南大洋深海嗜冷菌2-5-10-1及其低温脂肪酶的研究

从南大洋普里兹湾的水样中筛选到一株产低温脂肪酶的深海嗜冷菌2-5-10-1,对其生长及产酶情况和酶性质做了初步研究.该菌株的最适生长温度为5℃,此时分泌的胞外脂肪酶最多;添加Tween80,橄榄油可显著促进脂肪酶的产生.该脂肪酶的最适作用温度为35℃,在0～20℃均保持较高的酶活性,在0℃可保持37%的相对酶活性;酶的最适作用的pH值为7.5,在pH6～9的范围内均存在较高酶活性;对热较敏感,在60℃保温15min可丧失50%以上的酶活性.该脂肪酶的催化作用不需要金属离子的参与,Cu2+和Zn2+对酶活有着强烈的抑制作用.     

极地产适冷脂肪酶菌株的酶学性质研究

从南北极环境样品中分离到7株产脂肪酶的细菌,经16SrDNA序列分析表明,这些细菌分别属于假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）．采用p-NPP法对这7株细菌所产的脂肪酶进行酶学性质研究,结果显示这些酶的最适作用温度在30～40cC、最适作用pH值在7—8之间,在低温下能保持较高的剩余活力,对热敏感,属于适冷脂肪酶．其中假交替单胞菌（Psychrobacter sp．7342）所产脂肪酶具有低温下酶的剩余活力高、有效作用温度和pH范围广、热稳定性较好及对多种金属离子抗性强等特点．该菌株能利用多种单一氮源和碳源产酶,最适产酶温度为25℃．在此基础上进行正交实验分析得到了该菌株的最佳发酵条件为：蛋白胨和淀粉含量各为1．33％,酵母膏含量为0．3％,温度为25℃．     

低温脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达研究

将已有的低温脂肪酶基因克隆至表达载体pPICZα上,并转化毕赤酵母X-33。在低温条件下诱导培养6d后,发酵液中可检测到低温脂肪酶活力。重组酵母发酵液加入二硫苏糖醇后单位酶活力达到32U/mL,与未加入该试剂的原始菌株相比提高4倍以上。对重组脂肪酶的酶学性质研究表明,其最适pH为8.0,最适温度为35℃,50℃温浴30min后,仍有30.04%的活性。以不同碳链长度的4-Nitrophenyl Ester为底物检测其底物特异性,结果显示其较适合作用于短链底物。重组酵母能够在BMMY培养基中胞外分泌表达带有His标签的重组脂肪酶,经镍柱纯化后,SDS-PAGE检测可得到大约35kDa的单一蛋白质条带。     

南极深海沉积物中产低温脂肪酶菌株的筛选与基因克隆

在10℃恒温培养条件下,从第29次南极科学考察获得的南极深海沉积物样品中分离筛选到产脂肪酶细菌3株,产脂肪酶真菌1株,对其进行分子生物学鉴定,确定为假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas arctica）、芽孢杆菌属（Bacillus pumilus）、Glaciecola sp.以及白冬孢酵母属（Leucosporidium sp.）.通过测定各酶的最适反应温度,获得产低温脂肪酶芽孢杆菌XZ18,该菌所产脂肪酶最适反应温度为30℃,在0℃仍有部分活性.从NaCl浓度和pH值2个条件对产酶条件进行研究,最终确定了该菌最适产酶NaCl浓度5.0%、最适产酶pH值为6,最高产酶量为4.65 U/cm3.通过PCR扩增,获得了脂肪酶全长序列,对该序列进行系统发育分析,发现该脂肪酶基因处于较独立的分支.     

