海洋琼胶降解细菌的筛选及HQM9琼胶酶研究

对红藻门江蓠和石花菜的共附生的琼胶降解细菌进行了系统的分离,共筛选得到琼肢降解细菌25株,选择其中有代表性的15株进行了分子鉴定,鉴定结果表明这些细菌主要分布在Agarivorans,Cellulophaga,Alteromonas,Saccharophagus,Glaciecola,Vibrio六个属中,另外初步判定...     

白色噬琼胶菌QM38β-琼胶酶基因agaD02 的克隆与表达

从白色噬琼胶菌(Agarivorans albus)QM38基因组中扩增到一段编码β-琼胶酶的DNA序列,命名为agaD02。序列相似性分析的结果表明,基因agaD02和弧菌Vibrio sp.JT0107及Vibrio sp.PO-303的琼胶酶基因具有同源性,其相似性程度分别为98.7%和97.4%,而同GenBank中的其他序列同源性很低。对此基因的序列进行了分析,结果表明,其开放阅读框长度为2 868 bp,编码的蛋白质包含955个氨基酸,在蛋白数据库中的编号为ABM90422,推测其分子质量为106 ku,等电点为4.87。利用网上数据库资源和生物学软件对预测的琼胶酶蛋白序列进行了同源性分析和结构分析。设计两端含酶切位点的特定引物,克隆agaD02基因,构建入表达载体pET24a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),转化后提取质粒进行酶切和电泳验证,转化后的大肠杆菌经诱导可产生胞外琼胶酶。     

4株琼胶降解菌的分离、鉴定及产酶条件分析

从海藻及海参中分离筛选得到4株琼胶降解菌HD、JL、QJ和HS,均为革兰氏阴性菌,确定了它们发酵产酶的最佳条件均为：2216E海水培养基、初始 Ph 7.5、琼胶底物浓度0.30%、培养温度28℃、培养时间36 h。大部分酶分泌到细菌细胞外。生理生化检测、16SrDNA序列同源性及聚类分析结果表明, HD、JL、HS为白色噬琼胶菌(Agarivorans albus);QJ的16SrDNA序列与Simiduia sp.,糖噬胞菌属( Saccharophagus sp.)和船蛆杆菌(Teredinibacter sp.)的相似性为93%~94%,在进化树上单独形成一个分支,但生理生化特征与它们有所不同,分类地位需要进一步确定。从HD、JL和HS中能克隆到β-琼胶酶基因,它们与其他物种的β-琼胶酶基因序列的相似性为97%~98%。     

厦门沿岸海域杂色鲍中产琼胶酶菌株的筛选及其酶学性质的研究

琼胶酶在食品工业中的多糖降解中有着重要的作用,其经济价值日益凸显,从海洋生物中筛选琼胶酶菌株是获得琼胶酶的一种重要途径.从厦门沿岸海域养殖杂色鲍鱼体内分离得到5株产高效琼胶酶的菌株,其中最高的酶活力达到133.5 U/dm3.经16S rRNA序列分析表明这5株菌株分别属于弧菌属（Vibrio）和假交替单胞菌属（Pseudoa lteromonas）.采用DNS法对这些菌株所产的琼胶酶进行酶学性质研究,结果显示这些酶的最适作用温度均为50℃,最适作用pH值为7.0;Na＋可使A017菌株所产的琼胶酶酶活力提高5倍,Fe2＋对A007、A008、A010、A021菌株所产的琼胶酶酶活力有明显的抑制作用.     

