝龙须菜(Gp. heterocla, Gh)和细基江蓠繁枝变种(Gracilaria tenuistipitata var. liu, Gt)的生长及藻胆蛋白、琼胶、红藻糖苷和氨基酸等的差异, 以期为龙须菜/江蓠栽培中的种质区分及选择提供参考。结果表明Gt在23 ℃和30 ℃条件下生长均最快, 其相对生长速率分别为野生型龙须菜(wt)的2.19倍和2.49倍。龙须菜Gl-s中藻胆蛋白浓度最高, 为wt的1.91倍。除了Gt之外, 其余6种藻中琼胶产率较高(16.22%~18.91%)。Gt中红藻糖苷和海藻糖积累最多, 分别为wt的3.50倍和1.81倍。Gl-g、Gl-s、Gt和Gh多糖丰富, 在36.89%~40.23%; 龙须菜981、Gl-1、wt和Gl-s总氨基酸浓度较高, 在152.35~161.32 mg·g^–1干质量之间, 并且981、Gl-1、Gl-s氨基酸评分较优。综合以上结果, 龙须菜981、Gl-1和Gl-s的藻胆蛋白、琼胶和氨基酸等均显著优于其他藻, 并且生长较快, 可用于琼胶、藻胆蛋白及多糖的提取或鲍的饵料; 而细基江蓠繁枝变种生长快、红藻糖苷和海藻糖丰富, 可大规模栽培用作鲍的饵料。该研究为丰富及开发利用中国大型海藻种质资源提供了重要的资料。     

绿色荧光蛋白标记杀鲑气单胞菌的构建及其初步应用

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是引起疖疮病的典型致病细菌,几乎可以侵染所有的鲑科(Aeromonas)鱼类,为水产养殖业带来巨大的经济损失。本研究通过电击转化法将原核表达载体p GFPuv成功导入杀鲑气单胞菌C4菌株(AS-C4)中,获得了绿色荧光蛋白标记的杀鲑气单胞菌菌株AS-C4~(GFP)。AS-C4~(GFP)菌株在氨苄青霉素抗性平板上生长良好,并在紫外光下激发出较强的绿色荧光。通过荧光显微镜观察菌体和PCR检测gfp和杀鲑气单胞菌vap A基因,表明gfp基因已经成功导入AS-C4中。用AS-C4~(GFP)人工感染大西洋鲑(Salmo salar),从死亡鱼的脾脏、肝脏、肾脏中均能分离出AS-C4~(GFP),AS-C4~(GFP)在脾脏中最多。AS-C4~(GFP)具有特异性和可视性,为研究杀鲑气单胞菌对大西洋鲑的侵染途径提供了一种良好的生物材料。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的分离鉴定及其特性分析

近年来细菌性疾病因病原菌种类繁多、覆盖区域广而影响了其养殖业的健康发展,造成较大的经济损失。从体表具有黑斑、肢体残损症状的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肝胰腺组织中分离得到1株病原菌,通过形态学观察、生理生化特性鉴定、16S rRNA序列和特定毒力基因检测鉴定,以及人工回归感染试验和药敏试验分析其致病性和耐药性。结果表明,该菌为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae),含有aer、lip、gcat、ser和OMPA I等毒力基因;药敏试验显示其对头孢曲松、氯霉素等7种抗生素高度敏感,对恩诺沙星、阿米卡星及复方新诺明3种抗生素中度敏感,对四环素、环丙沙星等10种抗生素具有耐药性;人工回归感染实验表明该菌具有较高的致病性,对罗氏沼虾的半致死浓度为6.54×10⁵ CFU/mL。豚鼠气单胞菌作为水产养殖中的条件性致病菌,研究结果揭示了该菌株的部分生物学特性,有利于丰富豚鼠气单胞菌属的基础数据,同时也为罗氏沼虾养殖过程中的病害防控提供了一定参考依据。     

斑点叉尾(Ictalunes punctatus)源中间气单胞菌(Aeromonas media)分离鉴定及药敏特性

从湖南常德某养殖场死亡的斑点叉尾(Ictalunes punctatus)肝脏、肾脏、腹水及血水中分离到一株致病性菌株zy02。对该菌进行了形态特征观察、理化特性测定及分子生物学方法鉴定,用PCR方法同时扩增其16S rDNA和gyrB基因,分析了16S rDNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树。经生理生化测定和16S rDNA与gyrB基因序列分析,zy02株为中间气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾的半致死浓度为3.89×10~6CFU/mL。菌株zy02对多西环素、庆大霉素及左氧氟沙星等高度敏感;对红霉素中度敏感;对阿莫西林、磺胺异噁唑、克林霉素及利福平等5种药物耐药。本研究为斑点叉尾该病防控提供了理论依据。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病性维氏气单胞菌的分离鉴定与药敏特性研究

本研究从自然发病的养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肝脏处分离得到1株优势菌9L2,经形态学观察和传统生理生化鉴定,显示该菌为发酵型革兰氏阴性短杆菌,有动力,氧化酶阳性,水解赖氨酸及色氨酸等。利用Biolog细菌鉴定方法进行种属鉴定,确定9L2为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),相似性达100%。同时对其16S rDNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析,结果表明该菌与气单胞菌属的菌株亲缘关系最近,与维氏气单胞菌(登录号为LMG13695)的16S rRNA基因序列相似性达99.79%。经人工腹腔注射感染吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的试验结果表明,9L2对罗非鱼的半数致死剂量LD_(50)为1.08×10~3CFU/g。24种抗生素药敏试验结果表明,该菌株对诺氟沙星、新生霉素、呋喃妥因、头孢曲松等13种药物高度敏感,对洛美沙星、卡那霉素等5种药物中度敏感,对利福平、青霉素等6种药物产生耐药性。20种中药体外抑菌试验结果表明,其中11种对致病菌体外抑菌效果较好,平均抑菌浓度范围为0.11—7.20mg/mL。     