Screening of protease-producing marine yeasts for production of the bioactive peptides

Over 400 yeast strains from seawater and sediments were obtained, but only five strains named HN2 -3, N13d, N13C, Mb5 and HN3 - 2 among them could form clear zones around their colonies on the double plates with 2.0% casein. Peptides in the hydrolysate produced by the proteases from strains HN2 -3 and N13d had higher angiotensin I-converting-enzyme （ACE）-inhibitory activity. The two marine yeast strains were identified to be Aureobasidium pullulans according to the results of routine yeast identification and molecular methods. After purification of the proteases from the two marine yeast strains, it was found that the optimal pH for them was both 9.0, both of them were serine alkaline protease. However, the optimal temperature for the protease from the strain HN2 -3 was 52℃ while that from strain N13d was 48℃. ACE-inhibitory activity of the peptides in the hydrolysate of shrimp protein produced by the purified protease from the strain HN2 -3 was the highest while antioxidant activity in the hydrolysate of spirulina protein produced by the purified protease from the strain N13d was the highest.     

产碱性纤维素酶海洋细菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

用CMC平板筛选方法,从青岛近海海域海水中分离出一株产碱性纤维素酶的海洋菌株QM11,经16S rDNA鉴定,该菌株为Cytophaga fucicola.对该菌的生物学特性研究表明,其最适生长温度为27℃,生长温度范围为4～48℃,为耐冷菌;在pH7.0～8.0、含3.0%NaC1的培养基条件下,最适宜菌株生长和产酶;QM11所产碱性纤维素酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为9.0,在碱性条件下具有较高的酶活性和较好的稳定性.Mn2+、Fe3+对酶反应具有促进作用,Cu2+、Pb2+对酶反应具有抑制作用.     

印尼热泉中产嗜热碱性蛋白酶菌株筛选及酶学性质研究

采用MSM寡营养培养基从印度尼西亚Pantai cermin,Kalianda和Banyuwedang三个地区的热泉水样、泥样以及沉积物样品中分离获得细菌菌株,通过检测蛋白酶产生透明圈和福林酚蛋白酶活性测定相结合的方法,从中筛选出1株产嗜热蛋白酶的菌株PBI,该菌株经初步鉴定为短杆菌属(Brevibacillus),并对其酶学性质进行了研究。结果表明,菌株PBI产蛋白酶的最适酶活温度为60℃,最适pH值为8.0～9.0,具有较好的热稳定性和pH稳定性,60℃时酶的半衰期为30min,70℃条件下20min仍保持46.1%的酶活,该酶在pH值为5.0～9.0范围的缓冲液中酶活相对稳定。其产嗜热蛋白酶的酶活力最高可达到60.53U/mL,在100℃条件下仍能保留26.37%的相对酶活。Fe2+,Fe3+,Cu2+和Zn2+对嗜热蛋白酶活性具有明显的抑制作用。该嗜热蛋白酶对EDTA敏感,苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑酶肽(Leupeptin)、苄眯(Benzamidine)和胃蛋白酶抑制剂(Pepstain A)对该嗜热蛋白酶都有一定的抑制作用,说明其酶活性受到丝氨酸、半胱氨酸残基的影响。结果表明,该菌株是1株具有进一步改造利用价值的产蛋白酶菌株。     

深海细菌Pseudomonas sp.bIp-2黑色素生成条件研究及其hppD基因的克隆

从大西洋深海沉积物中分离得到1株产黑色素细菌b Ip-2,16S rRNA基因序列分析表明该菌隶属于假单胞菌属（Pseudomonas）,与施氏假单胞菌（P.stutzeri）有最高的16S rRNA基因序列相似性（99%）.进一步对该菌的生长及产黑色素条件进行了初步研究,结果表明b Ip-2在稳定生长期后期才开始大量积累黑色素;b Ip-2可在4～37℃的温度范围下生长,最适生长温度为37℃,在28℃具有最高的黑色素产量;b Ip-2生长的pH范围偏碱性,在p H=7的最适生长条件下黑色素产量最高,同时碱性环境有利于黑色素的快速形成;b Ip-2可以在1%～9%的NaCl浓度范围中生长,在5%的NaCl浓度下具有最高的黑色素产量;低浓度的Fe^2＋（0.05 mmol/dm^3）可以提高黑色素的产量,Fe^2＋浓度≥0.20 mmol/dm^3时明显抑制黑色素的生成,而Fe^2＋浓度为1.00 mmol/dm^3时可完全抑制菌株的生长;低浓度的Cu^2＋（0.1 mmol/dm^3）对黑色素的产量无明显影响,Cu^2＋浓度≥0.5mmol/dm^3时可抑制黑色素的生成,而Cu^2＋浓度超过1.0 mmol/dm^3时可完全抑制菌株的生长.通过PCR扩增获得菌株b Ip-2的对羟苯基丙酮酸双加氧酶（hydroxyphenylpyruvic acid dioxygenase,HPPD）全长基因（1087 bp）,分析发现其编码的HPPD蛋白序列（含361氨基酸）与来自菌株Pseudomonas stutzeri RCH2的HPPD蛋白序列具有最高的同源性（序列相似性为97%）.这些结果为深入研究该细菌所产黑色素的合成,应用及生态作用奠定了基础.     

