海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒硫氧还蛋白(TRX)基因的克隆及生物信息学分析

首次从海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyi virus-EhV99B1)中克隆了硫氧还蛋白(Trx)基因(该序列已提交GenBank,登录号:GU109280)。系统进化关系分析表明:EhV99B1-Trx与GenBank中已报道的EhV86-Trx(NC_007346)有很高的同源性,核酸及其推导的氨基酸序列的同源性分别为98%和100%,而与其它物种的Trx序列同源性仅为9.8%-18.8%。采用生物信息学方法和工具分析了EhV99B1-Trx的生化参数,预测了该蛋白的高级结构。结果表明:(1)EhV99B1-Trx基因的开放阅读框全长591bp,编码196个氨基酸,蛋白的相对分子量为22.1kDa,理论等电点为5.27;(2)EhV-99B1-Trx N端蛋白结构域具有保守的Cys-Gly-Pro-Cys(CGPC)硫氧还蛋白氧化还原活性位点氨基酸基序;(3)对该蛋白二、三级结构分析预测结果进一步证实EhV99B1-Trx基因编码的为一种新型的硫氧还蛋白家族成员。     

海洋球石藻病毒(Coccolithovirus)硫氧还蛋白(Trx)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其活性分析

从实验室保存的pBS-Trx重组质粒中克隆球石藻病毒EhV-Trx基因,构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-EhV-Trx,将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,诱导分泌表达并对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析。结果表明,EhV-Trx基因开放阅读框为591bp,编码197个氨基酸;在毕赤酵母GS115中成功诱导表达重组EhV-Trx,经SDS-PAGE分析目的蛋白分子量约为27.8kDa;重组EhV-Trx具有二硫键还原酶的活性,能有效打开胰岛素A、B两条链的二硫键,有望开发成一种新型的硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。     

海洋球石藻(Emiliania huxleyi)磷脂酶C的结构特点及系统进化分析

磷脂酶C(phospholipase C,PLC)作为一种重要的细胞信号分子,是G蛋白信号转导过程中的重要调节因子之一,在动、植物环境胁迫应答及病原菌致病过程中发挥重要作用。海洋浮游植物生长代谢与环境因子之间的相互作用涉及细胞内复杂的信号通路,并最终通过调节细胞分裂过程控制浮游植物的增殖、种群生长动力及初级生产力。但对浮游植物PLC及其参与的信号通路的了解却非常少。通过NCBI基因数据库的关键词搜索、比对,发现海洋球石藻(Emiliania huxleyi)中含有30种PLC蛋白,利用SMART程序预测其结构保守域,以此将30种PLC分为四大类;对其氨基酸序列的信号肽、跨膜结构域、一级结构、二级结构、三级结构及其细胞定位等进行了生物信息学分析和预测。结果表明,海洋球石藻PLC具有丰富的多样性,它们在信号肽、跨膜区等方面均有一定的差别,其一级结构中存在多个可能的磷酸化修饰位点。二级结构中都含有α螺旋,β折叠,无规则卷曲,且都定位于线粒体,而三级结构相似度不高。从亲缘关系上看,海洋球石藻PLC与低等动物更接近。该研究补充和完善了对植物PLC信号转导网络系统的认识,并为进一步开展海洋球石藻PLC细胞定位及其参与的信号通路与环境胁迫之间关系的研究提供了重要的理论指导。     