龙须菜UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆及其表达与琼胶产量的关系

对红藻龙须菜(Gracilarialei maneiformis)UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的表达与不同藻株中藻体琼胶产量之间的相关性进行研究。通过PCR扩增的方法得到了龙须菜UGPase的基因序列。该基因cDNA序列的全长为2 200 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸;龙须菜UGPase基因的氨基酸序列与其它物种的UGPase氨基酸序列相似性较高;该基因是单拷贝的,缺乏内含子;具有特殊的加尾信号。利用荧光实时定量PCR的方法检测UGPase基因相对表达量。结果表明,该基因的表达与琼胶含量存在显著相关性,即在高琼胶组藻株中的表达量显著高于低琼胶组藻株,对琼胶含量高低具有指示作用,显示了在产业化应用中的潜能。     

龙须菜UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆及其表达与琼胶产量的关系

对红藻龙须菜(Gracilaria leimanei formis)UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的表达与不同藻株中藻体琼胶产量之间的相关性进行研究.通过PCR扩增的方法得到了龙须菜UGPase的基因序列.该基因cDNA序列的全长为2 200 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸;龙须菜UGPase基因的氨基酸序列与其它物种的UGPase氨基酸序列相似性较高;该基因是单拷贝的,缺乏内含子;具有特殊的加尾信号.利用荧光实时定量PCR的方法检测UGPase基因相对表达量.结果表明,该基因的表达与琼胶含量存在显著相关性,即在高琼胶组藻株中的表达量显著高于低琼胶组藻株,对琼胶含量高低具有指示作用,显示了在产业化应用中的潜能.     

琼胶降解菌F-6筛选、培养条件及对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)细胞解离作用的研究

利用琼胶作为唯一的碳源从青岛太平角海域的海水和红藻样品中筛选分离得到一株高产琼胶酶的海洋菌F-6,对其最适的产酶条件,利用琼胶酶分离条斑紫菜的原生质体和原生质体的培养进行研究。结果表明,通过单次单因子和正交实验确定琼胶降解菌株F-6最适产酶培养基配方为(W/V):琼胶0.7%;酵母粉0.3%;蛋白胨0.5%;NaCl2.0%;K2HPO40.1%;CaCl20.02%;MgSO4·7H2O0.05%;FeSO4·7H2O0.002%;起始pH=7.5,最适的发酵产酶条件为:26℃培养36h。经条件优化后,粗酶液的酶活高达631.6U/ml。发酵液经过6000g离心30min得到粗酶液,粗酶液经过8k分离膜超滤,加入1mol/L渗透剂,0.22μm滤膜过滤除菌后降解条斑紫菜组织块,成功地分离得到大量的紫菜原生质体,其产率为3×106个原生质体/g新鲜紫菜组织。原生质体经初步培养发育成愈伤组织,其成活率为60%。     

南极菌Pseudoalteromonas sp. A211-5产α-淀粉酶Amy3809的表达、性质及其降解特性

对具有高淀粉酶活性的南极菌Pseudoalteromonas sp. A211-5的全基因组数据进行了分析和筛选,筛选获得α-淀粉酶疑似序列amy3809,并采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行验证和分析。首先,以淀粉酶Amy3809的完整开放阅读框(ORF)为模板设计特异引物,克隆获得amy3809的全序列并对其进行重组表达,获得的重组蛋白采用镍柱进行分离纯化;DNS-还原糖法测定重组酶的酶学性质;薄层层析(TLC)技术对Amy3809的酶解产物进行分析。实验结果:1)克隆获得的amy3809成功地连接到pET-30a载体,并在工程菌E.coli BL21(DE3)中实现了高效表达,纯化的重组酶Amy3809分子量为67 kDa;2)重组酶Amy3809在10~40℃的范围内仍能保持85%以上的酶活,但随着温度的升高酶活迅速降低,70℃时几乎失活,表明该酶具有良好的低温耐受特性及热敏感性;3)最适pH为7.0,在pH 5.0~10.0的范围内仍能保持50%以上的活性;4)金属离子Na+,K+和Ca2+均能提高Amy3809的活性,而Cu2+,Fe2+,Mg2+和EDTA则能显著降低Amy3809的活性;5)Amy3809的酶解产物主要为麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。由此可知,南极菌产的α-淀粉酶Amy3809,具有良好的低温耐受特性,热敏感性和较广的pH耐受范围,并能够有效地将淀粉降解为低聚糖和葡萄糖,因而具有潜在的工业应用前景。     

壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶性质研究

为构建高效表达壳聚糖酶工程菌株,以Microbacteriumsp.基因组为模板扩增壳聚糖酶基因,目的基因与表达载体pINA1317连接构建重组质粒,重组质粒NotⅠ酶切线性化后转化解脂耶氏酵母Y.liPolytica Po1h。所得结果为PCR扩增得到约1000bp的特异性片段,序列分析表明含有壳聚糖酶全长基因,开放阅读框801bp,编码266个氨基酸残基。转化子酶活力为10.4U/mL,是原菌株酶活力的3.15倍。重组蛋白经DEAE-Sepharose FF分离纯化,达到电泳纯,SDS-PAGE显示单一条带,分子量约41kDa。重组酶反应最适温度为45℃,最适pH为5.6,Km和Vmax分别是0.926mg/mL和6.15U/mL。质谱分析酶解产物主要为三糖和五糖。实现了壳聚糖酶在解脂耶氏酵母中的分泌表达,为壳聚糖酶的工业化生产奠定了理论基础。     

北冰洋海单胞菌β-D-半乳糖苷酶的异源表达及酶学特性研究

初筛表明,一株分离自北极加拿大海盆海冰心芯样品的海单胞菌(Marinomonas sp.BSi20584)具有较高的β-D-半乳糖苷酶活性,为了研究清楚其酶学性质,将经hiTAIL-PCR扩增得到的β-D-半乳糖苷酶基因(galt)与pET-28a(+)原核表达载体结合,转入大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后对重组β-D-半乳糖苷酶(GALT)的表达条件进行了优化,采用金属螯合亲和层析技术制备纯酶,并对重组GALT的酶学性质进行了研究。结果显示,重组酶的最适诱导温度为20℃,在IPTG浓度为0.07mmol/L时诱导22h后,酶活和产酶量达到最大值。GALT单体分子量约为6.6×104 g/mol,天然酶为同源三聚体。GALT最适作用温度为35℃,其热稳定性较好,在60℃处理5h后,仍可保持50%以上的相对活性。GALT的最适作用pH为9.0,在pH为6.0~11.0范围内比较稳定。GALT的最适NaCl浓度为0.5mol/L,对盐度具有较高的耐受性。Mg2+、K+、DTT和EDTA对酶活不具有显著影响,而Mn2+、Fe2+对酶活有促进作用,Zn2+和L-谷胱甘肽对酶活有抑制作用。GALT对Galβ1-4GlcNAc具有水解作用,而对Galβ1-3GalNAc和Galβ1-3GlcNAc糖苷键型没有水解能力。本研究实现了海单胞菌属菌株的β-D-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌系统中的高效表达,并系统研究了重组酶的酶学特性,为后续开展该酶的代谢适应性和潜在应用研究提供详细的酶学数据基础。     

hoxY基因的克隆及其在节旋藻和螺旋藻系统学研究的应用

从节旋藻属5个品系和螺旋藻属1个品系中克隆了hoxY基因的部分序列.序列长度都是479bp.在节旋藻中该基因GC含量为46.0%～46.6%,螺旋藻中为43.5%.节旋藻各品系间序列的相似性介于93.7%～100%,明显高于节旋藻属和螺旋藻属间的序列相似性（69.5%～72.2%）.2个属中镍铁氢化酶小亚基HoxY氨基酸序列的比较也表明螺旋藻和节旋藻之间存在较大差异.利用MEGA2通过比较核酸序列构建了系统树,表明螺旋藻和节旋藻属处于不同的分枝.     

