血卵涡鞭虫感染三疣梭子蟹的病原形态学及组织病理学变化

血卵涡鞭虫是一类主要感染海产甲壳类的致病性寄生性甲藻。近年来,该寄生性病原在我国沿海主要经济蟹类养殖区域流行性发病,给当地蟹类养殖业造成了严重经济损失。为厘清血卵涡鞭虫的生活史形态,了解宿主的病理损伤机制,本文通过血涂片法和HE染色法系统研究了感染过程中该寄生虫的形态变化和宿主的组织病理变化。结果表明,血卵涡鞭虫在感染过程中经历丝状滋养体、单核/双核/多核滋养体、团聚体、蛛网状滋养体、孢子前细胞及孢子等不同生活史阶段。感染导致三疣梭子蟹发生系统性病理变化,肝胰腺、心脏、鳃、肌肉等器官和组织在不同感染阶段均发生相应程度的组织病理变化,主要表现为体细胞破损或坏死、细胞间隙模糊、疏松结缔组织充斥大量寄生虫细胞。最终由于寄生虫在宿主主要器官组织间隙内大量增殖,导致重度感染的梭子蟹器官或组织功能破坏、丧失而死亡。     

血卵涡鞭虫在养殖锯缘青蟹中的寄生

利用光镜和电镜对2005年9月浙江三门湾地区某养殖场发生的养殖锯缘青蟹规模性死亡病蟹进行观察,并对病原进行分子生物学鉴定。组织病理学研究发现,病蟹蟹体消瘦,肌肉白浊,头胸甲内可见大量乳白色液体,血淋巴细胞的量急剧减少,代之以大量寄生原虫,该原虫在病蟹的肝胰腺、鳃、心脏、肌肉等部位大量寄生,引起这些组织发生以坏死为主的变质性病变。电镜下,乳白色液体及病变组织内可见大量寄生虫体,其形态特征、内部结构及宿主表现的症状,与血卵涡鞭虫相类似。采用Small等^[5]的血卵涡鞭虫ITS特异引物,扩增出分子量为300bp左右的条带,并对其进行了测序及序列相似性比较,确定该寄生原虫为一种血卵涡鞭虫Hemntodinium sp。血卵涡鞭虫是海水甲壳类的重要病原寄生虫,我国尚未有该寄生虫病的研究报道,文中首次发现其在养殖锯缘青蟹中的寄生,为靳一步研究该寄生虫病积累了资料。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血卵涡鞭虫病的流行病学分析

为解析拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血卵涡鞭虫病的流行病学特征,于2012年4—11月采用跟踪监测和实地调查的方法,结合病原分离鉴定及病蟹的病理学观察,统计分析了浙江省温州地区养殖拟穴青蟹血卵涡鞭虫病的流行情况。结果表明,患病拟穴青蟹的肝胰腺、肌肉、鳃等组织病理显示有大量血卵涡鞭虫侵染,并能用PCR方法快速检出。温州地区养殖拟穴青蟹血卵涡鞭虫病在每年5—11月均有发生,7—9月为集中发病时间,死亡高峰出现于8—9月之间,年份间(2010—2012)与发病率无相关性,而不同月份对病害的发生有极显著影响(P0.01)。不同发育阶段以脱壳期的发病率相对较高,发病蟹的规格主要以50g以下的幼蟹和250g以上的成蟹为主。拟穴青蟹血卵涡鞭虫病的发生与水温(r=0.756)和盐度(r=0.631)变化关系较密切,夏、秋季节受梅雨、台风影响而引起水温和盐度的剧烈变化可能是暴发血卵涡鞭虫病的诱发因素。     

