杂交鲟(Sturgeon cartilage)软骨中硫酸软骨素的提取方法及分析鉴定

采用稀碱浸提、蛋白酶水解与三氯乙酸沉淀相结合脱蛋白的工艺,对杂交鲟软骨提取琉酸软骨素的方法进行了较系统的研究。综合考察各种影响因素,设计了正交试验对提取工艺参数进行了优化,并对产品的质量指标进行了检验。结果表明,最佳提取工艺参数为:碱提取时料液比为1:2.0,碱浓度为4%,碱提温度为40℃;胰蛋白酶的酶解温度为55℃,酶量为2%,酶解时间为10h,制备的硫酸软骨素为白色粉末,得率为28.9%,纯度为92.3%,蛋白质含量为2.59%,各项质量指标完全符合标准要求。与目前已报道的其他软骨素制备工艺相比较,该方法具有工艺简便,提取率高,产品纯度高的特点。光谱分析法结构鉴定结果表明它是一种软骨素肽,其主要成分为硫酸软骨素C。     

文蛤(Meretrix meretrix)C-型凝集素基因的分子克隆及表达分析

C-型凝集素是一种重要的模式识别蛋白,本研究以文蛤为材料。利用PCR扩增和RACE技术首次获得了编码文蛤C-型凝集素的基因(Mm-CTL)c DNA序列,全长为1855bp,其开放阅读框为519bp,编码172个氨基酸。Smart软件预测Mm-CTL的糖识别结构域(CRD)从第34个氨基酸到第168个氨基酸。BLASTP序列相似性分析显示,Mm-CTL与大竹蛏氨基酸序列同源性最高,相似性为56.5%,与其它无脊椎动物的相似性为13.5%—23.9%。系统进化树分析与同源分析结果一致,其中Mm-CTL与双壳类C-型凝集素聚在一起,与大竹蛏亲缘性最近。环境胁迫实验显示,溶藻弧菌感染6h时Mm-CTL表达量明显上升,在12h时达到最高值,随后有所下降。盐度胁迫时Mm-CTL在盐度5时表达量相对较低,在盐度10—20中的表达量相对较高。温度胁迫时Mm-CTL在35°C时表达量相对最高,10°C时表达量明显较低。研究结果表明,文蛤应对环境因子影响可通过调节Mm-CTL的表达来应答免疫反应。本研究将为贝类先天性免疫因子研究以及病害的防控奠定基础。     

磷沙蚕凝集素的分离纯化及生物活性研究

采用DEAE-Toyopearl阴离子交换树脂、Bio-Gel P-100分子筛层析、Lactosyl-Sepharose4B亲和层析和Sephadex 75分子筛层析技术从日本海的海洋无脊椎动物磷沙蚕(Chaetopterus variopedatus)中分离出2种凝集素,通过体外细胞活性和酶活性实验观察它们的生物活性。结果表明,从海洋无脊椎动物磷沙蚕中分离出一种β-半乳糖特异性凝集素(CVL)和一种具有血凝活性,但不被经测试的单糖和糖蛋白所抑制的相对分子质量为30 000的蛋白质(CVL-1)。β-半乳糖特异性凝集素(CVL)具有体外抑制NB4白血病细胞株的活性和抑制小鼠脾细胞的活性,IC50分别为7.87 mg/L和22 mg/L。同时,另一种蛋白质(CVL-1)具有β-葡萄糖苷酶活性。     

异育银鲫(Carassius auratus gibelio)源醋酸钙不动杆菌表型及分子鉴定

采用常规的培养特征、理化特性及分子生物学的方法,对从濒死异育银鲫(Carassius auratus gibelio)血液中分离到的菌株SY-1进行了致病性、表型生物学、分子生物学及药敏试验的系统研究。结果表明,该菌株在盐度5—30、pH6—8,温度10—42℃的LB液体培养基中均能生长,具有脲酶。该菌株16SrRNA基因序列(Gen Bank登录存取号:JX164201,长度1435bp)与其它不动杆菌属菌的16SrRNA基因同源性相似性在99%—100%之间,构建系统发育树确定该菌株为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)。人工回感可导致异育银鲫死亡。药敏试验结果显示:对恩诺沙星、强力霉素、萘啶酸、复方新诺明、氧氟沙星等10种抗生素敏感;对羧苄青霉素、诺氟沙星、大观霉素、卡那霉素、四环素等14种抗生素中度敏感;对氨苄西林、苯唑西林、林可霉素、万古霉素、氟苯尼考等15种抗生素耐药。     

