黄口荔枝螺转录组数据的微卫星标记开发与分析

以黄口荔枝螺转录组测序所得到的拼接序列为基础,利用MISA软件进行微卫星分析,利用Primer5.0设计引物160对。结果显示,83对引物能够成功扩增,引物在黄口荔枝螺渔山列岛群体多态性检测中发现,37个SSR位点能够表现出多态性,一共获得了129个等位基因,各位点等位基因数为2~5个,平均每个位点等位基因数为3.49个,观测杂合度H_o,期望杂合度H_e,多态信息含量PIC范围分别介于0.000~0.800、0.146~0.645、0.139~0.573之间,有9个表现为高度多态,20个表现为中度多态,8个表现为低度多态。实验结果进行Hardy-Weinberg平衡检测后,利用Bonferroni correction法进行校正,有29个位点显著偏离,结果表明渔山列岛黄口荔枝螺群体总体遗传多样性水平较低。     

基于转录组数据的凡纳滨对虾微卫星标记开发

对虾遗传多样性和育种研究需要大量的分子标记。作者利用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)转录组测序数据,采用MISA软件进行微卫星序列挖掘,共获得14 767条微卫星序列。统计发现在凡纳滨对虾中微卫星出现的频率为16.76%;在所有的微卫星序列中,2碱基微卫星最多,占59.53%;其次是3碱基微卫星,占35.78%。随机选取其中74条序列设计引物,通过DNA混池扩增和分型的方法进行微卫星标记的开发,PCR扩增的显示有54对(72.97%)能扩增出清晰的目的条带,进一步分型的结果显示27条(36.49%)微卫星显示出多态性,从这些多态性的微卫星位点中选择11个位点在"科海1号"种质库材料中进行个体分型,结果显示在该群体中微卫星标记的等位基因数目为2~11个不等,期望杂合度值为0.256~0.858,观察杂合度为0.213~0.875,多态性信息含量为0.221~0.830,在11个位点中有4个位点显著偏离HWE(P0.05)。本研究结果为后续使用微卫星标记进行对虾遗传学研究,促进对虾的遗传选育和种质资源保护提供了重要基础。     

基于Illumina HiseqTM 2000高通量转录组测序的里氏拟石磺SSR 标记开发

为给石磺科贝类系统进化研究和资源保育工作提供更有效的分子标记,使用Illumina Hiseq TM2000高通量测序技术对里氏拟石磺进行转录组测序,以所得的拼接序列为基础,利用MISA和SSR Hunter1.3软件进行微卫星序列的查找,对选出的51个微卫星位点进行引物设计,经PCR扩增得到单一清晰扩增条带的位点24个,研究湛江里氏拟石磺群体扩增。结果表明,其中14个位点表现多态性。14个多态性位点得到的等位基因数为2~4,其中观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.031 3~0.714 3和0.031 3~0.708 4,多态性信息含量(PIC)为0.089 5~0.640 5,14个位点中的2个位点表现为高度多态性(PIC0.5),10个位点表现为中度多态性(0.5PIC0.25),另外2个位点表现为低度多态性(PIC0.25)。经Sequential Bonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡检验,9个位点不偏离平衡(P0.05)。开发的SSR标记可用于里氏拟石磺群体遗传学和石磺科贝类间的系统发生研究,并为里氏拟石磺的群体种质保护提供数据支持。     

