产杀虫活性物质海洋放线菌的筛选和初步鉴定

从浙江宁波海域的滩涂泥样中分离到54株海洋放线菌,用卤虫液体测定法进行了杀虫活性菌株的筛选,结果显示多株放线菌具有较高的杀虫活性,菌株XS902,XS904,BL803,BL807对卤虫的ID50高达100以上。同时研究了XS904活性菌株的形态培养特征和生理生化特征,初步鉴定该菌株属于链霉菌属。     

胶州湾海洋链霉菌的初步鉴定及抑菌活性的研究

对从胶州湾沿海泥样和水样中分离、纯化的297株海洋链霉菌进行了初步的生理生化鉴定,并采用牛津杯法检测了对大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas areugi-nosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、八叠球菌(Sarcinasp.)、隐球菌(Crypto-coccal meningitis)、白色念球菌(Candida albicans)、毛霉(Mucor miehei)和链霉菌Tu57(Streptomyces vividochromosenes)8株受试菌的抑制活性。结果表明,约有42.1%的菌株可抑制至少一种受试菌。结合16S rRNA鉴定,提示了部分活性菌株的分类地位,其中M165属于蓝色类群,M245属于白孢类群,M189属于青色类群,M239独立构成一个分支,有可能是新种。结果提示了胶州湾海洋链霉菌在抑菌活性物质研究开发方面的潜力。     

海洋放线菌M313菌株的鉴定及其抗肿瘤活性代谢产物的初步研究

按经典的放线菌分类方法对海洋放线菌M313菌株进行鉴定,用MTT检测法对海洋放线菌M313代谢产物的细胞毒活性与培养基的关系、活性物质的理化性质进行了研究。结果表明,该菌株可初步鉴定为孢杆链霉菌的海洋变种(Streptomycessporovirgulisvar.marinus);该菌株的发酵液对7种肿瘤细胞均具有很强的生长抑制活性,ID50为800～2000;M313菌株在GPDA、高氏一号培养基中均能产生细胞毒性很强的代谢产物;活性物质在pH2～10稳定,但对热不稳定,60℃以上加热处理丧失大部分活性;活性成分可能为分子质量大于2000u的水溶性物质。     

海洋链霉菌M506 的鉴定及代谢产物抑菌活性初步研究

自胶州湾沉积物中分离出海洋链霉菌M506,根据其形态特征观察、生理生化特征试验及基于16S rDNA序列系统进化分析,初步鉴定该菌为灰略红链霉菌.采用不同培养条件对其进行小规模发酵,利用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),大肠杆菌(Escherichia coli),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)四株细菌作为指示菌,检测其抑菌活性.结果表明,该菌株代谢产物粗提物对于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌等具有显著抑制活性.     

热带太平洋活性微生物菌株的筛选和鉴定

从热带太平洋的生物、海水、沉积物样品中分离到细菌、酵母和霉菌共475株．选择8个指示菌并采用圆形纸片法对分离菌株的发酵液进行抗菌和抗肿瘤活性筛选，获得20个具有抗菌和／或抗肿瘤活性的微生物菌株．细菌、酵母和霉菌活性菌株的筛选得率都比较低，分别为5．4％、2．2％和3．4％，其原因可能与纸片的发酵液的添加量较少和菌株发酵条件的控制有关．同时采用分子生物学方法鉴定了活性菌株，除4株未有结果外，其余菌株分归为9个属，其中芽孢杆菌属7株、占活性菌株的35％，盐单胞菌属2株、占10％，其它菌属各1株、占5％．抑菌谱分析表明，大多数活性菌株对革兰氏阳性细菌具有抑制作用，而来源于鱼体的菌株抑菌谱较广，对细菌、真菌均有拮抗作用，另外还发现一株酵母（Rhodosporidium toruloides）可抑制金黄色葡萄球菌．作者提出“活性指示（activity index）”参数，对活性菌株的抗菌谱和活性强度进行综合评估，也表明源于鱼体的菌株的活性指示值较高．这4株芽孢杆菌尤其是DY-Y-11A1A菌株，具有潜在的后续开发价值．     

抗白色念珠菌的海洋来源链霉菌L131的鉴定及活性物质的初步纯化

使用卤化酶简并引物对海洋来源的链霉菌进行了基因筛选,共得到了3株阳性菌株,并发现L131和S077菌株具有抗白色念珠菌活性.其中阳性菌株L131的16S rRNA序列与灰白链霉菌(Streptomyces canescens)DSM 40001T具有99％的相似性,但L131菌株在Bennett培养基上菌落凸起,表面褶皱,产白色孢子和淡黄色可溶性色素,不能以阿拉伯糖、果糖作为惟一碳源,与模式菌株存在着明显差异.L131菌株的抗白色念珠菌活性物质在40℃以下,pH值介于5～10范围内活性稳定,且极性大于乙酸乙酯.以AB-8为吸附树脂,首先使用40％ (V/V)甲醇洗去未吸附的杂质,然后使用100％ (V/V)甲醇进行洗脱,可得到初步纯化的活性物质,其对白色念珠菌的最小抑菌浓度为32.00μg/cm3.上述研究结果可为抗白色念珠菌药物的开发提供参考.     

