凡纳滨对虾类Ig定性和定位的初步研究

以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象,运用Western—blotting和免疫组织化学等现代免疫学方法,对对虾中的类Ig（immunoglobulin,免疫球蛋白）蛋白进行定性和定位研究。结果发现,虾血清中有两种分子质量约为70ku和62ku的蛋白可与抗人Ig发生特异性的结合。同时,虾血细胞——无颗粒细胞的外膜及虾类淋巴器、肝胰脏、心脏、胃和肠等5种组织器官的石蜡切片与抗人Ig反应呈不同程度的阳性,其中类淋巴器和肝胰脏显色较深。提示,虾体内确实存在能与抗人Ig发生特异性结合的类Ig蛋白,其不仅存在于虾血清中,还存在于无颗粒细胞、类淋巴器和肝胰脏等组织中,为对虾的免疫系统的研究和疾病的防治奠定基础。     

应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒的特异性抗体

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4,通过间接酶联免疫法(ELISA)对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒(LCDV)特异性抗体进行了检测。结果表明:无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低(平均OD值为0.092),个别鱼体偏高,证明已感染LCDV,处于潜伏期;患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高(平均OD值为0.165),患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高(平均OD值为0.231);健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后,特异性抗体水平显著升高。     

褐牙鲆、夏鲆及其杂交子代核型与DAPI 带型分析

为了深入剖析褐牙鲆与夏鲆杂交后代的染色体结构,本研究利用秋水仙素-低渗-空气干燥法制备胚胎染色体和DAPI(4’,6’-diamidino-2-phenylindole)荧光染色的方法,对褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)、夏鲆(Paralichthys dentatus)及其正反交子代胚胎细胞的染色体组型和染色质的分布进行了研究。结果表明,褐牙鲆、夏鲆及其正交子代(褐牙鲆♀×夏鲆♂)染色体组均含有48条端部着丝粒染色体,染色体组型公式均为2n=48t,组内染色体长度分布连续,三者核型相似。反交子代(夏鲆♀×褐牙鲆♂)为46条端部着丝粒染色体,比亲本及正交子代少了两条染色体。DAPI荧光染色显示,褐牙鲆1号染色体中的一条染色体有较明显的次缢痕,夏鲆及正反交子代染色体中未见明显次缢痕。褐牙鲆与正交子代染色体着色较为均一,而夏鲆与反交子代着丝粒区域亮度明显增强。     

应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4，通过间接酶联免疫法（ELISA）对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒（LCDV）特异性抗体进行了检测。结果表明：无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低（平均OD值为0．092），个别鱼体偏高，证明已感染LCDV，处于潜伏期；患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高（平均OD值为0．165），患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高（平均OD值为0．231）；健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后，特异性抗体水平显著升高。．     

应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的河流弧菌

用灭活的河流弧菌(Vibrio fluvialis)抗原,注射免疫实验兔,制得凝集价为1∶5 120的抗血清。用试管凝集法检测了抗血清的特异性,再用免疫吸附法去除交叉反应,从而得到高效价、高特异性的抗河流弧菌血清。用所制备的抗血清在实验室中建立起河流弧菌荧光抗体检测技术(FAT),在荧光显微镜下可清楚地看到被标记的病原菌,整个检测过程只需3h。用河流弧菌感染牙鲆(Paralichthys olivaceus),24 h后,用FAT测定牙鲆的血液、肾脏和肝脏中的河流弧菌,在血液中河流弧菌的检出率最高,其次是肾脏,肝脏的检出率最低。以上结果表明:荧光抗体技术可以快速、灵敏、准确地检测出牙鲆体内的河流弧菌。     

对照组和雌核发育牙鲆血清中睾酮与雌二醇水平的比较

采用放射性免疫方法测定和比较了人工诱导的雌核发育牙鲆（Paralichthys olivaceus）与对照组牙鲆血清中睾酮（T）和雌二醇（E2）水平。研究发现, 雌核发育牙鲆个体中的T 含量显著高于对照组牙鲆个体（P〈0.05）, 而其E2 含量则略低于对照组个体; 在雌核发育牙鲆中, 卵巢发育不正常的个体比发育正常的...     

大菱鲆mIgD重链基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆获得大菱鲆(Scophthalmus maximus)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded Ig,mIgD)重链基因的cDNA序列全长,该基因全长3 357bp,包含1个2 997bp的开放阅读框,编码999个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重链恒定区δ1~δ7氨基酸序列同源比对结果显示,其与庸鲽(78%)、鳜(71%)、牙鲆(68%)具有较高的同源性;多序列比对结果显示,大菱鲆mIgD的每个δ恒定区内均存在色氨酸与半胱氨酸保守位点。利用邻位相连法构建硬骨鱼类免疫球蛋白系统发育树,结果显示,鱼类IgD聚为一大支,大菱鲆IgD与庸鲽及牙鲆聚为一支。利用RT-PCR分析了大菱鲆IgD重链基因的组织差异表达,结果显示,其在外周血白细胞、脾脏、前肾及中肾组织中具有较高的表达。将大菱鲆腹腔注射福尔马林灭活鳗弧菌后,实时荧光定量PCR检测其前肾组织中mIgD重链基因应答表达量,结果显示,mIgD重链基因在注射鳗弧菌后呈显著下调趋势,在注射后8h时降至最低值,其相对表达量约为对照组的1/28,然后呈逐渐恢复上调趋势,在48h时mIgD相对表达量与对照组无显著差异。     