基于SLAF-seq技术开发蓝圆鲹微卫星标记及跨物种扩增检测

采用基于高通量测序平台的SLAF-seq技术开发蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)微卫星标记,从获得的1 450个四至六碱基重复微卫星位点中随机挑选93个位点进行引物合成和多态性检测,最终开发出31个多态性微卫星标记.群体遗传学检测结果表明,31个位点的等位基因数为4~29(均值13.48),观测杂合度(Ho)为0.281~0.875(均值0.650),期望杂合度(He)为0.557~0.958(均值0.838),多态信息含量值(PIC)为0.456~0.939(均值0.803),表明所开发的31个微卫星位点均具有较高的多态性.Hardy-Weinberg平衡检测表明,17个位点符合HWE("哈迪-温伯格"平衡),且各位点间不存在连锁不平衡现象.跨物种扩增结果显示,分别有27、20、20、18、9个微卫星标记在颌圆鲹(Decapterus macarellus)、长身圆鲹(Decapterus macrosoma)、无斑圆鲹(Decapterus kurroides)、竹荚鱼(Trachurus japonicus)及金带细鲹(Selaroides leptolepis)中具有较好的通用性.本研究开发的多态性长碱基重复微卫星标记可为蓝圆鲹渔业资源的科学管理和保护提供有力的遗传学评估手段,亦可为圆鲹属和鲹科鱼类系统进化研究提供新的分析手段.     

马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞转录组测序数据中SNP标记的开发及其功能注释分析

本文基于马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞比较转录组学数据进行单核苷酸多态性标记(SNP)的开发和关联基因的功能注释分析,以期为SNP标记的利用提供有效信息。在转录组测序获得的67632条SNP-unigenes中共获得962995个SNP位点,位点平均发生频率约为1个SNP/100bp;转换SNP数目与颠换SNP数目比值约为0.5,与理论比率相符;而6种单核苷酸变异类型中,以A/T颠换SNP最多。SNP-unigene功能注释分析表明,30376条unigenes(44.91%)匹配到GO分类条目;18150条unigenes(26.84%)获得COG注释信息,并以"一般功能预测"类最多;10981条unigenes(16.24%)富集到32条KEGG子集,其中以"信号转导"子集中富集的SNP-unigene最多。进一步富集分析显示629个SNP-unigenes注释到"Platelet activation"等多条免疫防御相关信号通路中;同时,根据SNP位点分布情况筛选到123个溶藻弧菌感染前、后转录组中特异分布的免疫防御相关候选SNP位点。基于标准化的基因表达水平分析,在17个差异表达免疫防御相关基因中共检测到1594个SNP位点。     

黄鳍棘鲷微卫星标记开发及其在鲷科鱼类中的跨物种扩增

采用基于高通量测序平台的SLAF-seq技术,开发出47个高多态性的黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus)微卫星标记,其中二碱基重复位点17个,三至六碱基重复位点30个。各位点的等位基因数为2～27(均值为10),观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0. 156～0. 938(均值为0. 682)和0. 177～0. 963(均值为0. 741),多态信息含量(PIC)为0. 166～0. 946(均值为0. 705)。经Bonferroni校正后,有43个位点符合哈迪-温伯格平衡(HWE),其余4个位点偏离HWE。这些多态性微卫星标记为黄鳍棘鲷遗传资源研究提供新的有效分子标记。跨物种扩增结果显示,共有31个黄鳍棘鲷微卫星标记可在9种鲷科鱼类中成功扩增。其中17个标记在太平洋棘鲷(Acanthopagrus pacificus)、黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii)和澳洲棘鲷(Acanthopagrus australis)中具有较好的通用性,这些标记可为棘鲷属(Acanthopagrus)的系统进化和种群遗传学分析提供新的标记来源;另有3个标记在二长棘梨齿鲷(Evynnis cardinalis)、真赤鲷(Pagrus major)、蓝点赤鲷(Pagrus caeruleostictus)及黄牙鲷(Dentex hypselosomus)中具有通用性。     

基于转录组数据的大菱鲆(Scophthalmus maximus)SNP标记开发及多态性分析

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是最具商业价值和养殖前途的海水鱼类之一,雌雄间生长有一定的差异。其高通量雌雄转录组测序的完成为大规模鉴定和开发SNP标记提供了参考序列。本研究基于大菱鲆雌雄转录组测序数据,选择其中45个SNP位点,设计引物63组,其中21个位点(46.7%)应用小片段高分辨率熔解曲线(HRM)技术分型成功。对其进行多态性检测,21个位点均具有二个单倍型。观测杂合度Ho的分布范围为0.256—1.000,期望杂合度He的范围为0.276—0.518,19个位点符合Hardy-Weinberg平衡。14个SNP位点位于基因编码区,其中3个属于非同义突变。含有这些SNP位点的基因大多与信号转导和转录翻译相关。本研究结果表明,高通量转录组测序和小片段HRM适合大规模SNP标记开发,为大菱鲆的分子遗传育种提供了候选标记资源。     