池塘养殖脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)感染血卵涡鞭虫的研究

通过现场取样、显微镜检、细菌培养、组织病理、电镜观察以及PCR检测等研究手段,对2008年9月浙江省舟山市普陀区某梭子蟹养殖塘混养的脊尾白虾"白浊病"进行了系统的病原学研究。结果表明,病虾体色发白,反应迟钝,血淋巴液呈浊白色,严重患病白虾血淋巴中的血细胞几乎没有或者极少,代之以大量与血细胞形似的寄生虫;组织病理切片及电镜观察发现,病虾心脏、肝胰腺、肌肉、鳃部等组织寄生有大量单细胞寄生虫,该寄生虫虫体形态特征、显微结构及宿主临床症状与本实验室之前研究报道的感染三疣梭子蟹和锯缘青蟹的血卵涡鞭虫类似;采用已建立的针对血卵涡鞭虫ITS1基因的引物对"白浊病"病虾的血淋巴样品进行PCR检测,可扩增出585bp左右的特异条带。综合以上研究结果,确定该寄生虫为血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)。有关脊尾白虾感染该寄生虫的报道在国内外尚属首次。     

三疣梭子蟹池塘养殖的研究

１９９３年，苍南县水产局从三疣梭子蟹（Ｐｏｒｔｕｎｕｓｔｒｉｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ　Ｍｉｅｒｓ）幼蟹开始，经苗种培育和养成两个阶段，完成整个池塘养殖试验过程。１材料与方法１．１试验场地苍南县沿浦镇沿浦村对虾场１号塘，面积１０６６７ｍ２（１６亩）。设闸门一处，大潮汛直接进、排海水，小潮依靠抽水机改善水质。水位可保持１～１．５ｍ。在该塘内侧原高坡面修建一口长３８．６ｍ，宽１２．１５ｍ大规格蟹种养成塘，编号为２。塘水进出通过１ｍ宽的缺口，与大塘相通。水位达０．６～０．７ｍ。又在大塘中，以网片围成无底…     

三疣梭子蟹雌雄隔离养殖技术研究

在193亩池塘中开展三疣梭子蟹雌雄分养和雌雄混养对比试验。其中雌雄分养面积93亩，亩产商品蟹182公斤，平均壳宽12．6厘米，平均个体重230．1克，成活率40．2％。与雌雄混养相比，亩产量提高了53．6％，成活率提高了1.51倍。专家鉴定认为，梭子蟹雌雄分养，方式新颖，效果明显，技术水平属国内先进。     

三疣梭子蟹肝脏的结构研究

于１９８９年９月－１９９０年８月，用电镜研究浙江舟山出产的三疣梭子蟹肝脏的结构。结果表明，三疣梭子蟹的肝脏主要由４种细胞构成；Ｂ细胞，大，长柱状，胞质中有许多液泡，粗面内质网发达；Ｒ细胞和Ｆ细胞，两者相似，均含丰富的粗面内质网，核糖体、脂滴、线粒体等结构，但Ｒ细胞脂滴数量多，体积大，Ｆ细胞的核糖体数量超过Ｒ细胞２；Ｅ细胞，多边形，核大而圆，粗面内质网少，线粒体小而狭长。     

海洋寄生甲藻血卵涡鞭虫生活史及温度对其发展的影响

血卵涡鞭虫(Hematodinium spp.)是一类感染海水甲壳类的致病性寄生甲藻,在全球主要经济蟹、虾类中频繁导致流行性病害,严重危害我国沿海重要经济蟹类的渔业生产。为进一步厘清血卵涡鞭虫的生活史,通过血涂片法、H&E染色法(hematoxylin-eosin staining,苏木精-伊红染色法)和体外培养方法系统研究了从我国沿海天津厚蟹(Helice tientsinensis)中分离的血卵涡鞭虫株系的生活史,描述并比较了血卵涡鞭虫在宿主体内(血淋巴、组织)和体外培养体系中各生活史阶段的细胞形态,并进一步探究了温度对血卵涡鞭虫生活史发展的影响。结果表明,血卵涡鞭虫在感染宿主过程中经历了丝状滋养体、类变形虫滋养体、蛛网状滋养体、团块状聚合体、孢子母细胞、孢子前细胞和孢子等生活史阶段。温度显著影响血卵涡鞭虫的细胞生长发育与增殖过程;在实验低温(10℃)和高温(30℃)条件下,血卵涡鞭虫不能在宿主体内顺利寄生增殖;在15~25℃范围内,温度越高其细胞生长发育及细胞增殖速度越快,而在15℃和20℃条件下,血卵涡鞭虫可在感染的天津厚蟹体内产生大量游动孢子并释放到水体中。     