台湾海峡牙鲆养殖技术研究

报道了台湾海峡牙鲆(Paralichthysolivaceus)的养殖技术。经过在室内水泥池189d的饲养,共获得平均全长32.20cm,平均体质量402.10g规格的牙鲆11.5万尾,养殖成活率达96%。养殖结果表明,台湾海峡牙鲆的生长速度快于黄、渤海牙鲆;水温与牙鲆的生长关系密切,台湾海峡牙鲆适宜的温度范围为18～27℃左右;饲料中添加适量中草药对提高牙鲆的成活率有较明显作用。     

繁茂膜海绵中具有促进细胞粘附成团作用蛋白质的分离纯化研究

用凝胶层析和离子交换层析方法从黄海的繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve)中分离得到一种蛋白质D1,相对分子质量为2,3ku,pI为6．6。纯化的蛋白质富含疏水性氨基酸和酸性氨基酸。研究表明蛋白质D1对繁茂膜海绵细胞培养表现出很强的使海绵细胞贴壁且快速粘附成团的作用。凝集实验表明该蛋白对人的A、B、O、AB血,兔和鼠的红细胞没有凝集活性。     

夏牙鲆(♂)与牙鲆(♀)人工杂交的细胞遗传学初步研究

于2004年11～12月在青岛薛家岛养鱼场采用夏牙鲆(Paralichthysdentatus)的精子与牙鲆(Paralichthysolivaceus)的卵子实施了多次人工杂交实验,并进行了父本母本鱼类个体、子代的染色体制片观察和细胞中DNA相对含量的流式细胞仪检测。结果表明,夏牙鲆染色体数为48,核型为2n=48t、臂数NF=48;子代的染色体数和核型与父母本的一样,也为2n=48t;子代的细胞中DNA的相对含量也表明其为二倍体。因此,可以明确其为杂交的后代,而不是雌核发育。     

日本蟳酚氧化酶的分离纯化及其部分生物化学性质研究

利用离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,从日本(Charybdis japonica)血淋巴中分离纯化出了酚氧化酶,并以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)作为特异性底物对其生化性质和酶性质进行了研究。结果表明,酚氧化酶和酚氧化酶原的分子质量分别为64.5 ku和69.5 ku。以L-DOPA为底物对酚氧化酶纯品进行研究发现,其最适pH值为6.0、最适温度为40℃。对底物L-DOPA和儿茶酚的米氏常数Km值分别为3.41和7.97 mmol/L。该酶对亚硫酸钠、苯硫脲极为敏感,对硫脲、苯甲酸非常敏感,表明该酶很可能是一种儿茶酚酶型的酶。此外,EDTA,DETC,Zn2 ,Mg2 和Cu2 均能显著抑制该酶活性,且10 mmol/L Cu2 能有效地回复该酶被DETC所抑制的酶活性,表明该酶确为一种Cu-金属酶。     

大菱鲆血清免疫球蛋白IgM的纯化及应用研究

用硫酸铵分级盐析法纯化大菱鲆血清免疫球蛋白IgM,所得产物用Sepharose-4B和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析进一步纯化,以纯化的大菱鲆IgM免疫新西兰大白兔,获得兔抗大菱鲆IgM抗血清.SDS-PAGE电泳显示大菱鲆IgM重链为76 kD,轻链为27 kD;纯化的大菱鲆IgM重链与特异性抗血清具有较好的反应,而轻链与抗血清反应不明显;以制备的兔抗大菱鲆IgM抗血清为二抗建立了大菱鲆血清特异性抗体的间接ELISA检测方法,用该方法检测了鳗弧菌灭活疫苗免疫后大菱鲆产生特异性抗的变化规律,大菱鲆在免疫后第1周就产生了特异性抗体,在3周时达到峰值,该特异性抗体可维持13周以上.     

