黄喉拟水龟体表溃疡病原菌SG_(24)的分类鉴定

从患溃疡的黄喉拟水龟病灶中分离到一株病原菌SG24。对菌株SG24进行了常规生理生化测定和ATBExpression半自动细菌鉴定仪鉴定,并测定16S rRNA序列,分析其与相关细菌相应序列的同源性,构建了系统进化树。普通细菌学方法结果显示菌株SG24为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。以沙雷氏菌属的16S rRNA基因序列设计一对引物进行PCR扩增,获得了菌株SG24大小约950 bp的16S rRNA部分基因片段,测序结果显示菌株SG24与黏质沙雷氏菌同类,与已登录的黏质沙雷氏菌(S.marcescensDQ207558)的16S rRNA同源性大于99%。综合以上分类鉴定结果,确定菌株SG24属于沙雷氏菌属的黏质沙雷氏菌。药物敏感试验结果表明:菌株SG24对链霉素、庆大霉素、壮观霉素、强力霉素、卡那霉素、阿米卡星、诺氟沙星、氧氟沙星和复方新诺明敏感。     

基于PCR和TOF-MS海洋源产脂肽芽孢杆菌筛选

【目的】准确高效分离红树林等海洋环境中产脂肽芽孢杆菌。【方法】将前期从红树林环境筛出具有抗菌活性的12株芽孢菌株作为研究菌株,采用溶血活性及排油作用对其中的可能产脂肽菌株进行初步筛选,并基于脂肽合成酶基因PCR扩增法对脂肽合成酶基因携带菌复筛,采用飞行时间质谱(TOF-MS)对所产脂肽进行鉴定。【结果】初步发现6株芽孢杆菌具有溶血活性,其中HY-5、HY-4和HN-9这3株具有排油能力,油层透明圈的直径分别为45、32和3 mm。PCR扩增检测到HY-5含有iturin、surfactin和bacillomycin D合成酶基因,HY-4含有iturin、surfactin合成酶基因,HN-9含有iturin合成酶基因。TOF-MS检测到HY-5和HY-4的发酵液含surfactin、iturin和bacillomycin 3种脂肽,HN-9的发酵液只含iturin。【结论】基于PCR与TOF-MS为核心的级联技术,建立一种海洋源脂肽产生菌快速筛选以及脂肽谱快速鉴定的方法,解决海洋源芽孢杆菌在常规培养基难合成脂肽造成的漏筛情况。     

大口黑鲈肠道益生菌的分离与鉴定

【目的】分离鉴定大口黑鲈（Micropterus salmoides）肠道益生菌,评估分离菌用作饲料添加剂的益生潜力。【方法】采集大口黑鲈肠道样本,采用稀释涂布法分离细菌,经16S rRNA序列比对和生化试验鉴定种属,并进行抗逆性能、黏附能力、溶血活性和药敏特性等鉴定。【结果】从大口黑鲈肠道分离菌株84株,经测序、blast比对,筛选出3株同源性最高的菌株MS-1、MS-2、MS-3,分别鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。3株分离菌均为γ-溶血,不具有生物膜,疏水性50%～93.3%,自凝集性43.6%～69.2%;可在pH 2.0～12.0环境和5.0 g/L胆盐中存活;经高温处理后仍可生长;3株菌对大多数抗生素敏感。【结论】芽孢杆菌MS-1、MS-2和MS-3抗逆性高,黏附性能及饲料学安全性高,可作为大口黑鲈养殖中潜在益生菌。     

海洋动物肠道中抗氧化活性乳酸菌的分离及多样性分析

【目的】分析海洋动物肠道中抗氧化活性乳酸菌的多样性,并对活性菌株胞外与胞内代谢物清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力进行测定。【方法】采用溶钙圈分离培养技术和DPPH自由基清除法,从湛江海域6种海洋动物肠道中分离活性乳酸;通过构建16S rDNA基因序列系统发育树,分析其多样性;利用DPPH自由基清除法,测定其抗氧化活性。【结果】共分离得到16株抗氧化活性乳酸菌,分属于细菌域厚壁菌门(Firmicutes)的4个科(Leuconostocaceae,Streptococcaceae,Lactobacillaceae,Enterococcaceae)、6个属(Weissella,Pediococcus,Leuconostoc,Lactococcus,Lactobacillus,Enterococcus),其中除菌株zy-3、LY-87、ZH-54的16S r DNA基因序列与数据库EzBioCloud中的模式菌相似性100%外,其余13株活性菌株与模式菌存在一定的遗传差异(97.42%～99.93%),菌株zy-I与模式菌株Weissella cibaria(KACC11862T)的相似性仅为97.42%,推测为Weissella cibaria属中的潜在新种;16株活性菌株胞外代谢物对DPPH的抗氧化活性均大于胞内代谢物,且5株乳酸菌株(zy-4、zy-s6、YM-49、ZH-53、ZH-54)的胞外的DPPH清除能力均在45%以上,高于其它11株菌株。【结论】湛江海域动物肠道中存在较为丰富的抗氧化活性乳酸菌,并蕴藏潜在乳酸菌新种。     