基于转录组数据的马氏珠母贝EST-SSR位点的信息分析及其多态性检测

为获得稳定可靠的马氏珠母贝SSR分子标记,本文利用MISA软件对转录组测序数据进行了大规模的EST-SSR标记发掘,并分析了位点信息及其多态性。结果表明,马氏珠母贝转录组测序所获得的74007条Unigenes中检测出9872个EST-SSR位点,位点出现频率为13.34%,平均每5102 bp含有1个SSR位点。在转录组SSR中共有132种重复基元类型,其中单核苷酸重复基元为主要类型,占SSR总数的81.46%;单核苷酸重复以A/T基序为主,占SSR总数的71.27%。基于筛选的SSR序列,应用Primer3软件进行引物的批量设计,共为5922条EST-SSR序列成功设计出17766对引物。随机选择80对引物对EST-SSR多态性进行检测,共有62对引物成功扩增出稳定条带,占引物总数的77.5%;其中,17对EST-SSR引物表现出个体多态性,多态性比率为27.42%。以上研究为马氏珠母贝遗传多样性、遗传图谱构建及分子辅助育种研究提供了有效工具,对于马氏珠母贝种质资源保护、优良品种培育和珍珠养殖业的健康发展均具有重要意义。     

基于转录组测序技术的海月水母足囊生殖分子机制研究

足囊生殖是海月水母(Aurelia coerulea)抵御恶劣环境的一种无性生殖方式,对维持和扩增海月水母种群具有重要作用,目前对海月水母足囊产生的分子机制尚不清楚。本研究首次构建了海月水母产囊和非产囊螅状体转录组的表达谱,并结合生物信息学比较分析,探究驱动足囊生殖的分子机制。转录组测序共检测到44 873个基因,筛选过滤后共发现200个差异表达基因,其中95个基因在产囊螅状体中显著上调,105个显著下调。本研究挖掘出了卵黄蛋白原(基因VTG-1和VTG-2)和角蛋白(基因Hornerin)等调控海月水母足囊营养储备及几丁质形成的潜在功能基因。此外,GO和KEGG分析结果显示ErbB信号通路、Hedgehog信号通路等参与细胞分裂和分化的生物学过程在产囊螅状体中显著下调,基底膜组织、运动正调节等参与细胞迁移的的生物学过程在产囊螅状体中显著富集,表明这些生物学过程在足囊形成过程中发挥着重要作用。综上,本研究为海月水母螅状体在恶劣环境下的适应机制研究提供了理论依据。     

栅藻全转录组测序与类胡萝卜素合成途径相关基因分析

栅藻(Desmodesmus sp.)是一种能产生重要次生代谢产物类胡萝卜素的海洋绿藻,为了深入了解栅藻类胡萝卜素代谢途径及关键酶基因,本研究通过Illumina高通量测序平台对栅藻进行转录组测序.利用Trinity软件对转录组数据进行从头组装,共获得37 634个Unigenes,经过与Nt、Nr、Swiss、Prot、KEGG、COG、GO数据库比对,共有23 235个Unigenes获得注释.GO分类中(level 2)注释最多的分别是代谢过程(metabolic process),细胞组分(cell part)和催化活性(catalytic activity),与KEGG数据库比对发现14 123个Unigenes与128条代谢途径相对应.根据组装和注释的转录组结果,鉴定了栅藻中与类胡萝卜素生物合成途径相关的基因,构建了栅藻类胡萝卜素代谢途径,获得的栅藻转录组数据有利于进一步研究类胡萝卜素代谢途径中相关基因的功能及调控.     