抑制尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)南极细菌的筛选及Psychrobacter sp.P4-11-07-1的生长特性

以植物病原真菌尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)为指示菌,采用平板扩散法从实验室极地微生物资源库中筛选到12株具有明显抑菌作用的活性菌株。分子鉴定与系统发育分析表明,7株活性菌株属于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)、3株属于嗜冷杆菌(Psychrobacter)、1株属于假单胞菌(Pseudomonas)、1株属于伦黑墨氏菌(Rheinheimera)。抑菌谱测定结果表明,不同活性菌株的抑菌谱也有所不同,12株活性菌株对尖刀镰孢菌、辣椒疫霉(Phytophthora copsici)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)均有一定的抑制作用,而对葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)均没有抑制作用;除菌株1-Z11,1-Z18,4-Z11,4-Z18,IS-010-07-1,P3-11-10-1,Z18-3外,其余5株菌株均对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)有抑制作用。对一株具有较强抑菌活性的菌株Psychrobacter sp.P4-11-07-1生长条件的研究表明,当培养温度为5～30℃,培养基盐度为0～45,初始pH值为5.0～11.0时,菌株P4-11-07-1均可生长并产生抑菌活性物质,对应抑菌活性最高的培养条件分别是:培养温度为25℃,培养基盐度为0,初始pH为7.0。     

可口革囊星虫Phasolosma esculenta体腔液的抗菌活性研究

可口革囊星虫Phasolosma esculenta为我国特有的一种可食用海洋经济动物。本文以可口革囊星虫为研究对象,利用琼脂径向扩散、涂板计数等方法研究其体腔液中物质的抗菌活性以及理化特性。研究结果表明,可口革囊星虫体腔液中存在抗菌活性物质,并且该物质对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus等3种革兰氏阳性细菌具有明显的抗菌效果,但对大肠杆菌Escherichia coli等3种革兰氏阴性细菌以及葡萄牙假丝酵母Candida lusitaniae抗菌效果不明显。结果还发现:(1)不同提取方式出现明显不同的抗菌效果,与体腔液上清液和2%乙酸提取体腔液所得提取物的抗菌效果相比,超声破碎处理提取物的抗菌效果最为明显。(2)理化特性研究发现该抗菌物质抗菌效力持久,抗冻融,并且在5~30 ℃范围内最适抗菌温度约为25 ℃;该物质不耐高温,60 ℃处理10 min后该物质的抗菌作用完全消失;此外,该物质的抗菌作用不依赖金属离子的存在。(3)超滤管过滤截留琼脂扩散结果表明该抗菌物质的分子量在100 kDa以上。     

海藻工具酶研究Ⅱ.褐藻酸酶的制备、性质及对裙带菜细胞的解离研究

褐藻酸降解菌埃氏交替单胞菌(Alteromonas espejiana)菌株Al01,通过发酵培养制备褐藻酸酶.该酶作用的最适pH为7.0,最适温度为40℃,最适底物浓度为1%～2%;在离子浓度为0.5mmol/dm3时,Mn2+对酶促反应稍有促进作用,Ca2+、Hg2+则有明显的抑制作用.该酶用于裙带菜单细胞和原生质体解离时,以酶液组成为褐藻酸酶1%、纤维素酶1%,45×10-3的NaC1为渗透剂,酶解温度25℃,pH7.0,酶解3-4h效果最好.     