三疣梭子蟹精子保存研究

于2004年5月到2004年7月对三疣梭子蟹精子进行了常温、低温和超低温保存研究。利用离子载体A23187人工诱导顶体反应以判断精子活力。常温和低温保存实验的结果显示,4℃下无钙人工海水(calcium-free artificial sea water,Ca2 FASW)保存236h的精子有25%以上的成活率。在4℃,25℃两种温度与Ca2 FASW、天然海水(natural sea water,NSW)两种基础液构成的4种组合中,最优组为4℃、Ca2 FASW,最差组为25℃、NSW。将精子浓度与Ca2 FASW对照组及诱导组比较,结果显示,25℃和4℃下,精子浓度与对照组顶体反应率相关性不显著(P=0.068>0.05,P=0.265>0.05),与诱导组顶体反应率极显著相关(P<0.01)。以二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和甘油(Glvcerol,G)作为抗冻剂进行超低温冷冻实验,72h后解冻,包括对照组在内的所有组均有98%以上的精子不经诱导就发生顶体反应。     

中国三疣梭子蟹Portunus trituberculatus Miers的研究

本文概述了国内有关三疣梭子蟹形态、习性、繁殖、发育、生长、种群、生理、成分和养殖等方面的研究现状，探讨了关于三疣梭子蟹研究的发展方向。     

氟苯尼考在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)疾病模型内的代谢动力学

为了解健康和疾病条件下药物在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体内的代谢差异,在构建三疣梭子蟹溶藻弧菌疾病模型的基础上,按25mg/kg剂量分别给健康和患病三疣梭子蟹单次口灌氟苯尼考后,采用高效液相色谱法测定了其肝胰腺、肌肉和血浆中的药物浓度,药时数据应用3P97药代动力学软件拟合。结果显示:氟苯尼考在健康和患病条件下三疣梭子蟹相同组织中的药时曲线形态相似,三种组织的药时数据均符合带时滞的一级吸收二室开放模型;肝胰腺吸收药物最快,肌肉次之,血浆最慢;与健康组相比,患病蟹肝胰腺、肌肉、血浆三种组织对氟苯尼考的吸收和消除速度明显减慢,达峰时间推迟,半衰期延长,清除率减低,最高药物浓度下降,表观分布容积和药时曲线下总面积变大。说明疾病使氟苯尼考在三疣梭子蟹体内的吸收、分布、代谢和消除均发生了显著变化,建议患病三疣梭子蟹口服氟苯尼考的休药期至少10d。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体重遗传力的估计

应用数量遗传学原理和全同胞组内相关法估计了三疣梭子蟹80日龄和120日龄体重的遗传力。实验中的400只亲蟹均来自人工养殖的选育群体。通过群体间杂交,构建了37个全同胞家系包括13个半同胞家系,分别测定了80日龄和120日龄时大约30个个体的体重。利用SPSS软件的一般线性模型(GL.M)过程,计算表型变量的方差组分,估计体重性状的遗传力。结果表明,三疣梭子蟹80日龄和120日龄体重的遗传力估计值分别在0.42—0.64和0.25—0.39之间。雌性遗传方差组分均显著大于雄性遗传方差组分,说明雌性遗传方差组分存在显著的母性效应。经过t检验,父系半同胞、母系半同胞方差组分估计的遗传力均未达到显著水平,全同胞方差组分估计的遗传力达到极显著水平。因此可以认为基于全同胞方差组分估计的遗传力是对三疣梭子蟹两个发育阶段狭义遗传力的无偏估计值,估计值分别为0.53和0.35。说明三疣梭子蟹体重属于中度遗传力,对其选择育种具有较大的潜力。     