海洋球石藻(Emiliania huxleyi)活性物质分离鉴定及其抗菌抗氧化性能研究

以海洋球石藻Emiliania huxleyi为原料,提取分离生物活性物质,为该藻活性物质的研究与开发提供理论基础。通过对球石藻75%乙醇浸提物采用乙酸乙酯进行萃取,进一步利用薄层色谱、硅胶色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱及高效液相色谱(HPLC)等方法,对化合物成分进行逐步分离纯化,获得纯度大于95%的单体化合物;通过~1HNMR、~(13)CNMR及HRMS等波谱分析技术鉴定化合物的结构,并对其抗菌、抗氧化性能进行初步分析。结果分离鉴定出3种单体化合物,分别为叶绿醇(C_(20)H_(40)O)、棕榈酸(C_(16)H_(32)O_2)和肉豆蔻酸(C_(14)H_(28)O_2),这些化合物均为首次从海洋球石藻中分离获得。其中叶绿醇具有较强的抗氧化能力,且对肝癌细胞Hep G2的增殖有较强的抑制作用,其他两种化合物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及副溶血性弧菌均有不同程度的抗菌活性。另外,海洋球石藻中这些化合物除了具有一定的抗菌抗氧化性能外,可能在球石藻响应胁迫(如病毒感染)过程中也具有重要作用。     

依据减数分裂相关基因数量判别赫氏球石藻(Emiliania huxleyi)繁殖方式研究

繁殖方式是生物重要生物学特征之一。了解生物繁殖方式对遗传和育种研究具有重要意义。赫氏球石藻(Emiliania huxleyi)呈世界性分布,在生态系统中扮演重要角色,但其繁殖方式未知。本研究用分子系统学方法确定有基因组序列且行有性生殖的真核生物的减数分裂相关基因数量,建立了"减数分裂相关基因≥19个,其中减数分裂特异基因≥5个"的有性生殖判别标准;发现赫氏球石藻具有25个减数分裂相关基因,包括6个减数分裂特异基因。依据建立的标准判定赫氏球石藻行有性生殖。研究结果将有助于赫氏球石藻生活史和遗传学研究。     

一种新的海洋微藻病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆表达及其活性分析

从海洋球石藻Emiliania huxleyi病毒EhV99B1的基因组中克隆了丝氨酸蛋白酶(Sp)基因(GenBank登录号:KC161207),对该基因的开放阅读框(ORF)进行系统的生物信息学分析,并在大肠杆菌中融合表达,通过亲和层析法获得了纯化的重组Sp。结果表明:EhV99B1-Sp基因的ORF为1 110bp,编码368个氨基酸,蛋白相对分子质量为39.5kDa;该基因片段与GenBank中EhV86-Sp的同源性很高,核苷酸及其对应的氨基酸序列同源性分别为95%和97%,而与其他物种Sp序列的同源性仅为28%~32%,说明其可能是丝氨酸蛋白酶家族中的一个新成员;预测的二级结构特征显示EhV99B1-Sp的蛋白结构域中具有典型的LTAGHC(组氨酸活性位点区域)和AICNGDSGGPLF(丝氨酸活性位点区域)两个丝氨酸蛋白酶催化活性位点的氨基酸基序,是一个两次跨膜蛋白;将该基因在大肠杆菌中进行低温诱导表达,得到分子量为60kDa的重组蛋白,经鲤鱼肌肉丝氨酸蛋白酶(MBSP)抗体检测证实为Sp,且重组蛋白在大肠杆菌细胞中具有明显的生物学活性。本研究结果为进一步探讨EhV99B1-Sp在病毒与宿主相互作用过程中的调节作用及其功能与应用奠定基础。     

富硒海洋球石藻(Emiliania huxleyi)的培养及其硒蛋白的初步分离纯化

在不同浓度亚硒酸钠(Na2SeO3)条件下培养海洋球石藻,分析其生长和富集硒情况,并采用(NH4)2SO4分级盐析、DEAE-Sepharose离子交换柱层析和SephacrylS-200凝胶过滤层析方法,对球石藻硒蛋白进行了初步分离纯化。结果表明,在本实验条件下,不添加外源硒的f/2培养基本底硒浓度(约3.2nmol/L)为海洋球石藻最佳生长和富硒的硒浓度,其细胞内硒含量可达到6475?g/g干重。离子交换和凝胶层析分离的含硒蛋白结合的最高硒含量分别达到392.3ng/mg和663.5ng/mg蛋白。SDS-PAGE纯度鉴定显示,在分子量分别约为41.3kDa和30.1kDa处各有单一电泳条带。结果提示,海洋球石藻能在环境硒浓度极低的条件下大量吸收硒并将大部分无机硒转化为硒蛋白。富硒能力较强的海洋球石藻有望作为一种新的有机硒资源,对开发含硒安全性食品具有很大的应用潜力。     