重组别藻蓝蛋白(rAPC)的纯化与鉴定

报道了重组大肠杆菌表达的别藻蓝蛋白的下游生产工艺研究,并对产物进行了分析鉴定。工程菌株P1先在NBSBioFlo3000型5L自动发酵罐进行高密度发酵,融合蛋白获得了高效表达,且主要在细胞内以可溶形式存在。纯化前先将获得的菌体超声破碎,然后经硫酸铵沉淀、疏水层析和离子交换层析三步纯化,接着对纯化的重组别藻蓝蛋白(rAPC)进行SDS-PAGE、PAGE、Westernblot等电点分析。证明已获得纯度为96.4%的rAPC,其等电点为6.0,并且具有与天然APC相似的抗原性。     

牙鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆、表达及鉴定

采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。     

牙鲆RAG2 基因的质粒构建和体外原核表达

将牙鲆(Paralichthys olivaceus)RAG2 cDNA序列插入到体外表达质粒pProEXTM HT,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL-21中进行体外表达,分析了诱导时间和 IPTG 浓度对重组蛋白产生量的影响,确定了最佳诱导条件为:诱导时间为3 h, IPTG诱导浓度0.2 mmol/L.本研究同时对RAG2重组蛋白的可溶性进行确认,并利用BD TALONTM 金属亲和柱纯化了RAG2蛋白.本研究结果为进一步深入研究RAG2蛋白的生物学功能奠定了良好的基础.     

First isolation and characterization of a new species of Vibrio from diseased flounder (Paralichthys olivaceus Temminck et Schlegel)

Appropriate pathogenic bacteria were isolated from diseased (or dead) flounder (Paralichthys olivaceus L) occurring in a mariculture farms of Qinhuangdao, which all diseased fishes expressed bacterial septicaemia. The phenotypic information of the 12 pure cultures was studied extensively, including morphological characteristics, colony characteristics in different media, physiological and biochemical characteristics, and the mole fraction G C ratio of the DNA for representative strain. The results show that the isolates belong to a new species of Vibrio, and are designated as Vibrio qinhuangdaora sp.nov, by the area from which the diseased flounders are collected (Qinhuangdao) based on its biological properties following Rules of International Code of Nomenclature of Bacteria. At the same time,studies on the serum homology ofisolates, and pathogenicity of isolates were conducted by experimental infection. The results show that all the isolates are of serologic similarity, and the isolates have strong pathogenicity to flounder. The studies can extensively reflect the main biological properties of this new species of Vibrio.     

石鲽鱼人工育苗技术研究

根据石鲽鱼的生物学特性 ,对亲鱼的选择培育、人工催产、挤卵、受精孵化和仔稚鱼的培育技术 ,进行试验探索。在室内人工控制水温、光照、饵料投喂的条件下 ,较为系统地研究了石鲽鱼的发育和变态及其与理化因子的关系 ,探索了人工育苗的关键技术 ,突破了过去单纯依赖采捕自然苗进行人工养殖的方式 ,为实现室内全人工育苗及养成产业化生产 ,解决苗种来源途径提供了技术保证     

养殖石斑鱼溃疡病病原哈维氏弧菌胞外产物的研究

以网箱养殖的患溃疡病青石斑鱼(Epinephlus awoara)和斜带石斑鱼(Epinephlus co-ioides)分离的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)TS-628菌株为研究对象,采用平板玻璃纸覆盖技术,获得该菌株的胞外产物(ECP),并对其成分进行分析。利用杯碟法研究表明,哈维氏弧菌TS-628菌株的胞外产物具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、卵磷脂酶等多种酶活性和溶血活性,且溶血性物质具有热不稳定性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及考马斯亮蓝R-250染色分析表明,ECP蛋白条带主要集中在分子质量范围25.0~66.2 ku之间,经不同时间培养所获得的ECP在凝胶上显示出的蛋白条带几乎一致。采用复性电泳方法(G-PAGE)分析了哈维氏弧菌及其它4种弧菌属细菌的ECP蛋白酶活性,结果发现哈维氏弧菌ECP在酸性条件下,蛋白酶活性较强,在碱性条件下,蛋白酶带明显减少,活性很弱。在相同的pH条件下,5种弧菌中以副溶血弧菌的ECP蛋白酶活性最强,种类多,分子质量范围宽;而哈维氏弧菌的蛋白酶带较少,活性也稍弱。     

条斑星鲽幼鱼变态期间核酸及蛋白的变化

本试验测定了条斑星鲽(Verasper moseri)幼鱼变态过程中DNA、RNA、蛋白及其比值的变化,作为评价幼鱼变态阶段生长潜能的指标。结果表明,试验期间培育水温为16.5～18.0°C,DNA、RNA及蛋白的变化都带有发育阶段特异性。DNA含量在34～42日龄增加缓慢,然后快速增加直至44日龄,在45日龄和46日龄分别保持下降和上升趋势。蛋白含量和RNA含量的变化趋势相似,在试验期间保持快速增长的趋势。RNA/DNA比值从试验开始至35日龄呈上升状态,36日龄时下降,38日龄时达到最高值5.01,然后显著下降(P0.05),在试验结束时达到最低值1.76。蛋白/DNA在40日龄时达到最高值58.64,在46日龄时达到最低值21.28。RNA、DNA及蛋白含量跟全长和体质量有明显的线性关系(P0.05)。RNA/DNA与全长和体质量的关系比蛋白/DNA与全长和体质量的关系密切。蛋白/DNA比值的变化趋势跟RNA/DNA比值类似,但前者的变化滞后于后者,表明RNA/DNA比值是评价条斑星鲽生理状况的更有效的生理指标。