硒(Ⅳ)对微藻生长的影响及NO对硒胁迫调控作用的初步研究

以小新月菱形藻和赤潮异弯藻为培养对象,研究不同浓度外源硒(Ⅳ)对微藻生长的影响,并初步研究了一氧化氮(NO)和高浓度硒对微藻生长的联合影响.结果表明:硒(Ⅳ)高浓度(10-4～10-5)时起抑制作用;低浓度时(10-7～10-9 mol/L)起促进作用,这与一般的微量元素的作用规律相似.每天2次加入1.4×10-9 mol/L NO能缓解一次性加入高浓度(10-5 mol/L)硒对微藻的毒性作用,这可能与NO能调控细胞内抗氧化系统有关.     

海洋中Fe(Ⅱ)的行为及微生物参与下的过程研究概述

Fe是海洋浮游植物生长所必需的营养元素,而Fe(Ⅱ)是可以被直接吸收利用的形态。由于Fe(Ⅱ)处于氧化还原的中间状态,且在产生和转化的过程中,与NO_3~-的还原和NH_4~+的氧化密切相关。因此,研究Fe(Ⅱ)的产生及消亡机制对于研究海区内的初级生产力及海洋中的C、N元素循环具有重要意义。而目前对于海水中Fe(Ⅱ)的迁移转化机制报道尚少。本文详细论述了海洋中Fe(Ⅱ)的产生机制及Fe(Ⅱ)的化学行为,重点探讨了厌氧微生物催化下,异化还原和铁氨氧化还原对Fe(Ⅱ)产生、消亡等循环过程的作用,以及对周围环境中N移除的影响。     

苯并(a)对大弹涂鱼肝脏抗氧化防御系统影响的初步研究

苯苯并并（（ａａ））芘芘((ＢＢａａＰＰ))是是一一种种具具强强致致癌癌性性的的多多环环芳芳烃烃,,广广泛泛存存在在于于受受污污染染的的海海洋洋环环境境中中。。早早期期对对苯苯并并（（ａａ））芘芘的的研研究究主主要要集集中中于于苯苯并并（（ａａ））芘芘暴暴露露与与终终反反应应—————癌癌变变的的发发生生或或肿肿瘤瘤的的形形成成之之间间的的相相关关性性研研究究。。近近年年来来,,通通过过对对苯苯并并（（ａａ））芘芘在在动动物物体体内内的的代代谢谢过过程程及及其其致致毒毒机机理理的的研研究究,,发发现现苯苯…     

藻酸双酯钠(PSS)遗传毒理学效应的初步研究

本研究是用紫露草微核技术检测新药藻酸双酯钠(PSS)的遗传毒理学效应。实验结果表明,PSS没有遗传毒性,却有保护染色体免受损伤的作用。其表现是使汞离子所产生的微核率明显下降。因而为扩大PSS的临床应用范围和使用安全提供了实验依据。     

一株大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Iridoviridae)的分离及鉴定

2018年7月,浙江省某大口黑鲈(Micropterus salmoides)养殖场暴发疑似病毒引起的疾病。现场采样发现,病鱼体长约15—20cm,鱼体于水面下暗游,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究通过采用鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(majorcapsidprotein,MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大口黑鲈中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大口黑鲈虹彩病毒宁波分离株(LMBIV-NB001)。EPC经患病鱼组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的EPC细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,EPC细胞质中存在大量直径约120nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鱼组织样本进行PCR扩增,获得了1029bp的目的基因片段。将该扩增片段连入pMD19-T simple质粒后测序,经BLAST比对分析显示,其与GenBank中已报道的鳜鱼蛙病毒NH-1609、大口黑鲈溃疡综合征病毒BG/TH/CU3、EPC060608-08的MCP基因同源性最高,相似度均达到99.13%。构建系统进化树分析表明,本研究分离的LMBIV-NB001株与NC_038508、GU256635、MG941005等虹彩病毒科蛙病毒属毒株聚成一簇。本论文研究结果为不同地区蛙病毒属成员的起源和分化等相关研究等提供了基础材料。     

绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)鱼皮胶原蛋白的分离纯化及理化性质研究

利用酸溶法和酶溶法分离纯化绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)鱼皮酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC),并对所得的ASC和PSC的氨基酸组成、亚基组成、红外光谱(FTIR)、黏度和热变性温度,以及溶解度等性质进行系统分析。研究结果表明:马面鲀鱼皮酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC)的得率分别为0.87%±0.15%和9.52%±0.41%(按鱼皮干重计算)。ASC和PSC中含有的主要氨基酸为甘氨酸(Gly),含量分别为323.3残基/1000残基和321.7残基/1000残基;二者中所含的亚氨基酸含量分别为191.1/1000残基和183.4/1000残基。氨基酸组成分析、SDS-PAGE和FTIR证实马面鲀鱼皮酸溶性胶原蛋白(ASC)为I型胶原蛋白,且其SDS-PAGE图中的亚基组成(α1-肽链和α2-肽链)、氨基酸序列,以及胶原蛋白构型与PSC明显不同。ASC和PSC的热变性温度(Td)分别为21.5℃和18.9℃,显著低于哺乳动物来源的胶原蛋白。ASC和PSC的最大溶解度出现在p H 2—3时,当Na Cl的浓度低于2%时,二者的溶解度就开始急剧下降。此外,冻干的胶原蛋白显示出疏松多孔的超微结构。综上,相对于哺乳动物类胶原蛋白,马面鲀鱼皮ASC和PSC的亚氨基酸含量和热变性温度较低,结构稳定性差,易于降解,可作为胶原蛋白肽的制备原料进行开发利用。     

栉孔扇贝(chlamys farreri)外套膜组织原代培养的初步研究

以栉孔扇贝(chlamys farreri)外套膜为材料,采用几种除菌方法进行除菌处理后,应用自己设计的培养基对其进行了原代培养。实验结果表明,以青霉素、链霉素和复方洗必泰混合溶液除菌,对组织损伤小,除菌彻底。在此培养条件下,栉孔扇贝外套膜细胞能正常迁出和生长。     

一株大口黑鲈源ST-873型肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的分离鉴定及生物学特性研究

从患腹水病大口黑鲈(Micropterus salmoides)的头肾、脾脏、肝脏组织中分离到一株优势菌,生长出圆形、边缘整齐的灰白色黏液状菌落;染色镜检可见短粗、卵圆形、有荚膜的革兰氏阴性杆菌。结合形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析鉴定为肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),MLST分析进一步确定其为ST-873型,与ST-65型聚为一支;该菌株携带aere、alls、wca和ybt四种毒力基因,具有溶血活性;人工感染大口黑鲈,发现患病鱼呈现腹水等与自然发病类似的症状,且病鱼内脏的分离菌株与攻毒菌株相同;经统计,其LD50为3.4×10⁷ CFU/mL,具有中等生物被膜形成能力。耐药性分析结果显示,该菌株携带bla-shv、sul2、aadA和tetB四种耐药基因,对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、黏菌素类药物敏感,对四环素类、磺胺类、林可酰胺类、利福霉素类耐药;中药三七、款冬花对分离菌株有明显抑制作用。研究探明了大口黑鲈腹水病的主要病原,可为鱼源肺炎克雷伯菌的诊断和防治提供科学依据和数据参考。     

中部太平洋大眼金枪鱼(Thunnus obesus)种群遗传结构的初步研究

大眼金枪鱼(Thunnus obesus)是世界最重要的渔业资源之一,经济价值较高,捕捞压力的加大使中部太平洋大眼金枪鱼过度捕捞程度愈发严重。开展种群遗传结构研究将为大眼金枪鱼资源的可持续利用与开发提供科学依据。本文以取自中西太平洋和中东太平洋共182尾大眼金枪鱼个体为研究对象,分析研究其线粒体DNA控制区第一个高变区(the first hypervariable region,HVR-1)457bp的序列,共发现115个变异位点,定义了178种单倍型。序列多样性分析结果显示:8个采样点核苷酸多样性在0.03074—0.04362之间,单倍型多样性在各个采样点都较高,变动范围在0.996—1.000之间;分子方差分析显示99.97%的遗传变异性来自于种群内;群体间的高基因交流值Nm和低分化指数Fst揭示中东太平洋与中西太平洋群体间基因交流频繁,不存在显著的遗传分化。     