南极菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13引导糖基转移酶基因表达对环境因子变化的响应

为了探讨胞外多糖在南极微生物低温适应性中的作用与机制,克隆了南极菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13的引导糖基转移酶(GTF)核心片段,并采用Real-Time PCR的方法研究了温度、冻融循环、盐浓度、pH等条件对该糖基转移酶基因(gtf)表达的影响。结果表明,低温有利于gtf的表达,短时的低温刺激(2℃)1 h后,gtf的表达量即上调为对照的1.5倍;而该菌经4和10℃培养24 h后gtf的表达量约为20℃时的8~12倍;经过冻融循环gtf的表达量上调,在第2个冻融循环后gtf 的表达量较对照提高了3.667倍;盐浓度对gtf的影响表现为低促高抑,即NaCl含量为6.0 %时gtf 的表达量是对照(3.0%)的3.59倍,当NaCl含量达9.0 %时gtf 表达量则显著下调;在一定范围内(pH5.0~8.0),pH的改变会促进gtf 的表达,当pH为6.0时gtf 表达量约为pH7.0时的2倍。该结果为探讨胞外多糖在南极微生物环境适应性中的作用与机制提供了科学依据。     

一株生防细菌LHB02的筛选、鉴定及其发酵条件优化(英文)

从中国福建沿海某一污染滩涂的沉积物中筛选到一株具有较强拮抗水产病原菌的生防细菌LHB02。采用通用引物,对LHB02的16SrRNA片段进行扩增,获得1511bp的DNA系列,基于该DNA系列,结合细菌形态学、生理生化特征,鉴定LHB02为一株枯草芽孢杆菌。对LHB02进行了抗菌试验、抗菌谱检测和发酵条件优化研究,结果表明,LHB02对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌等有很强的拮抗作用,其优化后的发酵条件为:KB培养基(蛋白胨20g,丙三醇10mL,K2HPO41.5g,MgSO4.7H2O1.5g,H2O1000mL);温度28°C,pH值7.0,培养时间36h,接种量1.5%。     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆CAPRO2的筛选及酶学性质分析

利用选择性筛选培养基从所构建的深海沉积物宏基因组文库中筛选得到一株产蛋白酶的克隆（CAPR0002）,对其进行了酶学性质分析．结果表明该酶的最适作用温度为65cc,最适作用pH值为9．0．该蛋白酶具有较好的热稳定性,在40cC以下的温度中可长期保持稳定,在50℃中处理6h后仍能保持60％的活力,在60℃下保温30rain后仍能保持约60％的活力．Ca^2＋、Mg^2＋、sr^2＋、co^2＋对该蛋白酶有明显的促进作用,而且ca^2＋的存在可明显提高该蛋白酶的热稳定性,ca^2＋、sr^2＋、c0^2＋这3种离子均在3．0mmol／dm^3。浓度时具有最高的促进作用,当浓度高于3．0mmol／dm’时,这3种离子对酶活力的促进作用减弱．Hg^2＋、Fe^2＋、cu¨对酶有明显的抑制作用．CAPR02蛋白酶在pH值为7。5～9．5时活力较高,pH值为7。5时可保持约80％的活力,pH值为9．5时保持60％的活力,而在pH值高于9．5的条件下酶活力下降较快,pH值为10．0时活力降为约15％,表明CAPR02属于碱性蛋白酶．丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、E一64和AEBSF对CAPR02蛋白酶均无抑制作用,显示该酶不属于丝氨酸蛋白酶,而EDTA对酶有明显的抑制作用,表明该酶属于金属蛋白酶．     

