绿色荧光蛋白标记杀鲑气单胞菌的构建及其初步应用

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是引起疖疮病的典型致病细菌,几乎可以侵染所有的鲑科(Aeromonas)鱼类,为水产养殖业带来巨大的经济损失。本研究通过电击转化法将原核表达载体p GFPuv成功导入杀鲑气单胞菌C4菌株(AS-C4)中,获得了绿色荧光蛋白标记的杀鲑气单胞菌菌株AS-C4~(GFP)。AS-C4~(GFP)菌株在氨苄青霉素抗性平板上生长良好,并在紫外光下激发出较强的绿色荧光。通过荧光显微镜观察菌体和PCR检测gfp和杀鲑气单胞菌vap A基因,表明gfp基因已经成功导入AS-C4中。用AS-C4~(GFP)人工感染大西洋鲑(Salmo salar),从死亡鱼的脾脏、肝脏、肾脏中均能分离出AS-C4~(GFP),AS-C4~(GFP)在脾脏中最多。AS-C4~(GFP)具有特异性和可视性,为研究杀鲑气单胞菌对大西洋鲑的侵染途径提供了一种良好的生物材料。     

养殖大菱鲆病原菌——杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和组织病理学研究

自然发病的养殖大菱鲆幼苗出现口部周围皮下出血,肝脏灰白色并萎缩坏死的症状.从肝脏中分离纯化得到优势菌株,定名为db14.该菌株在LB培养基上生长较缓慢,早期菌落稍隆起,白色,质地较硬;人工感染试验证实对大菱鲆有较强的致病性,其半数致死剂量LD50为2.75×103cfu/g;生理生化特征测定显示其与杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)相似度最高;细菌16S rDNA序列测定后在GenBank中进行序列比对分析,结果与杀鲑气单胞菌无色亚种的序列同源性最高,为100%.综合上述结果,确定该菌株为杀鲑气单胞菌无色亚种.该菌株对复达欣、菌必治、丁胺卡那霉素和氯霉素等较为敏感.通过对人工感染菌株db14的大菱鲆组织切片观察,发现病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠道等器官的组织均有明显的病理变化.而心脏和脑未发现明显异常.     

温度及pH对杀鲑气单胞菌生长的影响研究

利用A值法与活菌平板计数法,测定了杀鲑气单胞菌在不同条件下的生长曲线,研究了不同温度及pH对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicha)生长的影响。结果表明,活菌计数法更能真实的反映细菌数量的动态变化。在28℃,15℃,10℃,5℃条件下,随着温度降低,杀鲑气单胞菌生长速率明显下降;在pH6.0~8.0时,酸性条件能明显抑制杀鲑气单胞菌的生长;在28℃、pH7.5条件下,杀鲑气单胞菌生长速率最快,达到稳定期时细菌数量也最多。在养殖生产过程中,为了抑制杀鲑气单胞菌的生长繁殖,建议在不影响鱼类正常生长的条件下,尽量降低养殖水体温度并合理控制水体pH,以降低养殖鱼类发病率。     

纳米锌对杀鲑气单胞菌的灭活效果及其细胞毒性

为探究纳米锌在制备水产动物致病菌灭活疫苗应用中的可行性。本研究利用不同浓度的纳米锌水溶液在不同温度条件下对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)进行不同时长的孵育处理。研究显示,纳米锌对杀鲑气单胞菌的灭活效果与浓度、温度及孵育时间均呈现正相关性,在高浓度与高温条件下灭活菌体所需的时间短。检测了不同灭活条件下纳米锌对杀鲑气单胞菌菌体蛋白及免疫原性的影响,SDS-PAGE结果显示不同条件下纳米锌灭活的杀鲑气单胞菌菌体蛋白组成及丰度与正常菌体没有明显差异;而扫描电镜结果显示,在37℃条件下纳米锌会造成菌体结构破损并出现细菌碎片;ELISA检测结果4℃条件下各纳米锌浓度灭活组菌体抗原性均未受到显著性影响,然而在28℃条件下,200和400mg/L纳米锌灭活组菌体抗原性显著低于对照组,而在37℃条件下除50mg/L浓度组外,其它3个浓度灭活组抗原性均显著低于对照组。比较研究了100mg/L-28℃灭活组与甲醛灭活的全菌疫苗的免疫保护效果,结果显示纳米锌与甲醛灭活菌体免疫组鱼体的免疫保护率分别为86.2%与79.3%。利用鲤上皮瘤细胞对纳米锌的细胞毒性进行了检测,结果显示400mg/L浓度以下纳米锌对细胞的贴壁、生长及代谢均无明显影响。本研究结果说明纳米锌对杀鲑气单胞菌具有明显的灭活效果,且灭活的全菌疫苗表现出良好的免疫保护效果,而其对菌体的抑杀能力及损伤程度与温度和时间密切相关,本研究为纳米锌在水产全菌灭活疫苗的制备提供了基础。     

