热带海洋珍珠贝类立克次体病研究——大珠母贝病原类立克次体 …

于１９９３年１１月和１９９４年１１月在海南省临高县新盈珍珠贝养殖场采集患病或濒死的大珠母贝幼母,采用组织切片和扫描电镜技术对其原类立克次体的包涵体进行组织学和超微结构研究,以期找出ＲＬＯ包涵体在宿主细胞内形态发生的内在规律。结果表明,ＲＬＯ包涵体寄主在宿主多处内脏组织,但ＲＬＯ具有明显的嗜细胞特异性,感染的靶细胞为上皮（或表皮）、结缔组织和血管内皮细胞,包涵体存在不同的发育时期,可分为颗粒前期和颗     

热带海洋珍珠贝类立克次体(RLO)病研究 Ⅶ 大珠母贝育苗期幼虫群体RLO病流行病学研究

对流行病学分析显示大珠母贝幼虫群体的死亡是以暴发性方式发生,从胚胎发育前期至变态期,幼虫存在两个死亡高峰,分别位于壳顶期之前或壳顶期和壳顶后期.大珠母贝幼虫群体的死亡率与RLO感染之间存在显著的相关性,在RLO感染的高峰之后均相应伴随幼虫群体死亡率的高峰,随着RLO感染率和感染强度的降低,幼虫群体死亡率也明显降低.在TEM下未发现未受精卵母细胞、受精卵和胚胎早期幼虫感染RLO,最先出现RLO包涵体阳性感染的时期为24h尚未摄食的D形期幼虫,故认为RLO可能不是通过垂直传播,而是通过外界接触感染的方式感染宿主,贝体感染至发病死亡存在潜伏期.     

热带海洋珍珠贝类立克次体病研究：Ⅴ.超微病理学及致病机理 …

对海水养殖大珠母贝和合浦珠母贝类立克次体（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ－ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ,ＲＬＯ）病的超微病理学进行了研究。结果显示细胞及亚细胞结构经历由变性发展到坏死的病变过程,如胞核由核浓缩,核碎裂发展为核溶解;线粒体出现肿胀,嵴和基质改变及内质网脱颗粒,扩张和囊泡变等一系列混浊肿胀和水泡变性的基本特征;最终,细胞器完全溶解消失使胸质疏松,呈崩解或溶解状。     

热带海洋珍珠贝类立克次体病研究 Ⅳ.组织细胞病理学研究

类立克次体(RLO)对大珠母贝和合浦珠母贝具有强烈的致病性,引起基本一致的病理变化.在急性坏死破坏期内,RLO导致外套膜、鳃、消化管、肝胰腺、生殖腺腺管及全身血管内皮系统等多器官组织的变性坏死,使器官组织结构的完整性遭到破坏,破坏程度与RLO包涵体的数目密切相关,而细胞的破坏与细胞内RLO的生长发育及繁殖到大量数目密切相关.鉴于此,将RLO引起的珍珠贝病称为类立克次体病(RLO病).RLO病呈急性变质性炎症和慢性增生性炎症病理,在前者细胞呈现崩解性坏死、溶解性坏死和退变性坏死;在后者存在实质细胞增生和纤维母细胞增生为纤维细胞并形成纤维化.根据炎症病理的发展过程,RLO病可分为急性坏死破坏期和慢性增生修复期.     

热带海洋珍珠贝类立克次体病研究 Ⅳ.组织细胞病理学研究

类立克次体（RLO）对大珠母贝和合浦珠母贝具有强烈的致病性,引起基本一致的病理变化．在急性坏死破坏期内,RLO导致外套膜、鳃、消化管、肝胰腺、生殖腺腺管及全身血管内皮系统等多器官组织的变性坏死,使器官组织结构的完整性遭到破坏,破坏程度与RLO包涵体的数目密切相关,而细胞的破坏与细胞内RLO的生长发育及繁殖到大量数目密切相关．鉴于此,将RLO引起的珍珠贝病称为类立克次体病（RLO病）．RLO病呈急性变质性炎症和慢性增生性炎症病理,在前者细胞呈现崩解性坏死、溶解性坏死和退变性坏死;在后者存在实质细胞增生和纤维母细胞增生为纤维细胞并形成纤维化．根据炎症病理的发展过程,RLO病可分为急性坏死破坏期和慢性增生修复期．     