拮抗香蕉枯萎病菌海洋细菌的筛选和鉴定

从93份中国南部海域近海海泥样品中分离出1800多株海洋细菌,以对峙培养法,测定海洋细菌对香蕉枯萎菌的拮抗作用,再以琼脂划线培养法(agar streak)测定菌株的抑菌活性,结果表明:约55.6%的菌株对香蕉枯萎菌有一定的拮抗作用,其中58株菌株抑制香蕉枯萎菌生长所形成的抑菌带宽度大于10.0mm,抑菌作用较好,复筛后其中13个菌株形成的抑菌带宽在15.0mm以上。经反复转接和对峙培养,筛选出拮抗效果好、抑菌活性稳定的菌株TC-1,初步鉴定为芽孢杆菌属的细菌,TC-1对14种病原微生物都有较好的抑菌效果。     

海南红树林内生真菌Endomelanconiopsis endophytica次级代谢产物及其体外生物活性

【目的】研究源自海南红树林植物角果木(Ceriops tagal)内生真菌Endomelanconiopsis endophytica的次级代谢产物及其体外生物活性。【方法】利用正相硅胶柱层析、反相ODS柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、半制备高效液相色谱等色谱分离方法,对该菌发酵产物的乙酸乙酯浸膏的次级代谢产物进行分离纯化;综合利用核磁共振波谱(NMR)、质谱(MS)等波谱学技术以及与文献数据比对,鉴定化合物的结构;并对化合物进行体外细胞毒活性和免疫抑制活性评价。【结果】从内生真菌Endomelanconiopsis endophytica中分离得到9个化合物,其结构分别鉴定为(4E,8E)-2-N-(2-hydroxypalmitoyl)-1-O-(β-D-glucopyranosyl)-9-methyl-4,8-sphingadienine(Ⅰ)、2-(1-hydroxyethyl)quinazolin-4(3H)-one(Ⅱ)、uridine(Ⅲ)、citreoisocoumarinol(Ⅳ)、5-hydroxymellein(Ⅴ)、roccellatol(Ⅵ)、...     

凡纳滨对虾烂尾病病原的分离鉴定及药敏分析

【目的】研究广东湛江地区凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)烂尾病主要病原及其药敏特征。【方法】从对虾病灶部位分离纯化细菌,用2株代表菌株对健康虾进行创伤浸浴感染试验,分析菌株形态特征、生理生化特征以及16S rRNA和HSP60基因序列,以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和坎氏弧菌(V. campbelli)溶血素基因特异引物扩增菌株基因组DNA,通过纸片扩散法测试菌株对17种药物的敏感性。【结果】从患病亲虾和养殖对虾分别分离获得编号2018B22和2018MZ1的代表菌,两株菌16Sr RNA和HSP60基因序列均与哈维氏弧菌最相似,且均可被哈维氏弧菌溶血素基因引物特异扩增,表型特征亦与哈维氏弧菌相近;两株菌均可引起凡纳滨对虾烂尾病,其中菌株2018B22的致病力较2018MZ1更强,而后者的耐药谱更广。【结论】湛江地区凡纳滨对虾烂尾病主要病原为哈维氏弧菌。     