基于优化模型的莱州湾三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)栖息地适宜性研究

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是莱州湾最重要的经济蟹类,其资源丰度受栖息环境影响显著,为了解不同的环境因子对其栖息地分布的影响,根据2010~2020年夏季底拖网调查数据,研究莱州湾三疣梭子蟹栖息地适宜性及其影响因子。利用广义可加模型(generalized additive models,GAM)选取变量因子,通过提升回归树模型(boosting regression tree,BRT)对因子进行权重分析,构建了4种栖息地适宜性指数(habitat suitability index,HSI)模型,并通过实测值和预测值的Pearson检验,对模型比较和验证。结果表明,GAM和BRT优化的HSI模型好于其他3种模型(未优化模型,GAM优化HSI模型,BRT优化HSI模型),以生物量表征资源丰度的模型好于尾数表征资源丰度的模型,算术平均法构建的HSI模型的整体预测准确率和相关系数高于几何平均法,对莱州湾三疣梭子蟹栖息地有较强的预测能力。底层水温、底层盐度和水深对三疣梭子蟹栖息地影响较大,夏季栖息地适宜性较高的海域(HSI>0.7)主要分布在莱州湾南部、东南部和东北部海域,中部和西南部海域分布较少。研究结果为莱州湾三疣梭子蟹增殖放流工作提供了科学依据。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素PtGAL的基因克隆与原核重组表达

半乳糖凝集素(Galectin)是动物凝集素家族的一员,在脊椎动物和无脊椎动物中都参与了重要的免疫防御反应,是一种重要的免疫因子。通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素基因全长,并命名为PtGal。该基因全长875bp,开放阅读框为669bp,编码222个氨基酸,包含一个糖识别结构域CRD(位于16—142位氨基酸),预测蛋白的分子量(Mw)为23529.4Da,理论等电点(p I)为5.21。同源性比对结果显示,PtGal编码的氨基酸序列与中华绒螯蟹、南美白对虾、日本囊对虾galectin的同源性分别为77%、66%、58%。实时荧光定量PCR(qRT-RCR)结果表明,PtGal在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、肠、胃、鳃、心脏、性腺中都有表达,其中在性腺中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低,但人工感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后,肝胰腺的表达呈先升高后降低的趋势。利用原核表达系统对三疣梭子蟹PtGal进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白rPtGal,ELISA检测rPtGal与不同细菌及真菌的结合活性,结果表明,该重组蛋白与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌均有较强的结合。本研究为进一步深入研究三疣梭子蟹半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)FABP基因克隆及其在卵巢发育过程中的表达特征研究

脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP)是胞内脂质结合蛋白超家族成员,在长链脂肪酸的摄取、转运及代谢调节中发挥重要作用。本研究采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)脂肪酸结合蛋白基因(简称Pt FABP)c DNA全长,并采用实时荧光定量PCR技术测定了FABP基因在三疣梭子蟹不同组织和不同发育阶段卵巢中的表达情况,探讨了Pt FABP在卵巢发育过程中的作用。Pt FABP基因全长893bp,包括289bp的5’UTR,405bp的ORF和199bp的3’UTR。该基因编码长度为134个氨基酸的多肽,其理论p I为5.92,分子量为15.13k Da。Pt FABP氨基酸序列与中华绒螯蟹同源性最高(72%),且有一个Lipocalin结构域。q PCR的结果表明:FABP在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,在卵巢中表达量最高,肝胰腺、眼柄中表达量中等,心脏、鳃、肌肉和血淋巴细胞中的表达较低。在卵巢发育过程中Pt FABP的表达量呈现先上升后下降的趋势,卵巢发育至近成熟期(Ⅳ期)时达到最高值,而在成熟排卵后不断降低。这与三疣梭子蟹卵巢发育伴随着脂类大量积累相关。因此上述研究结果表明,FABP可能参与调控三疣梭子蟹卵巢的发育,并且为后期胚胎的发育储存能量。     