热带海洋珍珠贝类立克次体(RLO)病研究 Ⅷ.养殖大珠母贝贝苗养成期群体RLO病流行病学研究

大珠母贝人工养殖过程中,幼贝死亡是一个严重的问题。1993年11月至1995年5月,采用现场调查、实验室研究和数理分析相结合的方法,在海南省临高县新盈珍珠贝养殖场自然海区吊养的A,B,C3批养殖贝和陵水新村珍珠贝养殖场养殖池吊养的D批养殖贝的发病和死亡情况进行了流行病学凋查.结果显示,大珠母贝幼贝群体的死亡是以暴发性方式发生,幼贝群体的大批量死亡高峰一般发生在4～6月龄期,8个月以后随着龄期的延长,死亡率显著降低.幼贝群体死亡率与贝体平均体长的关系是4cm以下的贝体死亡率较高,1～3cm阶段处于死亡高峰期内,5cm以上的贝体死亡率显著降低.大珠母贝幼贝群体的死亡率与类立克次体感染(即RLO平均感染严重度指数SI)之间存在显著的相关性,在RLO感染的高峰之后或当中部相应伴随贝群体死亡率的高峰,随着RLO感染的降低,贝群体的死亡率也明显降低。在4批养殖贝群体中,仅在A批养殖贝群体样本中发现有少量纤毛虫寄生(感染率为87.5%,感染强度为3.56个/10倍物镜).这几批幼贝群体的死亡与海水温度、盐度之间均无相关性。     

热带海洋珍珠贝类立克次体病研究 Ⅴ.超微病理学及致病机理研究

对海水养殖大珠母贝和合浦珠母贝类立克次体(Rickettsia-like organism,RLO)病(简称RLO病)的超微病理学进行了研究.结果显示细胞及亚细胞结构经历由变性发展到坏死的病变过程,如胞核由核浓缩、核碎裂发展为核溶解;线粒体出现肿胀,嵴和基质改变及内质网脱颗粒、扩张和囊泡变等一系列混浊肿胀和水泡变性的基本特征;最终,细胞器完全溶解消失使胞质疏松,呈崩解或溶解状.结合先前组织细胞病理学和本文超微病理学研究的结果认为,RLO导致宿主细胞变性坏死的机制有:(1)直接损伤细胞的质膜;(2)直接干扰或破坏细胞的正常代谢;(3)对肝胰腺的广泛破坏可能通过破坏血管内皮系统间接造成肝胰腺上皮细胞的血供障碍,进而引起营养和呼吸代谢障碍或(和)与菌体释放的内毒素有关.     

大珠母贝人工育苗技术的研究

研究大珠母贝人工育苗若干技术,提出一些技术措施：亲贝强化培育促熟,人工诱导排放精卵,优选幼虫,投喂适口的饵料,适时倒池以及投放合适的采苗器等。结果表明,平均单产壳高2-3mm的幼苗8．1万粒／m3,最高可达9．3万粒／m3。     

大珠母贝的研究概况

珍珠是家喻户晓的高级名贵装饰品,而大型优质珍珠在世界上非常稀省,价格极基昂贵,它主要产自一种大型海产双壳贝类--大珠母贝(Pinctada maxima Jameson).     

大珠母贝人工苗养成的研究

大珠母贝Ｐｉｎｃｔａｄａｍａｘｉｍａ（Ｊａｍｅｓｏｎ)主要分布在热带海区 ,栖息在低潮线至水深１００ｍ或更深处 ,其栖息地多为石砾海底或砂质底 ,全年环境因子 ,如水温、盐度和底质等变化很小［２］。大珠母贝个体大、生长快 ,能生产大型优质珍珠 ,贝壳可做贝雕和药用 ,经济价值高 ,是我国重点开发的珍贵品种。但大珠母贝人工苗在海区养成过程中成活率很低 ,特别是下海２～５个月 ,壳高２～４ｃｍ时大量死亡 ,严重制约大珠母贝养殖业的发展。国内有关单位对此进行了研究 ,但至今对大珠母贝苗在海区养殖大量死亡的原因还不明了。为了在…     

两个大珠母贝群体遗传多样性的ISSR分析

用ISSR标记技术对我国两个大珠母贝Pinctada maxima群体的遗传多样性进行分析.7条ISSR引物在两个群体中共得到91个清晰的扩增位点.总多态位点百分率为100%,H= 0.2832, I = 0.4372,总的遗传变异中有21.54%的变异存在于两个群体之间,而78.46%的遗传变异是发生在群体内.海南群体的遗传多样性水平(PPB＝91.21%,I=0.414 4±0.236 4,H=0.271 5±0.179 0)高于广西群体(PPB＝82.42%,I=0.362 1±0.253 4,H=0.235 6±0.1837),广西群体的单态位点数(15个)明显高于海南群体(8个).NJ聚类分析表明两群体各自聚类成一簇.研究结果表明我国大珠母贝的遗传多样性水平较高,两群体间存在较明显的遗传差异     