海洋球石藻(Emiliania huxleyi)通用表达载体的构建与电转化

海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布的真核浮游植物,该种不仅是海洋碳、硫循环和全球气候变化的重要指示物种,而且能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术领域也具有很好的应用前景。本文通过分析氨苄青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、链霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7种常用抗生素对海洋球石藻生长的影响,确定G418可作为该藻阳性转化藻株的抗性筛选试剂,其对应的抗性基因neo则作为该藻表达载体构建中的抗性筛选标记。在此基础上克隆了绿色荧光蛋白基因gfp、抗性标记基因neo及E. huxleyi BOF92内源性岩藻黄素-叶绿素a/c结合蛋白基因的启动子fcp,以pUC18为基础载体,构建了pUC18-fcp-gfp和pUC18-fcp-neo两个重组表达载体,以电转化方法共转化球石藻细胞并结合选择性固体培养基筛选,成功获得了被转化的球石藻细胞。海洋球石藻遗传转化系统的建立为进一步开展该种相关的基础生物学研究及其在生物技术领域的应用奠定了基础。     

青蛤(Cyclina sinensis)金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因的克隆与表达分析

利用构建的cDNA文库及高通量测序方法,获得金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因全长。结果表明,青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白的cDNA全长分别为776bp和804bp,金属硫蛋白基因编码74个氨基酸,包含7个CXC特征结构;硫氧还蛋白基因编码165氨基酸,包含5个氨基酸构成的活性中心。采用实时定量PCR方法分析了两种基因在Cd2+胁迫下的表达变化,结果显示,金属硫蛋白基因在Cd2+胁迫下6—12hmRNA表达量急剧上升,与对照组有显著性差异(P<0.01)。硫氧还蛋白基因在Cd2+胁迫下mRNA在6h明显升高,在6—24h与对照组出现显著性差异(P<0.05)。说明Cd2+能够诱导青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白基因表达的时序性升高,二者的转录过程反映了贝类抵御重金属胁迫的分子调控过程。     

冈村枝管藻叶绿体psbA基因的克隆及序列分析

psbA基因编码光合系统Ⅱ反应中心的D1蛋白,是叶绿体基因组中一个重要的光调控基因.根据网管藻(Dictyosiphon foeniculaceus)、髋藻(Myelophycus simplex)、粗粒藻(Asperococcus fistulosus)、索藻(Chordaria flagelliformis)、点叶藻(Punctaria latifolia)、水云(Ectocarpus siliculosus)、铁钉菜(Ishige okamurae)、绳藻(Colpomenia sinuosa)、网胰藻(Hydroclathrus clathratus)、幅叶藻(Petalonia fascia)等10种藻类的psbA基因高度保守序列,设计引物,利用PCR方法从冈村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)基因组DNA中扩增出约750 bp的片段,将该片段连接到pMD18-T载体上进行序列测定.结果表明:片段长度为737bp,推导的245个氨基酸序列与网管藻、髋藻、粗粒藻、索藻、点叶藻、水云、铁钉菜、绳藻、网胰藻、幅叶藻的D1蛋白相对应的氨基酸序列的同源性均高于96%.该基因序列已被GenBank收录,登录号为EU332142.     

Cloning, expression and characterization of serine palmitoyltransferase (SPT)-like gene subunit (LCB2) from marine Emiliania huxleyi virus (Coccolithovirus)