海水中铜(Ⅱ)-固体粒子-氨基酸相互作用的红外光谱研究

本文测定了“氨基酸一CU(Ⅱ)-氧化物、粘土、碳酸钙”体系的红外光谱。结果表明:(1)对于“氨基酸-固体粒子”体系,吸附态氨基酸通过其-NH_3~+基团,而不是-COO~_,与表面羟基缔合。(2)对于“氨基酸-Cu(Ⅱ)”表面络合物,氨基酸之-NH_3~+与表面羟基缔合,而-COO~-与Cu(Ⅱ)络合,形成S-AA-Cu表面三元络合物。(3)随着Cu(Ⅱ)交换量增加,固体粒子-氨基酸-Cu(Ⅱ)之间的相互作用使表面缔合羟基发生分级变化。     

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)促性腺激素释放激素(GnRH)基因的鉴定、特征及成熟期的表达研究

促性腺激素释放激素（GnRH）在脊椎动物的繁殖过程中起着至关重要的作用,同时也存在于许多无脊椎动物中。利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆出曼氏无针乌贼（Sepiella japonica）促性腺激素释放激素（命名为SjGnRH,KP 982885.1）。SjGnRH基因的cDNA全长710 bp,开放阅读框（ORF）为273 bp,编码90个氨基酸,包括一条含有31个氨基酸的信号肽、12个氨基酸的GnRH多肽和44个氨基酸的GnRH相关肽（GAP）;SjGnRH与剑尖枪乌贼（Uroteuthis edulis）和真蛸（Octopus vulgaris）的同源性分别为86.7%和73.3%;SjGnRH高度保守的十二肽与剑尖枪乌贼和真蛸的octGnRH相似度达100%,其信号肽的相似性分别为66.7%和54.8%,GAP区的相似性分别为95.5%和77.3%;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示,SjGnRH基因在成熟期的表达具有特异性,在脑中表达量最高,且与其他组织差异显著（P<0.05）;采用原位杂交技术检测SjGnRH mRNA在脑内的表达模式,结果表明：SjGnRH在食道上神经团、食道下神经团和视叶的不同部位均有表达,暗示SjGnRH可能参与曼氏无针乌贼的生殖调控作用。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)铁蛋白的分子鉴定、表达及功能研究

铁蛋白(Ferritin,Fer)是一类广泛存在于生物体内、并与铁代谢密切相关的铁储存蛋白。本研究通过香鱼(Plecoglossus altivelis)单核/巨噬细胞转录组测序获得铁蛋白亚基基因(Pa Fer)c DNA全序列,结果显示,Pa Fer由943个核苷酸组成,开放阅读框为531bp,编码176个氨基酸,预测相对分子质量为20.4k Da,等电点为5.46。氨基酸序列多重比对结果显示,Pa Fer具有保守的铁蛋白样双铁结构域,与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和大西洋鲑(Salmo salar)Fer M亚基(Fer-M)同源性最高,均为92%;系统进化树分析表明,Pa Fer与胡瓜鱼、大西洋鲑和虹鳟的Fer-M聚为一个小簇,与虹鳟Fer-M进化相关性最高。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)结果表明,Pa Fer m RNA主要在香鱼脾脏中表达量最高,肾脏、鳃、脑和心脏中次之;鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后,香鱼肝脏、脾脏和肾脏等组织中Pa Fer m RNA表达显著上调。原核表达了Pa Fer重组蛋白(r Pa Fer),r Pa Fer以包涵体形式表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,尿素梯度透析法复性r Pa Fer。铁螯合实验结果显示,当r Pa Fer浓度为4μg/m L时,螯合铁的能力最大,为43.96%。抑菌实验结果表明,r Pa Fer对鳗弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的最小抑菌浓度分别为1.5625、25.0和100.0μg/m L。综上,Pa Fer与香鱼抗病原感染的免疫反应紧密相关,可能通过调控铁代谢参与鱼类抵抗微生物的宿主自身免疫过程。本研究为进一步研究鱼类Fer的功能及在病原菌感染免疫中的分子机制奠定基础。     

