中国对虾幼体致病菌哈维氏弧菌的分离及其生物学特性研究

于1996年4—5月,在青岛丰城地区一些对虾育苗场发生大规模爆发性传染病,主要感染中国对虾幼体,尤其是蚤状幼体。死亡率高达80％以上。从自然发病及人工感染患病濒死中国对虾幼体中分离出38株细菌,研究其形态特征,生理、生化特性及对中国对虾幼体的致病性。结果表明,38株分离物均为革兰氏阴性杆菌,菌体为杆状或短杆状,极生单鞭毛运动,不发光,氧化酶呈阳性,发酵葡萄糖产酸,TCBS平板上生长,菌落呈黄色或绿色,对弧菌抑制剂0／129（150g／ml）敏感,此均为弧菌属的典型特征,属于弧菌。其中26株细菌被归为同一类群,参照伯杰氏细菌学鉴定手册（1994年,第9版）鉴定表明,该菌同哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）最为接近;另外,Biolog系统鉴定表明也为哈维氏弧菌,因此定名为哈维氏弧菌。利用浸泡感染法以2．5×103—2.5×107cfu／ml浓度的细菌感染不同发育时期（无节幼体期、蚤状期、糠虾期和仔虾期）的中国对虾幼体。结果表明,该病原菌主要感染中国对虾幼体的无节幼体晚期、蚤状期和糠虾早期并导致其大量死亡,而在仔虾期感染死亡率较低,并且2．5×104cfu／ml以上浓度的病原菌即可导致蚤状幼体严重感染死亡,由此可见,所分离的致病菌对中国对虾蚤状期幼体具有较强的致病力。人工感染试验结果     

检测海洋弧菌的酶联免疫吸附试验研究

研究建立中国对虾病原菌┐副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）的间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）快速检测技术。间接ＥＬＩＳＡ技术中的副溶血弧菌的特异抗血清由家兔制备，羊抗兔ＩｇＧ用碱性磷酸酶标记，酶的底物为对磷酸基硝基苯。将该技术标准化后，测定了抗血清与１３株其它副溶血弧菌菌株及２９株其它弧菌标准菌株的交叉反应，并进行了苗期对虾样品中副溶血弧菌的检测     

哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学及检测技术

哈维氏弧菌是1种革兰氏阴性、发光的海洋细菌,广泛分布于海洋环境中。它是最近10多年才被认识到的水产养殖动物的重要致病菌。文中综述哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学、致病机制、密度感应系统、检测技术、疾病的防治及其应用。     

不同条件下哈维氏弧菌(Vibrio harvey)对墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)致病性研究

为研究墨吉明对虾弧菌病的防控方法, 本文通过人工注射感染的方式, 研究不同数量哈维 氏弧菌及在不同温度、盐度、pH、不同硝酸氮、亚硝酸氮和氨氮浓度条件下哈维氏弧菌对墨吉明对 虾的致病性的影响。结果表明: 当人工感染哈维氏弧菌数量为3.16×10⁸ CFU 时, 24 h 内对虾累计死 亡率为96.67%; 哈维氏弧菌数量为3.16×10⁶ CFU 以上, 实验结束时, 对虾累计死亡率都超过了 50.00%.在20-32℃ 范围内, 随着温度升高哈维氏弧菌致病力增强, 并且低温组(20℃ 实验组与 26℃ 实验组)对虾累计死亡率显著低于高温组(32℃ 实验组)(P<0.05).在温度为(24±1)℃ 时, 盐度为 20 时对虾累计死亡率处于较低水平; 在温度为(24±1)℃, 盐度为(22±1)时, 96 h, pH 为8.0 时对虾 累计死亡率最低, 并且与另外两个实验组差异显著(P<0.05); 温度为(24±1)℃, 盐度为(22±1), 硝 酸氮对感染哈维氏弧菌的墨吉明对虾有胁迫作用; 在亚硝酸氮浓度(1.0-10.0 mg/L)、氨氮浓度 (0.5-1.5 mg/L)范围内, 哈维氏弧菌对墨吉明对虾的致病性, 随着浓度升高而增强。本实验为墨吉明 对虾弧菌病的防控提供了理论基础。     