海洋酸化对青蛤免疫指标的影响

通过向水体中通入CO_2的方法模拟海洋酸化环境,测定青蛤(Cyclina sinensis)在酸化条件下各免疫指标的变化情况。结果显示:将青蛤置于酸化的海中(pH分别为7.4和7.7),并以自然海水做对照组(pH 8.1)后,血细胞总数随海水酸化胁迫时间的延长,表现为下降趋势,且差异显著(P0.05);海水pH降低抑制了溶菌酶的活性,但差异性不显著(P0.05);ACP活性总体呈下降趋势,对照组活性要高于酸化组,而ALP活性表现为上升趋势。酸化胁迫初期诱导SOD活性升高,后期SOD活性受到抑制,而CAT变化却截然相反;脂质过氧化产物MDA在酸化后期出现显著降低(P0.05)。     

生殖季节青蛤性别与形态相关性分析

运用判别分析、主成分分析和聚类分析3种多元分析方法,测量其11个形态学比例参数,对生殖季节青蛤（CyclinasinensisGmelin）的性别与形态相关性进行了分析。试验对象为2008年9月份采自连云港赣榆、2009年5月份分别采自连云港赣榆和海南岛海口的雌雄青蛤。将上述3个群体独立和合并作为一个群体分别建立了4个...     

干露胁迫对青蛤呼吸代谢及抗氧化相关酶活力的影响

研究了不同时间和温度下干露对青蛤(Cyclina sinensis)失水率、存活率、呼吸代谢相关酶及抗氧化相关酶的影响。结果表明,随着干露时间的增加,青蛤的失水率显著增加,且高温状态下青蛤失水加剧;在3℃和10℃条件下干露48 h未出现死亡现象。在20℃条件下,干露时间超过24 h后,青蛤出现死亡现象,死亡率为3.33%,至48 h死亡率增加至5.33%;随着干露时间的增加,青蛤的呼吸代谢相关酶的活性整体呈现显著下降趋势(P<0.05),10℃条件下青蛤的呼吸代谢相关酶的活性整体高于3℃和20℃;随着干露时间的增加,青蛤的抗氧化相关酶的活性呈现与青蛤呼吸代谢相关酶相似的变化趋势,且不同温度条件下,干露时间达到48 h时,青蛤的抗氧化相关酶活性显著低于对照组(P<0.05)。综上表明青蛤受干露胁迫时具有一定的自我调节能力,但干露时间超过其耐受限度时会对青蛤的生理状态造成影响。     

浒苔发酵工艺优化及青蛤喂养效果评价

本试验以自然海区打捞上岸的浒苔(Enteromor phaprolifera)为原料,以植物乳酸杆菌为发酵菌种,发酵浒苔喂养青蛤(Cyclina sinensis)的特定生长率为响应值,确定浒苔发酵的最佳工艺。在单因素试验的基础上,以发酵时间、发酵温度、料液比为响应因素,以青蛤特定生长率为响应值,利用Box-Behnken中心组合方法进行三因素三水平试验设计,进行响应面分析。结果表明:影响浒苔发酵工艺的因素主次顺序为发酵温度、料液比和发酵时间,最佳发酵工艺条件为:发酵温度35℃,料液比(1∶1.5)g·mL^–1,发酵时间84h。通过测定发酵前后浒苔的常规营养成分,发现浒苔发酵产物的粗蛋白含量显著高于未发酵浒苔(P<0.05);使用工艺优化后的浒苔发酵产物所喂养的青蛤与投喂小球藻的青蛤在特定生长率与存活率方面无显著差异。本试验证明优化后的浒苔发酵工艺具有可靠性,其发酵产物具备成为青蛤养殖饲料的条件,为浒苔发酵饲料的开发利用提供理论依据的同时,也为贝类配合饲料的开发及应用提供极大参考价值。     