海洋脂肪酶ADM47601固定化方法的研究

采用海藻酸钠、壳聚糖、聚乙烯醇和明胶等材料, 进行对脂肪酶ADM47601的固定化研究。结果表明, 使用壳聚糖固定化脂肪酶, 在最优条件为2% (W/V)壳聚糖, 10% NaOH, 1%乙酸, 0.25%戊二醛, 每克载体添加840U脂肪酶时, 最大固定化酶活力回收率为87.06%。使用海藻酸钠-明胶固定化脂肪, 在最优固定化条件下, 最大固定化酶活力回收率为54.45%。使用聚乙烯醇固定化脂肪酶, 在最优固定化条件下, 最大固定化酶活力回收率为33.22%。使用海藻酸钠固定化脂肪酶, 在最优固定化条件下, 最大固定化酶活力回收率为17.11%。对比四种不同固定化酶方法, 脂肪酶活力回收率高度高低顺序为: 壳聚糖吸附交联法>海藻酸钠明胶协同包埋法>聚乙烯醇-硼酸法>海藻酸钠包埋法。     

南极菌Pseudoalteromonas sp. A211-5产α-淀粉酶Amy3809的表达、性质及其降解特性

对具有高淀粉酶活性的南极菌Pseudoalteromonas sp. A211-5的全基因组数据进行了分析和筛选,筛选获得α-淀粉酶疑似序列amy3809,并采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行验证和分析。首先,以淀粉酶Amy3809的完整开放阅读框(ORF)为模板设计特异引物,克隆获得amy3809的全序列并对其进行重组表达,获得的重组蛋白采用镍柱进行分离纯化;DNS-还原糖法测定重组酶的酶学性质;薄层层析(TLC)技术对Amy3809的酶解产物进行分析。实验结果:1)克隆获得的amy3809成功地连接到pET-30a载体,并在工程菌E.coli BL21(DE3)中实现了高效表达,纯化的重组酶Amy3809分子量为67 kDa;2)重组酶Amy3809在10~40℃的范围内仍能保持85%以上的酶活,但随着温度的升高酶活迅速降低,70℃时几乎失活,表明该酶具有良好的低温耐受特性及热敏感性;3)最适pH为7.0,在pH 5.0~10.0的范围内仍能保持50%以上的活性;4)金属离子Na+,K+和Ca2+均能提高Amy3809的活性,而Cu2+,Fe2+,Mg2+和EDTA则能显著降低Amy3809的活性;5)Amy3809的酶解产物主要为麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。由此可知,南极菌产的α-淀粉酶Amy3809,具有良好的低温耐受特性,热敏感性和较广的pH耐受范围,并能够有效地将淀粉降解为低聚糖和葡萄糖,因而具有潜在的工业应用前景。     

致病性副溶血弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法测定了12株弧菌的形成生物膜的效果,选择形成生物膜效果最好的副溶血弧菌ND-02,进一步研究了环境因子对其生物膜形成的影响。实验结果显示副溶血弧菌ND-02菌株在静置培养24～36 h后形成成熟的生物膜,在起始菌浓度为107～108CFU/mL形成生物膜的量最大;在30℃,NaCl浓度为3%～5%,pH偏弱碱性时的生物膜OD590值最大;C 2a+促进副溶血弧菌生物膜的形成,而M 2g+抑制生物膜的形成;副溶血弧菌在分别经大黄鱼表皮黏液、肠黏液和肝脏提取液包被的的基质上形成生物膜的作用明显,鳃黏液和脾脏提取液中次之,肌肉提取液包被后生物膜形成量最低。以上结果表明,副溶血弧菌ND-02菌株能形成稳定而明显的生物膜,而且生物膜的形成受温度、NaCl浓度、pH值等环境因子的影响。     