噬菌弧菌N1对淡水和海水养殖水体细菌群落影响PCR-DGGE分析

【目的】研究噬菌弧菌Bacteriovorax sp. N1在一个投放周期内对淡水和海水养殖环境中细菌、弧菌总数及细菌群落结构的影响。【方法】自市售微生态制剂分离蛭弧菌N1并进行分子鉴定,测定其裂解效果,制备高浓度N1菌液分别投放至淡水红鲤鱼(red carp)和海水仿刺参(Apostichopus japonicus)养殖水体,采用细菌平板计数法及PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析48 h内水体环境中细菌、弧菌总数及细菌群落结构变化。【结果】经鉴定蛭弧菌N1为噬菌弧菌,其对大肠杆菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、黄海希瓦氏菌(Shewanella smarisflavi)、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均有裂解效果。将噬菌弧菌N1投放进淡水和海水养殖环境的12～24 h,其能显著降低两种环境中弧菌含量(P 0.05)。DGGE分析显示添加噬菌弧菌N1后淡水组优势菌群弧菌属(Vibrio,a1)和不可培养杆菌属(Uncultured bacterium, a5)在12 h以后含量有明显的减少,假单胞菌属(Pseudomonas, a3)和红杆菌科Shimia属(Shimia, a6)菌含量增加。海水组优势菌群不可培养杆菌属(c2)菌在12 h时变成非优势菌群,而白杆菌属(Albirhodobacter,c1)增加成为优势菌群。噬菌弧菌N1在水中含量在24 h时降至最低。【结论】噬菌弧菌N1对海水和淡水环境中的弧菌属和不可培养杆菌属菌群有明显的裂解作用导致其含量下降,但也使假单胞菌属(Pseudomonas),红杆菌科Shimia属和白杆菌属(Albirhodobacter)菌群含量增加,但生物效应不明。为维持噬菌弧菌N1对弧菌的控制,需要24 h左右重新补充投放。     

马氏珠母贝幼虫假单胞菌病的初步研究

马氏珠母贝人工育苗过程中幼虫经常发生一种严重的病害。发病幼虫症状如下：消化盲囊颜色由正常的均匀的黄绿色变成不均匀的茶褐色或无色;胃中的食物长时间不能消化并变成茶褐色;幼虫趋光性差,活力弱,不能集群,不久即大量下沉死亡。对发病幼虫进行了细菌的分离和纯化,得到3株纯化的菌株,对“D”型幼虫的人工感染试验证实：9401和9402两株菌株是致病菌,通过对细菌进行群体及个体形态观察、生化实验,鉴定9401和9402两株菌株均属假单胞菌（Pseudomonas）。对这2株菌株进行了药物敏感试验、药物预防试验,结果表明,2株菌株对氯霉素、痢特灵、氟哌酸敏感,2×10－6氯霉素可达到预防的目的。     

哈维氏弧菌PspF基因的克隆及原核表达分析

【目的】对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603的PspF基因进行克隆与原核表达分析,优化表达条件。【方法】克隆哈维氏弧菌菌株ZJ0603的FspF基因,对其编码蛋白进行理化性质、信号肽、亚细胞定位、二级结构及三级结构分析,构建表达载体pET28a-PspF,经BamHI和XhoI双酶切和测序鉴定正确后转入表达菌株大肠杆菌BL21,对表达重组菌株进行表达条件优化及Western Blot鉴定。【结果与结论】PspF基因的开放阅读框(ORF)全长为1 179 bp,编码336个氨基酸,分子质量为38.04 ku,理论等电点5.27,不稳定系数41.97,总平均亲水性-0.382,PspF蛋白整体表现为亲水性蛋白。成功构建含pET28a-PspF的表达菌株,其最佳诱导条件为37℃下异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.2 mmol/L诱导6 h,其表达蛋白为38 ku。Western Blot结果表明PspF重组蛋白成功获得,蛋白同源性高,具有作为抗弧菌病疫苗的潜力。     

过热蒸汽对熟制小龙虾优势腐败菌的杀菌动力学及其机理

【目的】研究过热蒸汽杀菌对熟制小龙虾优势腐败菌的杀菌效果。【方法】从腐败熟制小龙虾中分离腐败菌,根据16S rDNA基因序列信息鉴定其种属,研究过热蒸汽温度、流量和杀菌时间等的处理参数对小龙虾优势腐败菌的杀菌效果,并利用Weibull模型拟合其杀菌动力学过程。通过研究过热蒸汽处理对优势腐败菌菌悬液的电导率和紫外吸收的影响,以及通过扫描电子显微镜对菌体的微观结构进行观察,初步探讨其杀菌机理。【结果】熟制小龙虾优势腐败菌为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)。在过热蒸汽杀菌初期阶段,优势腐败菌的残活率迅速下降,随着杀菌时间延长,残活率下降速率变得缓慢,最后趋于稳定,说明过热蒸汽能完全杀灭小龙虾优势腐败菌。Weibull模型能较好拟合过热蒸汽对4种优势腐败菌的杀菌动力学,其R2≥0.935。Weibull模型得到的预测值与实测值接近程度较高。通过对模型的分析,提高过热蒸汽温度和增大流量,更容易到达灭活腐败菌的效果。过热蒸汽杀菌后,菌悬液的电导率值和吸光度迅速上升,之后趋于平缓;通过对微观结构的观察,发现杀菌后腐败菌的细胞膜完整性遭到严重破坏。【结论】过热蒸汽杀菌技术应用于小龙虾产品加工具有一定的可行性。     