生长前期三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)附肢再生系统解析及阶段划分

以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期幼蟹为材料,采用组织切片等方法研究其大螯断肢后再生生长规律。结果表明,第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期幼蟹大螯一次蜕壳再生率分别为59.9%,75.3%,74.2%,80.4%,69.5%;断肢组存活率分别为89.4%,84.9%,85.2%,89.4%和74.2%,均低于对照组的98.2%,90.3%,95.1%,90.2%和80.3%,但差异不显著(P0.05);第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期断肢组在去大螯后平均蜕壳周期分别为3.33d、4.47d和6.27d,显著长于正常组的2.13d、3.89d和5.63d)(P0.05),而第Ⅳ、Ⅴ期断肢组平均蜕壳周期分别为7.12d和10.86d,极显著长于对照组的6.11d和8.09d(P0.01),且断肢个体的生长期越往后,断肢再生所需时间越长。本研究依据再生附肢发育特点将三疣梭子蟹大螯断肢再生划分为6个标志性发育阶段:再生芽基期、肢芽趾缝期、肢芽分化期、肢芽斑点期、肢芽成熟期、肢体出膜期;第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期蟹再生肢芽横纵比平均值分别达到0.32、0.318、0.398、0.518、0.538时,断肢幼蟹可以达到附肢出膜的临界点。综上所述,三疣梭子蟹断肢后能在1个蜕壳周期内完成大螯再生,第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期断肢幼蟹蜕壳周期时间显著高于正常幼蟹;断肢组成活率低于对照组,但差异不显著,第Ⅳ期幼蟹的再生率和存活率均最高;各期幼蟹断肢再生附肢均经过6个具有标志性事件的发育阶段;各期再生肢芽横纵比值具有一定临界值(0.32,0.318,0.398,0.518,0.538)。本研究首次对三疣梭子蟹断肢再生过程及再生能力进行了探究,结果将有助于甲壳类断肢再生机理的阐明。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼体不同干露温度下死亡率的研究

通过设置15℃、20℃、25℃、30℃4个干露温度梯度,检测不同发育阶段三疣梭子蟹幼体的露空时间、死亡率、含水量、失水率及体重消耗率等指标,分析干露温度、发育阶段与幼体死亡率的关系。结果表明,各发育阶段的幼体死亡率均随干露时间的增加而升高(P<0.05);不同温度条件下,Ⅰ期幼蟹(CⅠ)的含水量、失水率和体重消耗率均高于Ⅱ期幼蟹(CⅡ)(P<0.05);CⅡ20℃时的露空时间最长,为11h,半致死时间为7—8h;30℃时最短,为2h;CⅠ15℃时的露空时间最短,为0.5h;20℃时最长,为4h。相同温度下,幼体各发育阶段的耐干露能力为CⅡ>CⅠ>ZⅣ>ZⅢ=M。结果说明,温度≤15℃不利于幼体的存活,温度≥25℃干露耐受性降低。因此,20℃更有利于幼体获得长存活时间。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雌雄性腺的差异转录组分析

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是我国东海海域具有重要经济价值的蟹类。为探讨雌雄梭子蟹性腺基因表达差异,挖掘与性腺发育相关基因,利用高通量测序技术对三疣梭子蟹雌雄性腺进行测序和生物信息学分析,为进一步研究其性腺发育及性别分化机制提供基础。测序结果经denovo组装共获得192848个转录本,130054个unigene。差异表达分析发现,其中101742个unigene上调,37588个unigene下调。在差异表达数据库中筛选出EcR、RXR、VTG等6个可能参与三疣梭子蟹的性腺分化发育的基因,并利用荧光定量PCR验证其在雌雄性腺中的表达情况,验证结果与转录组测序结果基本一致,为深入研究三疣梭子蟹性腺分化发育调控分子机理和相关功能基因提供了重要的基因数据资源。