兼性厌氧海洋细菌Shewanella sp.N3B_R的分离鉴定及产电性能分析研究

本研究的目的是利用聚苯胺修饰双室微生物燃料电池(MFC),从海水养殖废水中分离筛选阳极海洋产电菌,并利用响应面Box-Behnken设计优化各产电因子,提高产电性能.从海水养殖池塘的废水和污泥中分离出一株兼性厌氧海洋菌株,利用16SrRNA基因序列和API20NE生化分析进行鉴定,采用扫描电镜进行菌株形态的观察.采用循...     

基于低压核磁共振(LF-NMR)技术对东海带鱼(Trichiurus lepturus)保鲜品质及水分迁移特性的研究

为探究东海带鱼(Trichiurus lepturus)在低压核磁共振(LF-NMR)技术下的品质变化及水分迁移特性,以挥发性盐基氮(TVB-N)含量、pH、水分含量为指标,并分析NMR横向弛豫时间T₂反演谱图和MRI成像,研究不同电场强度(DY₁~DY₄分别为0,2,2.5,3kV/m)对带鱼内部水分迁移及品质的影响。分析TVB-N数据发现,DY₃(E=2.5kV/m)、DY₄(E=3kV/m)在贮藏后期表现出更佳的保鲜优势。在0~40d贮藏期内,不同电场强度条件下的带鱼pH值均呈先降后升趋势。电场的添加能降低自由水的流动性,抑制微生物生长,减少带鱼体内水分流失。分析NMR横向弛豫时间T₂反演谱图发现,T₂₁、T₂₂、T₂₃峰面积均有不同程度减小,其中T₂₂信号幅度变化最大,表明电场的添加能改变带鱼体内水分迁移路径,维持较高的水分含量,增加带鱼持水性和保水性。MRI成像图表明在贮藏期间,电场处理后带鱼水分保有率得到了提升,保鲜效果优于未施加电场带鱼,且电场强度越大,体外迁移水分越少。实验表明低压核磁共振(LF-NMR)技术对东海带鱼具有良好的保鲜效果,对低压核磁共振(LF-NMR)技术的保鲜应用提供一定的理论指导作用。<     

香鱼(Plecoglossus altivelis)养殖群体遗传多样性的AFLP分析及性别特异性分子标记筛选

采用扩增片段长度多态性(AFLP)技术分析了香鱼(Plecoglossus altivelis)养殖群体的遗传多样性,并筛选性别特异性分子标记。结果表明,15对选扩引物组合共扩增到889个位点,其中多态性位点380个,多态率为42.74%;群体Nei氏遗传多样性指数为0.1454,Shannon氏指数I为0.2174。香鱼养殖群体的遗传多样性较丰富,处于中等偏上水平。仅引物组合E-ATG/M-CTG扩增到1条雄性特异性条带,长度为139bp。以该雄性特异性AFLP条带的DNA序列为模板,设计1对特异的PCR引物并在10尾已知性别的香鱼(雌雄各5尾)中扩增检验,结果显示5尾雄鱼均可扩增到目的条带而5尾雌鱼均无扩增。表明该序列是雄性特异性分子标记,可用于鉴别香鱼的遗传性别,并为香鱼的性别决定机制和性别控制研究奠定基础。     

白斑综合症病毒(WSSV)感染对虾的途径及滴度研究

本研究利用荧光定量PCR技术,开展了白斑综合征病毒(WSSV)感染途径及染病最低病毒浓度的研究.用病毒分别感染对虾的口腔、鳃、背部甲壳和腹部软壳24 h后,利用qPCR测定血液中的病毒拷贝数,结果显示病毒主要通过口腔和鳃入侵宿主,并通过血液循环进行全身感染,但病毒不能穿过对虾的体表引起感染.此外,将对虾分别放在含不同病毒粒子浓度(101、102、103、104、105个/dm3)或含核衣壳的海水中培养,发现当海水中病毒粒子浓度低于102个/dm3时,对虾没有感染病毒,当浓度达到103个/dm3以上时能引起对虾感染.结果暗示103个/dm3是引起对虾感染的最低病毒粒子浓度,而核衣壳则不具有感染性.