镉和铜对海洋浮游植物的毒性效应及其机制研究进展

【目的】综述重金属元素镉Cd和铜Cu对海洋浮游植物的毒性效应研究,总结重金属对海洋浮游植物的毒性作用机制,为开展重金属对海洋浮游植物毒害机理的深入研究提供借鉴。【方法】以毒理实验中常用的重金属镉和铜为代表,总结了重金属对海洋浮游植物毒理研究的常用测试指标,归纳了重金属对海洋浮游植物光合作用、抗氧化系统等方面的毒性作用机制。【结果】重金属对海洋浮游植物毒性作用机制概括为:1)重金属替换与其结构相似的作为酶辅助因子的金属元素,使浮游植物体内某些酶失活;2)重金属直接或间接诱导活性氧的产生,使浮游植物受到氧化胁迫;3)重金属与生物大分子中的某些基团亲和性高而结合,阻断相关的生理生化过程。【结论】重金属的毒性效应因浮游植物种类不同而有所差异,今后相关研究中需更加关注重金属在多种海洋浮游植物共存环境下的毒性效应及机制,将有助于全面系统地理解重金属对海洋浮游植物的致毒机理。     

化学诱导对2株海洋真菌次级代谢产物及其生物活性的影响

【目的】以2株海洋真菌为研究对象,探究不同种类及浓度的化学表观遗传修饰剂对其次级代谢产物化学多样性和生物活性的影响。【方法】基于化学表观遗传修饰策略,采用两种不同的化学表观遗传修饰剂5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azaC)和丁酸钠,分别对Penicillium sp.019和Aspergillus terreus ZN4-5-4两株海洋来源真菌进行表观遗传修饰。通过观察真菌在培养基中的生长状态变化,并根据薄层层析(TLC)指纹图谱、高效液相色谱(HPLC)图谱、乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH)自由基清除和卤虫致死活性筛选模型等技术手段,从中筛选出代谢产物丰富、AChE抑制活性与抗氧化活性产物丰富且毒性小的发酵培养条件。【结果】添加1 mmol/mL的丁酸钠诱导剂可使菌株019和ZN4-5-4的次生代谢产物的种类增加,且同时能提高该菌株次级代谢产物的AChE的抑制活性和DPPH自由基清除活性。因此,确定菌株019和ZN4-5-4的最优发酵条件均是添加浓度为1 mmol/mL丁酸钠的PDB培养基。【结论】化学表观遗传修饰策略指导下,添加诱导剂5-azaC或者丁酸钠对2株海洋真菌次生代谢产物的产生有影响。     

盐酸普鲁卡因诱导下海洋真菌Hypocrea lixii次级代谢化学成分

【目的】通过化学诱导方法从一株海洋真菌Hypocrea lixii中获得多样化的活性小分子化合物。【方法】对菌株在盐酸普鲁卡因的化学诱导作用下进行固体发酵,代谢产物采用硅胶减压柱层析、Sephadex LH-20以及pHPLC等手段分离纯化,对化合物运用NMR、MS等波谱学技术并比对文献进行结构鉴定,采用Ellman比色法及DPPH自由基清除法对化合物进行初步抗乙酰胆碱酯酶(AChE)和抗氧化活性测试。【结果】从海洋真菌Hypocrea lixii在盐酸普鲁卡因诱导下的发酵提取物中分离得到4个异黄酮类化合物,包括6'-O-crotonylgenistin(1)、Genistein(2)、Daidzein(3)和Genistin(4),以及对氨基苯甲酸甲酯(5)、对羟基苯丙酸(6)和胞嘧啶(7),其中化合物1和6为该种中首次报道,化合物5为生物转化来源首次报道,化合物2~4可能源自培养基。在100μmol/L剂量浓度下,化合物1~4对AChE的抑制以及DPPH自由基的清除活性均较弱,化合物5和6显示了相对强的AChE抑制活性,抑制率分别为40%和38%。【结论】盐酸普鲁卡因对该菌次级代谢产生了显著的影响,为深入研究该菌株化学诱导次级代谢产物提供基础。     