大口黑鲈(Micropterus salmoides)致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及其特性分析

大口黑鲈(Micropterus salmoides)是我国重要的淡水养殖经济鱼类品种,目前包括细菌性疾病在内的诸多因素影响了其养殖业的健康发展。维氏气单胞菌是引起淡水鱼败血症和溃疡综合征的重要病原菌。从患病大口黑鲈肝脏组织中分离到1株病原菌,通过形态学观察、生理生化特性分析、16S rRNA序列和特定毒力基因分析对其进行鉴定,并通过人工回归感染试验和药敏试验分析其致病性和耐药性。结果表明该菌为致病性维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),含有aer、act、lip、fla、gcaT和OMPA I等毒力基因;药敏试验显示其对头孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、强力霉素、四环素、多粘菌素、复方新诺明、左氟沙星等8种抗生素高度敏感,对新霉素、恩诺沙星、庆大霉素、链霉素、阿齐霉素、环丙沙星等6种抗生素中度敏感,对其他8种抗生素具有一定耐药性;人工回归感染实验表明该菌具有较高的致病性,对大口黑鲈的半致死浓度为1.4×10⁶ CFU/mL。维氏气单胞菌是水产养殖中的条件性致病菌,研究结果揭示了该菌株的部分生物学特性,有利于丰富维氏气单胞菌属的基础数据,同时也为鲈鱼养殖过程中的病害防控提供了一定的参考依据。     

中华鳖(Pelodiscus sinensis)摩氏摩根菌(Morganella morganii)的鉴定及致病性研究

从3只患有头面部疖疮中华鳖(Pelodiscus sinensis)的肝脏、肾脏、头面部病灶干酪样组织,分离得到12株细菌。综合菌落形态观察、16S rRNA序列分析与生化特性分析方法,所有分离株均为摩氏摩根菌(Morganella morganii)。稚鳖和小鼠感染试验提示该菌具有较强的致病力,其对小鼠的半数致死量(LD50)为107.24。同时采用常规琼脂扩散(K-B)法进行8类14种常用药物的抗菌敏感性测定,结果表明,分离株对氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类、林可酰胺类、多肽类、喹诺酮类、磺胺类等中的8种药物耐药,对氨曲南、氟苯尼考、头孢哌酮则较为敏感。本研究为中华鳖以头面部疖疮为主要临床特征的摩氏摩根菌病的首例报道,旨在为该病的确诊与防治提供科学依据和参考。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原温和气单胞菌(Aeromonas sobria)分子鉴定及耐药性研究

采用常规生理生化特性测定及16SrRNA、gyrB及rpoD基因同源性检索与系统发育学分析等分子生物学方法,对引起养殖泥鳅大量死亡的病原细菌进行了综合鉴定。生理生化特性结果表明,分离菌株NQ090701与气单胞菌属的温和气单胞菌相近;16SrRNA、gyrB及rpoD基因Blast序列同源性检索与系统发育学分析均与温和气单胞菌相似性最高;综合形态与生理生化特征及16SrRNA、gyrB与rpoD基因的分子特征,确认分离菌株NQ090701为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。同时,采用试管稀释法测定了养殖生产中常用的10种抗菌药物对病原温和气单胞菌的体外最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC),结果表明氟哌酸杀菌作用最好,其次为盐酸沙拉沙星;甲砜霉素和复方磺胺甲恶唑在所试验的药物浓度范围对温和气单胞菌无杀菌效果。     

仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道源乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的分离鉴定及其益生特性分析

利用MRS固体培养基从南移仿刺参肠道中分离得到1株优势乳酸菌,命名为AJC-XP-15,其最适生长温度为30°C,最适生长pH为6.5;其表面疏水性和自聚率分别为34.56%和35.61%,经16S RNA基因序列分析,并结合形态学和生理生化特性将其鉴定为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。拮抗实验结果显示,菌株AJC-XP-15及其发酵上清液对塔氏弧菌(Vibriotubiashii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus, VP)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等病原菌具有很好的抑制作用;体外益生实验表明,菌株AJC-XP-15对人工胃肠液的耐受性很好,在pH3.0的模拟人工胃液处理3 h后的存活率为71.43%,在pH 6.8的模拟人工肠液处理3 h后的存活率为92.1%;抗氧化能力结果显示,菌株AJC-XP-15的无细胞提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除能力最强,分别为(82.67±6.92)%和(15.36±2.95)%,其发酵上清液对超氧阴离子自由基的清除能力最强,为(26.36±...     

南方鲇(Silurus meridionalis)豚鼠气单胞菌溶血素的分离、纯化与致病性研究

采用硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A50凝胶层析法对豚鼠气单胞菌的溶血素进行分离、纯化,获得分子量为32.2kDa的单一多肽溶血素,测定溶血价为25。将该溶血素倍比稀释后梯度接种南方鲇,研究其对南方鲇的致病性和组织病理损伤情况。结果表明:豚鼠气单胞菌溶血素具有较强的毒力,对南方鲇的半数致死剂量(LD50)为0.29mg蛋白/kg体重;病鱼表现为体表褪色,腹部膨大,肝、脾、肾肿大,肝、脾淤血、出血明显;胃肠道内充有大量粘液,黏膜充血、出血;组织病理学表现为骨骼肌水肿、变性,肝细胞变性、坏死,血窦扩张淤血,肾小管上皮细胞变性、坏死,脾脏淋巴细胞减少,胃肠道黏膜上皮变性、坏死,脱落。