深圳福田红树林生态中放线菌的筛选及其抗菌活性测定

从深圳福田红树林根际于不同季节采集的3份土样和2份水样中分离得到95株放线菌,94%的放线菌为链霉菌科。测定95株放线菌发酵液对病菌的抗菌活性,82%的放线菌发酵液有不同程度的抗菌作用,对革兰氏阳性细菌(G )的抗菌作用最强。测定其中6株放线菌发酵液对细菌、霉菌和酵母的抗菌活性,各具有不同的抗菌谱:s33,s48和s68具有广谱的抗菌活性;s10和s87只能抑制细菌;s67b不能抑制革兰氏阴性细菌(G-)。s10发酵液的最小抑菌浓度<0.125μL/mL。     

北极放线菌AFN2001培养基和发酵条件的优化实验

从北极王湾地区湖泊沉积物中分离出的菌株AFN2001,其代谢产物对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,抑菌圈直径达23 mm,对大肠杆菌和绿脓杆菌没有抑制作用。为了确定AFN2001菌株发酵获得最多的活性物质,对单因素确定的营养因素淀粉、黄豆浸出物、蔗糖和NaNO3及另外的MgSO4、K2HPO3和水质进行7因素3水平正交优化实验。对结果进行直观分析及方差分析,发现NaNO3对发酵液活性的影响最大,其次依次为淀粉、K2HPO3、MgSO4、黄豆浸出物、蔗糖和水质对发酵液活性的影响;并找出产生活性物质的最佳组合。确定优化培养基(淀粉为10 g、蔗糖为10 g、黄豆浸出物为6 g、MgSO4为0.5 g和自来水为1 000 mL)和优化发酵条件(发酵温度为28℃、起始pH值为6.0和装液量为50%)。利用优化培养基和优化发酵条件发酵的菌株AFN2001,其发酵液的抑菌活性是基础培养基发酵液的1.6倍。     

南麂岛海洋沉积物抑菌真菌的筛选及其代谢产物特性的初步研究

以7种水产病原菌为指示菌,采用菌饼法对分离自南麂岛海域的15个沉积物样品中的78株海洋真菌进行抑菌活性初筛,获得了对至少一种病原指示菌有抑菌活性的菌株19株.采用打孔扩散法对这19株真菌的发酵液进行抑菌活性复筛,共有9个菌株的次级代谢产物对一种或者几种病原指示菌有抑制作用,其中菌株NJ0104的次级代谢产物对除灿烂弧菌...     

抑制尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)南极细菌的筛选及Psychrobacter sp.P4-11-07-1的生长特性

以植物病原真菌尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)为指示菌,采用平板扩散法从实验室极地微生物资源库中筛选到12株具有明显抑菌作用的活性菌株。分子鉴定与系统发育分析表明,7株活性菌株属于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)、3株属于嗜冷杆菌(Psychrobacter)、1株属于假单胞菌(Pseudomonas)、1株属于伦黑墨氏菌(Rheinheimera)。抑菌谱测定结果表明,不同活性菌株的抑菌谱也有所不同,12株活性菌株对尖刀镰孢菌、辣椒疫霉(Phytophthora copsici)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)均有一定的抑制作用,而对葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)均没有抑制作用;除菌株1-Z11,1-Z18,4-Z11,4-Z18,IS-010-07-1,P3-11-10-1,Z18-3外,其余5株菌株均对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)有抑制作用。对一株具有较强抑菌活性的菌株Psychrobacter sp.P4-11-07-1生长条件的研究表明,当培养温度为5～30℃,培养基盐度为0～45,初始pH值为5.0～11.0时,菌株P4-11-07-1均可生长并产生抑菌活性物质,对应抑菌活性最高的培养条件分别是:培养温度为25℃,培养基盐度为0,初始pH为7.0。     