大珠母贝精子短期保藏条件的初步筛选

为初步筛选不同基础液、保藏温度(4℃与23℃)、保存时间(0～120 h)、保护剂(5%DMSO、DMA、DMF、EG)对大珠母贝(Pinctada maxima)精子活力的影响,通过采用精子质量分析仪检测精子总运动率、直线运动速率、曲线运动速率、平均路径运动速率、头部位移距离和鞭毛摆动频率。结果表明, A、B、C三组基础液能不同程度上激活精子, D、E两组结果与之相反;精子被激活后, 5组基础液中精子活力存在显著的差异(P<0.05),其中E组基础液的精子总运动率最高,达到80.79%;与室温保藏结果相比,低温(4℃)组精子总运动率显著(P<0.05)高于室温(23℃)组,精子活力的保持时间明显优于室温组;低温(4℃)保存120 h内,精子的运动呈先平稳后下降的趋势,精子的最佳保藏时间为24 h内,精子总运动率、直线运动速率、曲线运动速率、平均路径运动速率分别为82.27%、59.62μm/s、81.95μm/s和70μm/s,头部位移距离为2.56μm,鞭毛运动频率为2.93 Hz;低温(4℃)保存12 h后,对照组精子总运动率显著(P<0.05)高于保护剂组,精...     

大珠母贝游离珍珠培育研究

2008~2010年,在广西涠洲岛进行了大珠母贝(Pinctada maxima Jameson)游离珍珠培育实验。实验过程中采用解剖法优选植核核位、几种术前处理方法和低温处理小片贝制备外套膜小片等技术,旨在提高育珠贝留核率、成珠率和优珠率。结果表明,在大珠母贝内脏囊缩足肌左右两侧各有一个适合培育游离珍珠的核位,分别称为左袋和右袋,实际操作中只有左袋可以植入珠核培育游离珍珠;不同术前处理实验组的植核贝休养期成活率差异不显著(P>0.05),但留核率、成珠率显著差异(P<0.05),其中采用传统术前处理和低温处理相结合的综合术前处理方法可有效提高留核率、成珠率平均达78.2%和80.1%;低温处理小片贝与传统方法制备的大珠母贝外套膜小片的育珠效果(成珠率、优珠率、正圆珠比例)存在显著差异(P<0.05),且在实验温度范围内,成珠率、优珠率、正圆珠比例随处理温度的降低而增高,在4~8℃达到最好育珠效果,成珠率、优珠率和正圆珠比例分别达到98%、53%和30%左右;在术后休养期,植核贝吐核高峰出现植核后5~15 d,手术伤口愈合时间为15~20 d,育珠贝的死亡高峰出现在术后的第20~30天。在水温25~30℃条件下,珠核表面形成珍珠层的时间为45 d左右。     

大珠母贝金唇品系黄色珍珠层相关基因的鉴定

大珠母贝主要用于生产高价值的金银色有核珍珠.通过对三亚大珠母贝种群的进行取样,我们培育了一个外套膜边缘具有金色珍珠层的珍珠贝品系.通过对总类胡萝卜进行测定,发现该品系外套膜组织中的总类胡萝卜素含量显著高于对照组.我们筛选了两个品系之间的差异表达基因.有28285个基因在转录组中被注释.与对照组相比,共有295个上调基因...     

渔宝Ⅰ号对大珠母贝人工苗在室内培育的初步试验

本文首次报道饲料添加剂渔宝Ⅰ号对大珠母贝人工幼苗在室内饲养的应用效果。实验分４组同时对比进行,人工苗入池时平均壳高为６．６１ｍｍ,经室内工厂化养殖５４ｄ,渔宝Ⅰ号组的贝苗增长率、成活率及壳高都为最高,分别达１１６．９×１０－２,４９．８×１０－２及１４．２５ｍｍ;平均值分别为９７．９×１０－２,３１．９×１０－２及１３．０８ｍｍ。试验结果表明：投喂渔宝Ⅰ号可显著提高贝苗的增长率和成活率,对贝类的工厂化养殖起着重要的营养免疫调补作用,显示出广阔的商业价值。     