哈维氏弧菌密度感应系统对几种胞外酶的活性影响

密度感应系统是细菌通过感受群体密度变化而控制基因特定表达的1种机制。对病原菌密度感应系统的研究有助于找到新的抗感染策略。目前哈维氏弧菌分泌的蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等致病相关因子是否受密度感应系统的控制尚不清楚。哈维氏弧菌有3个平行的密度感应系统。本研究通过检测3个密度感应系统基因突变株的胞外酶(如蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等)活性,发现明胶酶的活性受密度感应系统的信号分子HAI-1和AI-2的正控制,且受AI-2的控制程度更大;脂酶也在一定程度上受HAI-1和AI-2的正控制;卵磷脂酶受HAI-1的负控制;溶血素受HAI-1和AI-2共同的负控制。结果表明,哈维氏弧菌胞外分泌的几种毒力相关因子都受密度感应系统的调控,但控制方式各不相同。     

哈维氏弧菌VIB645毒性相关质粒的结构解析

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是水产养殖动物的常见致病菌。前期研究发现,哈维氏弧菌致病性最强的菌株VIB645含有2个核苷酸序列非常相似的溶血素基因—vhhA和vhhB,分别位于染色体DNA和1个大小约为65.6 kb的质粒上(命名为pVH1)。本研究用碱裂解法提取该菌株的毒性相关质粒pVH1,利用多种限制性内切酶进行酶切,构建随机DNA文库并测序。合计测序97.63 kb,覆盖度为148.3%,鉴定出125个ORF(开放阅读框,>150 bp)。这些预测的ORF,根据其功能主要分为以下几类:(1)毒力相关基因,包括RTX毒素钙离子结合蛋白、转铁蛋白结合蛋白A前体、外膜粘附蛋白;(2)结合转运相关基因,包括TraC、-D-、F-、G-、H-、I-、K-、N-、U-、W、TrbB-、C;(3)转座相关基因;(4)其他功能基因,如甲基转移酶,DNA结合蛋白,DNA复制蛋白DnaC等;(5)未知基因。本研究结果对揭示哈维氏弧菌的致病机理具有重要意义。     

中国对虾弧菌病的间接荧光抗体诊断技术研究

于１９９４年８月－１９９５年５建立中国对虾病原菌－副溶血弧菌的间接荧光抗体检测技术，其中副溶血弧菌的特异抗血清由家兔制备，羊抗兔免疫球蛋白用异硫氰酸荧光素标记，并以罗丹明标占血清白蛋白为背影染色。     

致病性哈维氏弧菌:海洋寄生性纤毛虫的内共生细菌

哈维氏弧菌被观察到与海洋寄生性纤毛虫刺激隐核虫具有内共生现象,其作为一种致病性细菌,可导致感染刺激隐核虫的大黄鱼产生严重的继发性细菌感染。我们通过16s宏测序技术对刺激隐核虫的细菌群落进行鉴定,并通过标准的细菌培养方法分离鉴定出哈维氏弧菌。通过透射电镜和荧光原位杂交方法,在刺激隐核虫的细胞胞质中,均观察到内共生的哈维氏弧菌的存在;而在其细胞核中,则没有相关信号存在。哈维氏弧菌与刺激隐核虫的相关关系以及内共生的哈维氏弧菌对刺激隐核虫的影响作用,仍需要深入进行研究。     

中国对虾(Penaeus chinensis)幼体血液循环的活体观察

溞对中国对虾早期幼体的循环系统及血液流向进行了活体观察 ,描述了中国对虾早期幼体发育阶段中幼体循环系统血管的走向与分布、血液的流向及循环路径等 ,比较各期幼体循环系统的形态 ,并探讨对虾早期幼体循环系统的发育过程。     

以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)为重点的鱼类细菌病原的诊断与控制(英文)

作者对鱼类细菌病原的诊断与控制作了较全面的综述。细菌病原诊断技术包括酶联免疫吸附技术（ＥＬＩＳＡ）及蛋白印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ）。细菌病原控制技术包括化学疗剂的应用,有益微生物的应用,营养添加剂,β－葡萄糖苷增强免疫抗病力,及免疫保护作用等。     

4株长牡蛎(Crassostrea gigas)致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)鉴定及其毒力基因检测