The authors have isolated and characterized a novel serine palmitoyltransferase(SPT)-like gene in marine Emiliania huxleyi virus(EhV-99B1).The open-reading frame(ORF) of EhV99B1-SPT encoded a protein of 496 amino acids with a calculated molecular mass of 96 kDa and Ip 6.01.The results of sequence analysis showed that there was about 31%-45% identity in amino acid sequence with other organisms.The maximum likelihood phylogenetic tree suggested that the EhV99B1-SPT gene possibly horizontally transferred from the eukaryote.Hydrophobic profiles of deduced amino acid sequences suggested a hydrophobic,globular and membrane-associated protein with five transmembrane domains(TMDs) motifs.Several potential N-linked glycosylation sites were presented in SPT.These results suggested that EhV99B1-SPT was an integral endoplasmic reticulum membrane protein.Despite lower sequence identity,the secondary and three-dimensional structures predicted showed that the "pocket" structure element composed of 2α-helices and 4βsheets was the catalytic center of this enzyme,with a typical conserved "TFTKSFG" active site in the N-terminal region and was very close to those of prokaryotic organisms.However,the N-terminal domain of EhV99B1-SPT most closely resembled the LCB2 catalysis subunit and the C-terminal domain most closely resembled the LCB1 regulatory subunit of other organisms which together formed a spherical molecule.This "chimera" was highly similar to the prokaryotic homologous SPT.For a functional identification,the EhV99B1-LCB2 subunit gene was expressed in Escherichia coli,which resulted in significant accumulation of new sphingolipid in E.coli cells.     

白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因的克隆及在蓝藻中表达载体的构建

用蔗糖密度梯度离心法分离纯化白斑综合症病毒（WSSV）。设计并合成引物，提取WSSV中国株的基因组DNA作为模板，通过PCR，扩增克隆出VP28基因，利用BamHI和EcoRI切点将VP28基因插入克隆载体pUC19 的多克隆位点上，得到VP28基因的重组克隆质粒，对其进行双向DNA测序。测序结果表明，该基因含有615个核苷酸，与GenBank中已有不同来源的WSSV的序列片段同源性为100％。利用BamHI切点将VP28的基因插入到穿梭表达载体启动子PpsbA的下游，EcoRI酶切鉴定，得到正向连接的可在蓝藻表达的重组穿梭表达载体，命名为pRL-VP28。     

文蛤(Meretrix meretrix)C-型凝集素基因的分子克隆及表达分析

C-型凝集素是一种重要的模式识别蛋白,本研究以文蛤为材料。利用PCR扩增和RACE技术首次获得了编码文蛤C-型凝集素的基因(Mm-CTL)c DNA序列,全长为1855bp,其开放阅读框为519bp,编码172个氨基酸。Smart软件预测Mm-CTL的糖识别结构域(CRD)从第34个氨基酸到第168个氨基酸。BLASTP序列相似性分析显示,Mm-CTL与大竹蛏氨基酸序列同源性最高,相似性为56.5%,与其它无脊椎动物的相似性为13.5%—23.9%。系统进化树分析与同源分析结果一致,其中Mm-CTL与双壳类C-型凝集素聚在一起,与大竹蛏亲缘性最近。环境胁迫实验显示,溶藻弧菌感染6h时Mm-CTL表达量明显上升,在12h时达到最高值,随后有所下降。盐度胁迫时Mm-CTL在盐度5时表达量相对较低,在盐度10—20中的表达量相对较高。温度胁迫时Mm-CTL在35°C时表达量相对最高,10°C时表达量明显较低。研究结果表明,文蛤应对环境因子影响可通过调节Mm-CTL的表达来应答免疫反应。本研究将为贝类先天性免疫因子研究以及病害的防控奠定基础。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的流行病学调查

传染性皮下和造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)是对虾养殖的重要病原之一,可感染多种虾种。罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是中国养殖的重要沼虾品种之一。根据国际兽疫局(Office International des Epizooties,OIE)推荐的IHHNV检测方法,在中国大陆地区首次开展IHHNV在罗氏沼虾中的感染和流行情况调查。结果显示,在研究区的罗氏沼虾养殖区,IHHNV广泛流行,阳性率高达90%;但所有成年罗氏沼虾均未表现出明显的病症,仅表现为病毒的携带。通过基因序列分析显示,检测到的华南地区毒株属于Ⅰ型感染株,与菲律宾株进化关系较为接近;华东地区毒株属于Ⅱ型感染株,与东南亚株进化关系较近。本研究为IHHNV在罗氏沼虾内的感染、流行和防控提供了详细参考。