石鲽(Kareius bicoloratus L.)源杀鲑气单胞菌杀鲽亚种生物学性状的研究

采用分类方法，对从两起石鲽(Kareius bicoloratus L．)细菌性败血感染症病例的病(死)鱼中分离到的相应病原菌，进行形态特征、培养特征、自凝性、色素产生情况及生理生化特性等较系统的表观分类学指征鉴定及代表菌株DNA中(G C)％的测定等研究。结果表明，分离菌为杀鲑气单胞菌的新亚种(subsp．nov．)并定名为杀鲑气单胞菌杀鲽亚种(Aeromonas salmonicida subsp．flounderacida subsp．nov．)。经血清型检定，表明60株菌均为同种血清型。选择代表菌株做对健康石鲽、牙鲆、鲤、鲫及泥鳅的人工感染试验，表明了相应的原发病原学意义及较强的致病作用。药敏试验结果表明，对供试37种抗菌药物中的青霉素G等6种耐药，对头孢噻肟等25种高敏，对多黏菌素B、利福平2种敏感，对头孢唑啉等4种在株间存在一定敏感性差异。该研究结果能较全面地反映出该菌的主要生物学性状。     

椒江口化工园区邻近海域沉积物中细菌多样性初步研究

为研究椒江化工园区邻近海域沉积物中细菌结构, 选取四个典型站点, 通过分离纯化、鉴 定和建立克隆文库的方法, 对其进行多样性及系统发育分析。可培养细菌的形态学及API 鉴定结果 显示洋葱假单胞菌及杀鲑气单胞菌杀鲑亚种是优势种, 典型细菌16S rDNA 分子鉴定结果表明厚壁 菌门及γ-变形菌纲为主要类群。非培养细菌克隆文库的序列分析结果表明: 细菌主要包括变形菌门、 酸杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、CFB 群、放线菌门、厚壁菌门、浮霉菌门等9 个类群; 其中C3 站点克隆子主要属于γ-变形菌纲及δ-变形菌纲; C4 站点克隆子以γ-变形菌纲及酸杆 菌门为主; C5 站点克隆子主要属于δ-变形菌纲及γ-变形菌纲; C6 站点克隆子主要属于γ-变形菌纲及 放线菌门。综合可培养及非培养结果, 可发现椒江口化工园区邻近海域沉积物中γ-变形菌纲为典型 优势类群, 除相当数量的克隆子相似序列来自石油烃污染的沉积环境外, 还有大量克隆子相似序列 来自养殖污染环境。     

椒江口沉积物中细菌多样性初步研究

通过常规分离纯化、鉴定和构建细菌克隆文库的方法,研究椒江口三个站点沉积物中细菌的多样性,并对其进行系统发育分析。可培养细菌的形态学及API鉴定结果显示杀鲑气单胞菌是优势种,典型细菌16S r DNA分子鉴定结果表明γ-变形菌纲和厚壁菌门为主要类群。未培养细菌克隆文库的序列分析结果表明:细菌主要包括变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、CFB群、放线菌门、厚壁菌门等8个类群;其中C0站点克隆子主要属于γ-变形菌纲及绿弯菌门;C1站点克隆子以α-变形菌纲及γ-变形菌纲为主;C2站点克隆子主要属于放线菌门及α-变形菌纲。综合可培养及未培养结果,可发现椒江口沉积物中γ-变形菌纲为典型优势类群,且相当数量的克隆子其且相当数量克隆子的相似序列来自重金属或石油烃污染的沉积环境。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原温和气单胞菌(Aeromonas sobria)分子鉴定及耐药性研究

采用常规生理生化特性测定及16SrRNA、gyrB及rpoD基因同源性检索与系统发育学分析等分子生物学方法,对引起养殖泥鳅大量死亡的病原细菌进行了综合鉴定。生理生化特性结果表明,分离菌株NQ090701与气单胞菌属的温和气单胞菌相近;16SrRNA、gyrB及rpoD基因Blast序列同源性检索与系统发育学分析均与温和气单胞菌相似性最高;综合形态与生理生化特征及16SrRNA、gyrB与rpoD基因的分子特征,确认分离菌株NQ090701为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。同时,采用试管稀释法测定了养殖生产中常用的10种抗菌药物对病原温和气单胞菌的体外最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC),结果表明氟哌酸杀菌作用最好,其次为盐酸沙拉沙星;甲砜霉素和复方磺胺甲恶唑在所试验的药物浓度范围对温和气单胞菌无杀菌效果。     

利用API—20E系统鉴定鱼类细菌性病原菌

利用ＡＰＩ－２０Ｅ系统鉴定属于具运动性的气单胞菌，杀鲑气单胞菌，鳗弧菌，鱼害巴斯菌和鲁克耶尔森氏菌的２２３株分离物，并将结果与标准生化检验方法比较，ＡＰＩ－２０Ｅ系统在不同糖类发酵，赖氨酸脱羧酸，Ｖ．Ｐ反应，柠檬酸盐作用，明胶液化等生化反应上出现阳性和假阴性反应。     

6种鱼类病原菌的免疫反应分析及其检测免疫芯片的构建

采用ELISA、Western-blot及Dot-blot方法,分析海豚链球菌(Streptococcus iniae)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、荧光假单胞菌(Psedo-monas fluorescens)及海分支杆菌(Mycobacterium marinum)6种养殖鱼类病原菌与其兔抗血清之间的免疫反应。结果显示,ELISA、Western-blot和Dot-blot 3种方法的分析结果具有一致性,各菌株抗血清与相应的抗原菌株间的反应最为强烈,各菌株与其他细菌兔抗血清间有程度不等的交叉反应。基于以上结果,采用6种病原菌的兔抗血清作为捕获抗体构建了其免疫芯片,确定了检测结果的判读方法,并对其进行验证性应用,结果显示,该芯片可以用于病原菌的准确检测,对分别注射感染不同病原菌的牙鲆(Paralichthys olivaceus)进行取样检测的结果也验证了这一结论。