为明确江苏连云港养殖长牡蛎大规模死亡病因,对分离自长牡蛎的4株病原菌开展了致病性、表型特征、分子特征等研究,结果表明4株病原菌均具致病性,4株病原菌ML1、ML2、ML3、ML4对长牡蛎的半数致死量LD50分别为2.8×105、1.1×105、1.8×105和1.6×105 CFU/mL;4株病原菌均为呈短杆状革兰氏阴性细菌,氧化酶阳性,还原硝酸盐,能利用甘露醇、纤维二糖,形态及理化特性结果表明4株分离菌与弧菌属的哈维氏弧菌亲缘关系最近;16SrRNA、gyrB、rpoA基因同源性检索及系统发育学分析结果表明4株分离菌与GenBank数据库中哈维氏弧菌的基因序列相似性最高且在系统发育树中聚为1个分支;根据4株分离菌的致病性、表型与分子特征,表明引起长牡蛎大规模死亡的病原为哈维氏弧菌。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,检测了分离鉴定的4株病原菌的9种毒力基因,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA和vhhB 4种毒力基因,扩增片段大小分别为679bp、390bp、1324bp和216bp,其他5种毒力基因未检测到,且分离鉴定的4株病原哈维氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈维氏弧菌的分子标记。     

中国对虾卵细胞中病毒的初步研究

对中国对虾卵巢和受精卵细胞进行了电子显微镜超微结构观察，发现卵巢内有球状病毒粒子，大小为80nm左右。受精卵细胞内有传染性皮下和造血组织坏死病毒（IHHNV）感染，其严重影响对虾受精卵的发育，从获得的结果来看，中国对虾病毒（IHHNV）垂直传播的可能性极大。     

象山港的生态环境和中国对虾移植放流技术

将中国对虾移植至原本没有自然分布的象山港,首先需要了解放流海域的生态环境,掌握一整套生产性放流技术。这是研究移植放流虾群在新海域环境中栖息、摄食、移动、洄游、繁殖等方面的适应与规律的基础。     

单环刺螠(Urechis unicinctus)的人工苗种生产研究 Ⅰ .水温对胚胎发育及幼体培育的影响

为给单环刺 (U.unicinctus)的苗种生产提供有效的基础资料 ,本文研究了水温对单环刺胚胎发育的影响。结果表明 :单环刺各胚胎发育期的发育速度 (h)随水温 (T)升高而加快 ,有明显的正相关性。求得胚胎发育的生物学零度为平均 2℃。不同水温条件下 ,各期幼虫期的存活率以2 0℃为最高 ,培育水温高于或低于 2 0℃时生存率逐渐降低。幼虫培育适宜温度为 15～ 2 0℃。     

中国对虾仔虾对磷需要量的研究

通过观察在饲料中添加磷酸二氢钾对中国对虾仔虾存活率、体长增长率及仔虾体内含磷量的影响,探索了仔虾对磷的需要量。研究表明,添加磷酸二氢钾使饲料中磷含量为1.16%～1.37%时,仔虾的体长增长率最佳。饲料中磷含量在0.71%～1.82%的范围内,对仔虾的存活率、体内的磷含量无显著的影响。     

中国对虾幼虾饲料中最佳蛋白能量比研究

实验对不同规格的中国对虾（０．３６８～０．６９９ｇ;１．０２５～１．５２５ｇ）投喂饲料的最佳可消化蛋白质与可消化能比值（ＤＰ／ＤＥ）进行了研究。将精制饲料配成３个蛋白水平,每个蛋白水平包括４个能量级。实验结果表明：不同时期中国对虾对蛋白利用率不同,较大规格的对虾对蛋白质利用率比较小规格高;对于以上２个不同规格的中国对虾,饲料最适ＤＰ／ＤＥ分别在１４５．２ｍｇ／ｋｃａｌ和１３６．４ｍｇ／ｋｃａｌ时,获得最大增重率、最佳蛋白质效率和最低饲料系数;存活率有随蛋白质含量增加而增加的趋势。     

中国对虾类淋巴器结构观察及功能探讨

中国对虾类淋巴器位于肝胰腺前方,左右各一个,呈白色,半透明状。它由触角动脉上分出的动脉血管不断分叉、迂曲,形成了一个外包透明结缔组织膜,内部充满小管的组织结构。类淋巴器的小管依其发育时期和功能不同表现为３种不同的形态。其中,第二种小管管壁具有生成和释放血细胞的功能。在类淋巴器中,观察到小颗粒细胞,大颗粒细胞和无颗粒细胞。小颗粒细胞具有吞噬功能,在受到抗原刺激时可以胞吐方式释放细胞中的电子致密颗粒。大颗粒细胞无吞噬功能。无颗粒细胞又可分为巨噬细胞样无颗粒细胞和淋巴细胞样无颗粒细胞。前者具有很强的吞噬能力,而后者在受到抗原刺激时,可表现出类似浆细胞样分化的细胞特征。