马氏珠母贝肠道及其养殖水体可培养细菌群落结构

【目的】了解马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)肠道及其养殖水体可培养细菌的群落组成。【方法】采用2216E平板涂布法研究海区养殖马氏珠母贝肠道与养殖水体的可培养菌群种类及丰度。【结果与结论】马氏珠母贝肠道及其养殖水体的可培养细菌归属于2门(变形菌门和厚壁菌门)3纲7目10科23属56种。属水平上,肠道中以弧菌属(74.7%)和假交替单胞菌属(18.7%)为主;养殖水体中α-变形菌纲的FJ943236_g属(40.7%)丰度最大,弧菌属(16.7%)相对肠道丰度较低。样品共有菌属为弧菌属、假交替单胞菌属、发光杆菌属和芽孢杆菌属;肠道特有菌属为希瓦氏菌属和盐单胞菌属;养殖水体特有菌属主要为FJ943236_g、鲁杰氏菌属和Nautella。在种水平上,7个种为二者共有;马氏珠母贝肠道和养殖水体特异性菌种分别为18个和31个。虽然门水平上马氏珠母贝肠道中可培养细菌群落与其养殖水体中的细菌群落大致相似,但在属、种水平上二者差异明显。     

鱼干曲霉菌分离株鉴定及产毒特性

【目的】探明湛江市售鱼干中曲霉菌(Aspergillus spp.)分离株产AFB₁的特性。【方法】采用马铃薯-葡萄糖琼脂(PDA)对鱼干中的曲霉菌进行分离纯化,根据菌落形态、显微形态观察和ITS序列分析对分离株进行鉴定,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法分析菌株的AFB₁合成量。【结果】鱼干中曲霉菌的分离率高达47.66%,经形态学鉴定发现以黄曲霉(Aspergillus flavus)A03、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)H32、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M23、欧式曲霉(Aspergillus europaeus)M11、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)B21等为主,其中红笛鲷干(Lutjanus sanguinaus)中黄曲霉菌的含量高达1200 CFU/g。黄曲霉A03在红笛鲷干培养基中常温(27~30℃)培养21 d,产AFB₁能力达到3.8 ng/mL。【结论】鱼干中存在产AFB₁的黄曲霉菌,警示鱼干中存在AFB₁污染的风险。     

17β-雌二醇注射雌性金钱鱼下丘脑转录组分析

【目的】通过转录组测序分析雌激素(17β-Estradiol,E₂)对雌性金钱鱼下丘脑中基因表达的影响。【方法】E₂体注射后进行雌性金钱鱼下丘脑转录组测序,基因功能注释,差异基因筛选、鉴定,GO(Gene Ontology annotation)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析,并利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)检测E₂体注射后雌性金钱鱼下丘脑中相关基因的表达。【结果】雌性金钱鱼下丘脑转录组测序共测得Clean reads为190909756,注释到17687个基因,筛选和鉴定了22个差异表达基因,包括prl、erf3α、pgr和cyp19a1b等11个表达上调基因和chsy1、muc17l、prf1和hla-α等11个下调基因。通过KEGG功能富集分析发现差异基因涉及13个代谢通路。转录组和qPCR结果显示,与对照雌鱼相比,E₂注射组雌鱼下丘脑中prl、pgr、cyp19a1b和3β-HSDI的表达显著上调,而生长轴相关基因ghrh、sst1、sst3、sst5和sst6的表达未受影响。【结论】E₂通过反馈作用调节下丘脑中部分性类固醇激素合成通路相关基因的表达,但不影响生长相关基因的表达。     

湛江港海域游泳动物群落结构及多样性分析

【目的】研究湛江港海域的游泳动物资源结构及多样性特征。【方法】根据2016—2017年湛江港海域4个季度的底拖网渔业资源调查数据,采用相对重要性指数(index of relative importance,IRI)、Margalef丰富度指数(D)、Shannon-Wiener多样性指数(H')、Pielou均匀度指数(J)和ABC曲线(abundance-biomass comparison curve)分析该海域游泳动物的种类组成、优势种和多样性水平等群落结构特征。【结果】该海域共发现游泳动物173种,隶属于16目68科116属;其中鱼类种类数最多(98种,占总种类数的56.7%),以底层鱼类和暖水性鱼类为主;其次是甲壳类(66种,占38.2%),头足类最少(9种,占5.2%)。4个季节的优势种累计有11种(鱼类6种、甲壳类5种),其中条纹叫姑鱼(Johnius fasciatus)是春、夏、秋3个季节的共同优势种。从时间维度上看,秋季的H'、D均为最高,而春季的J最高;从空间维度上看,湛江港口门处S6站位多样性水平相对较高。ABC曲线结果显示,湛江港海域游泳动物群落在冬季受干扰程度高于其它3个季节。【结论】湛江港海域游泳动物种类丰富,其中鱼类是主要的游泳动物类群。