温度和pH对刺参(Apostichopus japonicus)消化酶活力的影响

消化酶活力能够反映刺参对不同营养成分的消化能力。当某一反应条件发生改变时,消化酶的活力大小就会发生变化,因此研究不同因子对消化酶活力的影响对于了解消化酶的性质具有重要的意义。温度和pH是影响消化酶活力的最重要的反应条件。本文中作者应用酶学分析研究了温度和pH对剌参前肠和中肠各种消化酶活力的影响。蛋白酶活力测定采用福林-酚法,脂肪酶活力测定采用水解法,淀粉酶活力和纤维素酶活力测定采用水杨酸显色法。实验结果表明,反应温度和反应pH对刺参前肠和中肠中的消化酶活力具有显著影响(P<0.05)。前肠和中肠中蛋白酶活力均在反应温度为50℃时达到最大值,前肠和中肠中脂肪酶和纤维素酶均在反应温度为40℃时达到最大值,而前肠和中肠中淀粉酶最适反应温度分别为40℃和30℃。刺参前肠蛋白酶活力在酸性环境下较中肠高,且在反应pH为5.0—5.8之间酶活力相对稳定,而中肠蛋白酶活力在碱性环境下较前肠高,且在反应pH为7.0—8.6之间酶活力相对稳定;刺参前肠脂肪酶活力随着pH的升高出现两个相对稳定的峰值,分别为4.2—5.0和6.2—7.0区间,中肠脂肪酶活力在pH为3.8时达到最大值,而在pH超过9.0明显失活:剌参前肠和中肠淀粉酶活力在pH变化时表现出相似的变化趋势,在反应pH为6.6—7.4之间酶活力较高且相对稳定;剌参前肠和中肠中纤维素酶活力在pH变化时反应不一致,前肠淀粉酶在反应pH为6.2—7.4之间酶活力较高且相对稳定,中肠纤维素酶活力在反应pH为5.4—7.0之间酶活力较高且相对稳定。此外,通过比较四种消化酶比活力值的大小,可以看出剌参蛋白酶活力最高,其次为纤维素酶和淀粉酶活力,而脂肪酶活力最低。     

不同温度条件下褐菖鲇幼鱼的耗氧率和排氨率

利用静水密闭式呼吸仪,测定了不同温度（10、12、……、30℃）条件下褐菖鼬（Sebastiscus marmoratus）幼鱼耗氧率和排氨率变化．结果表明,温度对幼鱼耗氧率和排氨率均有显著影响（P〈0．05）．温度10～30℃,幼鱼耗氧率、排氨率变化范围分别为0．02～0．30mg／（g·h）和2．64～10．01ug／（g·h）,温度26、16℃时耗氧率和排氨率分别上升至峰值,分别为最小值10℃组的15．00、3．79倍;温度（F）对幼鱼耗氧率R0[mg／（g·h）]和排氨率RN[ug／（g·h）]的影响可分别用多项式表示：R0=-2．00×10^-5 T4＋1．50×10^-3 T3-3．69×10^-2 T2＋0．3978T-1．5376,R2=0．988和RN=3．00×10^-5 T6 -4．00×10^-3 T5＋0．1996 T4-5．1111T3＋70．817T2-501．10T＋1415．80,R2=0．964;幼鱼的氨熵变化范围为0．02～0．19,其蛋白质供能比变化范围为5．64％～56．65％,平均蛋白质供能比为22．56％;各温度跨度代谢率Q10值均值为4．02,18～28℃代谢率Q10值为2．81±0．09与鱼类平均Q10值较接近;各温度跨度组排泄率Q10均值为0．93,对比同一温度跨度组代谢率和排泄率Q10值,代谢率Q10值均大于排泄率Q10值两倍以上,最大组间相差达7倍．因此,幼鱼能量消耗的供能物质以脂肪和碳水化合物为主,蛋白质为辅．此外,温度变化对幼鱼代谢的影响程度明显大于对排泄的影响,且其适宜生长温度为18～28℃．     

钝缀锦蛤(Tapes dorsatus)稚贝的温度和盐度耐受性研究

本实验在室内控制条件下,采用实验生态学方法研究了钝缀锦蛤(Tapes dorsatus)稚贝对温度和盐度的耐受性.在温度耐受性方面:(1)稚贝在低温端温度为4℃、6℃、8℃、10℃时保持90％～100％存活的时间分别为0?d、2?d、3?d、7?d;在高温端温度为33℃、34℃、35℃、36℃时保持90％～100％存活...