大珠母贝Pinctada maxima(Jameson)亲贝人工促熟培育与诱导排放精卵的研究

用亚心形扁藻Platymonassubcoriformis,湛江等鞭藻Isochrysiszhanjiangensis及某些配合饲料培育大珠母贝pinctadamaxima(Jameson)亲贝,可以促进性腺发育成熟并保持易于诱导排放状态。在需要进行人工育苗时,给亲贝以一定的刺激,即可诱导产卵排精。采用这种方法进行大珠母贝人工育苗,受精率和活率都比剖贝取卵授精的方法高。而且不用杀死大珠母贝亲贝。     

大珠母贝外套膜基因PMMG1的克隆、表达及其特征分析

EF-hand结构域在真核生物细胞内钙离子吸收和运输中发挥重要作用,在贝类中可能参与贝壳和珍珠质的形成。根据已报道的贝类中具有EF-hand结构域的碱基序列设计简并引物,从大珠母贝外套膜cDNA文库中筛选得到PMMG1基因(大珠母贝外套膜基因1)。PMMG1基因全长618 bp,开放读码框编码140个氨基酸,N-端的22个氨基酸肽段为信号肽。PMMG1氨基酸序列与合浦珠母贝PFMG1的一致性为56%,预测有两个EF-hand结构域。选取编码PMMG1成熟蛋白的cDNA序列插入pET-32a质粒构建表达载体,通过IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,成功获得预期大小的融合蛋白。凝胶电泳迁移率的变化证明PMMG1蛋白具有结合Ca2+/Mg2+的活性,组织特异性表达表明PMMG1基因在外套膜的表达量远高于其他组织。大珠母贝外套膜基因PMMG1的克隆与表达研究为进一步研究该蛋白在珍珠质矿化中的作用、探讨珍珠质形成的分子生物学机制奠定了一定基础。     

大珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

采用生物素标记的(CA)15探针和磁珠富集法构建了大珠母贝(Pinctada maxima)微卫星DNA文库,随机挑选1200个菌落,经PCR筛选得到298个候选克隆,成功测序246个,分析获得251个微卫星序列,其中完美型、非完美型和混合型分别占63%、32%和5%。除探针中使用的CA重复外,还得到AT、GT、TC、AG、GC、TAA、CAA、AGG、GATA、GACA、GTGC、CGTC、GACG、CTGT等重复序列。设计引物90对,挑选其中30对合成并筛选出21对能在大珠母贝基因组有效扩增的引物。种群PCR扩增后利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行检测,获得了10个多态位点,共检测出59个等位基因,片段长度范围为133~444 bp。各位点等位基因数2~8个,平均等位基因数5.9个;有效等位基因数为1.342 3~6.000 0,平均为4.124 0;多态性信息含量(CPI)为0.222 5~0.811 8,平均0.7179;期望杂合度(He)为0.259 3~0.847 5,平均0.717 9;观测杂合度(Ho)为0.300 0~0.800 0,平均0.533 3。这些微卫星多态性标记的获得,为进一步开展大珠母贝遗传育种、保护生物学和种群遗传多样性等研究奠定了一定基础。     

中国对虾（Penaeuschinensis）杆状病毒的装配和包涵体形成过程研究

对中国对虾肝胰腺上皮细胞的透射电镜观察，发现杆状病毒可在对虾肝胰腺上皮细胞的细胞质内繁殖。增殖过程中在病毒发生基质表面及附近形成晶格状排列的包涵体，通过包涵体的形成、分化等过程，完成杆状病毒的装配。杆状病毒的装配过程似可分为５个时期：１．病毒发生基质形成期；２．未成熟包涵体期；３．成熟包涵体期；４．包涵体分化与病毒粒子装配期；５．侵染期     

对虾一种无包涵体杆状病毒病原的PCR检测

为建立对虾无包涵体杆状病毒的快速诊断技术,应用PCR技术分别对暴发性流行病发生前、流行中和发病后的对虾样品进行了检测.根据已克隆的对虾杆状病毒部分基因组序列而设计的引物能特异性地扩增出靶DNA片段,最低可以检测1pg的病素DNA.由典型发病症状对虾的胃、腮、肝胰腺、中肠、游泳足、肌内和心脏等器官和组织中成功地检测到病毒.不同组织和器官经扩增得到的信号强弱不同:病虾的胃扩增得到的信号最强,中肠、肌肉、心脏和游泳足次之,腮和肝胰腺信号最弱,说明病毒在不同组织和器官中数量及感染程度不同.在对虾发病前及发病后,用二次PCR还能检测表面不发病呈隐性感染状态的对虾携带的病毒;而对野生健康虾的检测结果为阴性.研究表明,PCR是检测对虾暴发性流行病快速、灵敏而准确的方法,对病毒病的早期诊断、防治和高健康对虾品种的选育具有指导意义.