大菱鲆免疫球蛋白轻链IgL全长cDNA的分离、鉴定及表达分析

实验采用末端快速扩增(RACE)技术从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选得到了免疫球蛋白轻链IgL的全长cD-NA片段。该序列包含47 bp的5′末端非编码区(5′UTR),738 bp的开放阅读框(ORF)和202 bp 3′UTR,整个开放阅读框编码246个氨基酸。系统发生分析表明大菱鲆IgL基因与五条鰤的IgL基因起源关系最近。RT-PCR分析表明,大菱鲆IgL基因只在正常脾脏、肾脏和头肾组织中表达;IgL在大菱鲆胚胎发育细胞期就已开始表达,在大菱鲆胚胎尾芽期和体节期表达持续增强;在鳗弧菌感染大菱鲆脾脏和头肾早期均检测到IgL基因强烈表达,后期表达逐渐减弱;大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染48h后,IgL开始表达。这些结果均表明IgL基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤,从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到碱性磷酸酶,SDS-PAGE显示为单一条带,提纯倍数为14.42,比活力达到131.08U/mg。酶学性质研究表明:该酶亚基分子量约44kD,最适反应温度为45℃,最适pH值为9.0,米氏常数Km为0.098mmol/L,最大反应速度Vmax为1.01μmol/(mL·min)。Ca2+、Mg2+对酶活力表现出显著的激活作用。     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因克隆、分析及叶绿体表达载体构建

β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶。根据GenBank中所收录的雨生红球藻BKT的cDNA序列设计特异性引物,以高光照处理的雨生红球藻细胞的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法克隆出了β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)。序列测定结果表明,bkt全长960bp编码320个氨基酸。克隆的bkt序列与GenBank收录的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一个碱基。并对其编码的氨基酸进行了二级结构的预测和疏水性分析。同时将所克隆的bkt构建入衣藻叶绿体表达载体p64Dbkt,为基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。     

藻红蛋白基因部分序列的克隆和顺序分析

报道了真核红藻—龙须菜的藻红蛋白亚基基因的部分序列,位于β亚基的近碳端、α亚基的近氮端,包括β亚基部分３０９个核苷酸,α亚基部分１６２个核苷酸,还有间隔部分５５个核苷酸,可编码β近碳端的１０２个氨基酸和α近氮端的５４个氨基酸,并与目前已知的相应序列做了比较。该序列与已知红藻ＰＥ亚基基因相应部分的相似性为７７．９％到８１．１％。对应的氨基酸序列的相似性为７９．５％到８６．５％,蛋白质序列的保守性高于核苷酸序列。     

微拟球藻硫脂酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)基因组序列注释的硫脂酶基因(NoTE)长1 314bp,其编码的硫脂酶长437氨基酸,与其他物种硫脂酶序列相似性较低。为验证其功能,将NoTE克隆到原核表达载体pET-30a上并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测到预期大小的蛋白质条带。气相色谱(GC)分析显示,表达NoTE未改变大肠杆菌脂肪酸种类,但改变了其总脂肪酸含量和脂肪酸比例,其C14∶1、C16∶0、C16∶1、C18∶1及总脂肪酸含量较不含重组质粒菌株分别提高了11%、18%、32%、49%和30%。研究结果证明了克隆的硫脂酶基因能在大肠杆菌中表达并具有相应的酶活性。     

致病性鳗弧菌W-1外膜蛋白ompU基因克隆及在大肠杆菌中的表达

从致病性鳗弧菌W-1基因组DNA扩增并克隆了1 156bp的特异性片段,含有完整的外膜蛋白ompU基因阅读框,由993个核苷酸组成,编码330个氨基酸残基的蛋白质。与国外已发表的鳗弧菌外膜蛋白基因的序列同源性为100%,与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的序列同源性分别为72%,69%,68%和64%。将该外膜蛋白基因克隆于pBV220表达质粒,在大肠杆菌中得到了表达,SDS-PAGE分析表明表达蛋白分子量约38kDa,Western blot分析发现表达蛋白能与鳗弧菌外膜蛋白抗体很好的反应。     

中国对虾胰蛋白酶基因的克隆和结构分析

克隆中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）胰蛋白酶基因,参考多种生物的胰蛋白酶基因序列设计出1对简并PCR引物.利用PCR技术从中国对虾基因组DNA中扩增出1条DNA带,经PCR产物回收、纯化,连接到载体质粒,转化细菌,蓝百斑筛选等操作获得了1个阳性克隆.序列分析表明,该序列包含1个内含子和2个不完整的外显子,与已报道的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）胰蛋白酶基因Ⅲ有较高的相似度（identity=79.2%）.综合多种分析,可以推定该序列为对虾的胰蛋白酶基因序列.系统进化分析表明该基因属于胰蛋白酶第三家族.