不同月龄青蛤形态性状对活体质量的影响分析

随机选取5月龄、10月龄、15月龄的青蛤(Cyclina sinensis)混合家系各220枚作为研究对象,通过测定其壳长(SL)、壳高(SH)、壳宽(SW)和活体质量(W),并采用相关性、通径和决定系数的统计分析探讨青蛤形态性状对活体质量的影响效力。结果表明:各性状与活体质量间的相关性均达极显著水平(P0.01),其中5月龄、10月龄和15月龄相关系数最大的均为壳高;通径分析结果显示,对不同月龄的活体质量的直接影响最大的均是壳高、其次壳宽、最后壳长;5月龄和15月龄的壳高和壳宽共同决定系数最大,分别为0.269和0.262, 10月龄的壳高决定系数最大为0.338。利用逐步回归的方法分别建立5月龄、10月龄、15月龄青蛤活体质量的最优回归方程分别是:W5=–0.564+0.061SH+0.051SW,R2=0.933;W10=–2.585+0.040SL+0.149SH+0.101SW,R2=0.934;W15=–7.359+0.123SL+0.210SH+0.273SW,R2=0.957。本研究结果可为青蛤高产新品系阶段选优和良种选育提供基础数据。     

Cu2+对青蛤的胁迫效应

为研究青蛤(Cyclina sinensis)对重金属Cu~(2+)的蓄积作用及免疫机能的影响,开展了Cu~(2+)对青蛤的急性毒性实验,观察青蛤在96 h Cu~(2+)半致死浓度和安全浓度胁迫下,不同组织的蓄积趋势,及血淋巴液中SOD、CAT和ACP活性的变化。结果显示:Cu~(2+)的半致死浓度为0.807 mg/L,安全浓度为0.00807 mg/L。鳃和内脏团组织中蓄积的Cu~(2+)浓度与处理时间呈正相关;在半致死和安全浓度胁迫下,鳃组织中Cu~(2+)蓄积速度均快于内脏团;在半致死浓度胁迫下血淋巴液中SOD、CAT和ACP活性呈现先诱导再抑制的趋势,安全浓度下无明显变化,但均高于对照组水平。     

Pb2+对青蛤的急性毒性及对其血淋巴液中免疫相关酶活性的影响

采用静态急性毒性实验研究了重金属Pb²⁺对青蛤(Cyclina sinensis)的生物急性毒性效应,测定了在96 h Pb²⁺半致死浓度的1/10(TC组)和1/100(SC组)两个浓度胁迫下,血淋巴液中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)和溶菌酶(LSZ)活性的变化。结果显示:Pb²⁺的96 h LC50为7.938 mg/L; SC组ACP活性表现为诱导-抑制趋势,除4 d外均与对照组差异显著(P<0.05), TC组为抑制趋势,为3个组中的最低,与对照组差异显著(P<0.05);实验组SC组和TC组的AKP、LSZ活性均表现为前期为诱导中后期受抑制的趋势,与对照组差异显著(P<0.05),且TC组活性始终低于SC组,表现出Pb²⁺的胁迫浓度越高酶活性受到的抑制作用越大。以上结果表明,重金属Pb²⁺对青蛤的毒性级别为高毒级,能造成青蛤免疫相关酶的活性受到抑制,影响青蛤的免疫能力,而且这种抑制作用随着环境中Pb²⁺浓度增加而增加...     

青蛤的保活与营养

对青蛤在不同温度奈件下的保活情况和不同季节青蛤Cyclina sinensis的营养成分进行了研究,结果表明：在-2—33℃水温水体中青蛤能全部存活：在低温干置条件下,0—4℃30d、-2℃15d、-7和-12℃4h能全部存活;在常温阴凉条件下,稚贝3d成活率为90％、4d成活率为70％、5d全部死亡,1cm以上青蛤存放5～8d能全部成活,其中扎紧包装的保活效果好于散放的;6月份青蛤的营养成分略好于12月份的;青蛤肉中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的含量高达18.4％和11．3％,其铁含量较高,为194．257μg／g。