13C示踪技术在利玛原甲藻中腹泻性贝毒合成研究的应用

选取具有显著产毒差异的利玛原甲藻(Prorocentrum lima) SHG株与2XS株为研究对象,以2-¹³C-甘氨酸为示踪原料结合高分辨质谱方法,为腹泻性贝类毒素及其酯化态毒素合成与代谢途径的研究提供新方法和思路。结果表明,两株藻共发现16种腹泻性贝毒及其酯化态毒素成分。对照培养条件下SHG株(大田软海绵酸毒素含量为7.88 pg/cell,鳍藻毒素1含量为4.35 pg/cell)的产毒能力高于2XS株(大田软海绵酸毒素5.70pg/cell),而甘氨酸作为氮源培养条件可显著提高两株藻的产毒总量(P<0.05)。¹³C-甘氨酸标记组与甘氨酸培养组单细胞产毒量无显著变化(P>0.05)。腹泻性贝毒被标记后其同位素异构体丰度发生变化,其中酯化态受¹³C标记的影响程度更高,二级质谱图清晰表示出其碎片离子及脱水峰的标记情况。该方法直观阐明了甘氨酸可作为P. lima标记原料的产毒供体,并使用稳定同位素标记方法首次实现了酯化态的同步标记,有助于腹泻性贝毒生成机制的进一步研究。     

中国西沙群岛底栖甲藻热带库里亚藻(Coolia tropicalis)的形态学、系统发育及毒性研究

库里亚藻(Coolia)是一类广泛分布且具有生物毒性的海洋底栖甲藻。本研究对近年来在中国南海西沙群岛海域采集分离的4株库里亚藻, 通过光镜及电镜下的形态学观察, 并结合基于核糖体大亚基(large subunit, LSU)rDNA(D1-D3)和内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)的序列进行系统发育分析, 鉴定该4个株系为热带库里亚藻(Coolia tropicalis)。在卤虫(Artemia salina)生物毒性试验中, 热带库里亚藻不同株系毒素提取液对卤虫幼虫表现出了毒性差异, XS554株系的48h半致死浓度(LC50)为1.42mg·mL ^-1(约相当于1.1×10 ⁵cells·mL ^-1), 5XS15株系的LC50为1.92mg·mL ^-1(约相当于1×10 ⁵cells·mL ^-1)。     

海藻乙醇提取物抗菌活性的研究

分属绿藻门、红藻门、褐藻门的海藻样品于 2 0 0 0年 5月采于山东青岛和威海附近沿海 ,将海藻样品的乙醇提取物进行薄层层析分离和抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌活性测定。结果表明 ,抗大肠杆菌活性较强的海藻样品有 :鸭毛藻、酸藻、松节藻和孔石莼的水相 ;抗金黄色葡萄球菌活性较强的提取物有 :鸭毛藻、海黍子、松节藻、小粘膜藻的乙酸乙酯相以及酸藻的水相。从不同门类海藻的抗菌活性看 ,褐藻最强 ,红藻次之 ,而绿藻活性最弱。薄层层析分离得到 1 6个层析带具有抗金黄色葡萄球菌活性 ,1 1个层析带具有的抗大肠杆菌性。其中褐藻门的酸藻、海黍子的 3个层析带具有很强的抗金黄色葡萄球菌活性 ,酸藻的 2个层析带也能强烈地抑制大肠杆菌的生长。在同样的实验条件下 ,对常见抗生素进行的对照实验表明 ,这 5条层析带的活性比常见的抗生素高。     

一株耐受高浓度硫酸镁单细胞绿藻的分类学鉴定及单盐胁迫对其生长的影响

在75g/L浓度的硫酸镁溶液中发现了一株生长良好的单细胞绿藻。为了解这株特殊微藻的系统进化学分类地位和潜在利用价值,本文结合了分子系统学方法和形态特征,并测定其不同盐环境下的光合效率,以探讨其对于硫酸镁盐的耐受机理。结果表明,基于该藻株18S及ITS r DNA序列构建的系统进化树确认其隶属于胶球藻属。该株藻细胞为椭圆形、具有较小的长宽比、色素体多为分叶的2瓣和无明显胶被等特征与胶球形胶球藻较接近,系统发育分析显示其与伪胶球藻株系和与地衣Peltigerales共生株系亲缘关系较近。对该藻不同培养条件下的耐受特征做出初步探索,结果表明其对硫酸镁有着独特的单盐抗性,并可以耐受蒸馏水环境。这些特性表明该藻株有良好的抗杂藻污染特性,具有潜在应用前景。     

南麂岛海洋沉积物中抗大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病弧菌的放线菌分离和筛选研究

采用平板涂布法从南麂岛近海海洋沉积物样品中分得86株放线菌,用琼脂块法和杯碟法结合筛选出对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)两种大黄鱼病原性弧菌具有不同拮抗作用的海洋放线菌5株,其中编号NJR0956的菌株对两种致病菌的抑菌圈直径均25mm,表现出较强的抑制作用;进而测定了5株活性菌株的抗菌谱。结果表明,它们对指示菌中的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)四种病原弧菌均具有较好的拮抗作用;在对NJR0956的抑菌效果研究中发现,该菌株在牛肉膏蛋白胨液体培养基中不仅能够增殖,而且能够有效地抑制病原菌的生长。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体新暴发病病原阴沟肠杆菌的分离鉴定

2010 年, 浙江湖州部分罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)育苗场在幼体培育阶段, 暴发 了幼体大规模发病死亡的新病害。从2 个育苗场6 个发病育苗池的发病幼体匀浆液中分离得到6 株 优势生长菌株(编号为NTH01、NTH02、NTH03、316D、316X、316C), 菌落形态较为一致。取代表 菌株NTH01, 以浸泡方式进行人工回感, 结果菌株NTH01 能够导致幼体发病死亡, 且症状与生产表 现一致。经形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA 与gyr B 基因序列系统发育关系构建, 鉴定菌株 NTH01 为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae).以阴沟肠杆菌omp A 基因片段为靶序列, 建立了PCR 检测方法, 对另外5 株优势菌进行检测, 结果该5 株菌都是阴沟肠杆菌。2011 年, 对4 个发病育苗场 幼体与亲虾进行检测, 结果发病幼体中分离的优势菌检测呈阳性, 亲虾肝胰腺与肠道组织检测到该 菌存在, 但亲虾不表现病症。对30 种抗生素的药敏试验结果表明, 菌株NTH01 对恩诺沙星、氧氟 沙星、庆大霉素等6 种抗生素敏感, 对发病幼体进行针对性用药, 效果明显。本试验结果表明, 阴沟 肠杆菌是导致罗氏沼虾育苗期间幼体大规模发病死亡的致病菌。     

牙鲆鱼肠道弧菌感染症及病原特性研究

对一起养殖牙鲆Paralichthys olivaceus病害进行了发病情况、临床表现、病理变化及病原学方面的检验,结果表明为细菌性败血感染症。经过对10尾病(死)牙鲆做病变肝组织及腹水中细菌的染色检查,取其中6尾的肝、肾、腹水为材料做细菌分离与纯培养后进行形态及理化特性测定,选择代表菌株进行16S rRNA基因序列测定及系统发育学分析,结果表明分离做纯培养的12株菌(HQ010223-1至HQ010223-12)为同种细菌———弧菌属Vibrio的鱼肠道弧菌V.ichthyoenteri。经以代表菌株(HQ010223-1)对健康牙鲆做人工感染试验,表明该菌在所检牙鲆病例的相应病原学意义;用37种抗菌类药物对6株菌所做的药敏试验,结果显示在不同菌株间无明显的敏感与耐药性差异。     

副溶血弧菌trh基因的克隆、表达及基因缺失株的构建

利用PCR方法从VP基因组DNA中扩增出trh溶血素基因,构建了大肠杆菌原核表达载体,对trh进行了表达和纯化,经溶血活性检测,复性蛋白具有溶血活性.同时还构建了trh基因缺失株,对trh基因进行了基因敲除研究.结果表明,单独敲除trh基因并不能够影响菌株的溶血活性,说明副溶血弧菌还存在其它溶血素基因.     

金乌贼(Sepia esculenta)蛋白抗氧化肽的酶解制备及活性评价

采用木瓜蛋白酶水解金乌贼(Sepia esculenta)蛋白, 利用超滤、凝胶色谱和反相高效液相色谱从金乌贼蛋白水解物中制备抗氧化肽, 采用氨基酸序列分析仪和质谱(ESI-MS)确定抗氧化肽结构, 采用自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验对多肽抗氧化能力进行评价。结果表明, 金乌贼蛋白经木瓜蛋白酶水解和分离纯化得到1个抗氧化肽(AEH-P3), 经氨基酸序列分析和质谱(ESI-MS)确定其结构为Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM), 分子量为1045.22Da。体外抗氧化实验结果表明: AEH-P3对DPPH自由基(EC50 4.01mg/mL)、羟自由基(EC50 4.66mg/mL)、ABTS自由基(EC50 3.44mg/mL)和超氧阴离子自由基(EC50 6.03mg/mL)具有良好的清除作用, Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)亦显示出了良好的脂质过氧化抑制作用, 可以用于抗氧化相关的功能食品、药物或者食品添加剂。