中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)人工选育群体不同世代的微卫星分析

采用微卫星DNA技术对中国对虾人工选育快速生长基础群体和4个连续世代共计100个个体进行了遗传分析。对8个基因位点进行了扩增，共得到71个等位基因。每个位点的等位基因数从6到16不等，其大小在159--600bp之间，P，C(Polymorphism Information Content)值为0．6628—0．9051，基因型数为17—67。5个世代群体的平均杂合度分别为0．7188、0．5687、0．6188、0．6438、0．66937。从F-检验的数据来看，配对比较Fst值表明5个世代群体间的遗传分化程度较弱。Fi值的计算结果表明，有5个群体位点杂合度处于过剩状态，但对整个群体而言，5个世代群体均表现为一定程度的杂合子缺失。通过计算每个位点的等位基因数(nα)、有效等位基因数(αe)、基因型数目(G)、最高频率等位基因的频率(F)，以及基于基因型的P值，比较了5个群体的遗传变化。另外，5个世代群体间的相似性系数以及彼此间的遗传距离，体现出人工选育群体间的遗传分化程度较低，说明5个世代群体间的遗传分化程度较低，还有较大的选育潜力，可以继续保持遗传响应。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)黄、渤海3个野生地理群遗传多样性的微卫星DNA分析

提要运用微卫星DNA技术，以中国对虾渤海湾群体(BH)、辽东湾群体(LD)和海州湾群体(HZ)的3个野生群共计60个个体为实验材料，进行了7个基因位点的遗传参数分析。同时对7对微卫星引物的多态性信息含量(PIC)进行了评估，EN0021位点提供的信息含量低于0.5，其他6对微卫星引物的PIC值均在0.5以上，适于应用于中国对虾的群体分析。结果表明，这7个微卫星位点在中国对虾3个地理群60个样品的分析中共获得了56个等位基因，对3个野生群体的7个基因位点共计21个群体位点进行了杂合度观测值(H0)和杂合度期望值(H0)计算；在Hardy-Weinberg平衡条件下，进行了P检验，发现BH和HZ各有1个群体位点发生平衡偏离，而LD有1个群体位点发生平衡偏离，还有2个群体位点已发生显著平衡偏离。但除此之外，对3个地理群间的遗传分化指数Fst值进行的计算结果表明，BH和LD之间遗传分化较弱，HZ与另2个地理群间则产生了中等程度的分化。从变异贡献率来看，有92.83％的遗传变异来自个体之间，只有7.17％的遗传变异来自群体之间。经过UPGMA聚类，发现BH群体和LD群体的亲缘关系较近，而HZ群体与前两者亲缘关系较远。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)耐低温和生长性状的遗传参数估计

The inability of Fenneropenaeus chinensis to tolerate low temperatures is of major economic concern in temperate climates,as it reduces their growing season and leads to over-winter mortality.In this study,the heritability of body weight under low grow-out temperature and cold tolerance in F.chinensis were first investigated and estimated using 88 ful-sib families,which might provide crucial information in Chinese fleshy prawn breeding programs.The heritability for body weight under suitable and low temperature of F.chinensis were both moderate(0.158 0±0.307 5 and 0.132 0±0.026 9 respectively);the large coefficient of variation(approximately 21%) and moderate estimate of heritability for body weight indicated substantial potential for selective breeding.The heritability estimate for cold tolerance was low(0.019 2±0.023 5),and showed no significant differences from zero(P0.05).A weak genetic correlation between cold tolerance and body weight was also estimated in the present study,also showing no significant differences from zero(P0.05).Thus,more research needs to be conducted on the more accurate heritability estimate of cold tolerance and genetic correlations between traits in F.chinensis to further improve the achievement of breeding goals.     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)视神经节神经内分泌细胞电生理特征

利用膜片钳技术对体外培养24—48h中国对虾的视神经节端髓A型和B型神经内分泌细胞进行电生理特征研究。电流钳的结果表明，A型细胞具有自发和诱发放电活动；B型细胞没有记录到明显放电活动。在电压钳模式下，中国对虾视神经节神经内分泌细胞表达TTX敏感Na^ 通道、高电压激活L型Ca^2 通道、TEA敏感晚钾通道、早钾通道。Ca^2 通道电流在-40— -30mV被激活，在-10—0mV时达到峰值；Ca电流受钳制电压的影响。一定电压范围内，钳制电压越负，Ca电流就越大。外向的钾通道电流均在-40mV左右被激活。晚钾通道电流对TEA敏感，但TEA不能完全阻断晚钾通道电流。     

Pedigree tracing of Fenneropenaeus chinensis by microsatellite DNA markers genotyping

1 IntroductionThe microsatellite DNA markers, which werealso called simple sequence repeats (SSR), are oneof the DNA markers developed in the late 1980s.The microsatellite DNA markers have several advan-tages over other molecular markers. For example,(1) …     

中国对虾(Penaeus chinensis)四倍体诱导研究

利用光控和行为学原理,控制中国对虾在适当时候产卵,在一定的时刻以温度休克和细胞松弛素的方法诱导受精卵发育成为四倍体。作者发展了对虾染色体制备技术,以中肠和触角腺、精巢为材料,从后期幼体直到8～9cm左右次成虾均获得较好的分裂中相。染色体倍性检测结果表明,最好的四倍体诱导成功率达66.7％。共获得10cm左右的实验对虾几千尾。初步观察表明,四倍体中国对虾具有一定的生长优势。     

Establishment of microsatellite-based triplex PCR for parentage analysis of Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

Through exploring the microsatellite primers from the random genome sequences of Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis), some microsatellite primers were obtained with rich polymorphic genetic information, and a triplex PCR was established using three primers (RS1101, RS0683 and H081 primers). By adjusting the final concentration of Mg2 , dNTP and primers, and using a touch-town PCR program, the optimum amplification parameters of PCR system were obtained, which could successfully amplify the three primers in a PCR reaction. In the denatured PAGE gel, the amplified DNA fragments of three primers RS1101, RS0683 and H081 could be easily identified each other. For the triplex PCR system, the PPE (probabilities of paternity exclusion) is 0.967 9, and the DP (discrimination power) is 0.999 327. Using the triplex PCR to test ten individuals of a parentage and their parents, an individual was excluded from the parentage in all of the three microsatellite loci, which might be mixed into the parentage for some unknown reason such as factitious misplay. The triplex PCR will be of great practical value in identifying the parentages of F. chinensis.     

SDS-PAGE与液质联用技术分离和鉴定中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血浆蛋白

提取中国明对虾的血浆蛋白用SDS-PAGE进行分离.将电泳条带从上到下平均切成4份,分别胶内酶解并利用液相色谱.串联质谱系统进行质谱分析.利用SEQUEST软件对NCBInr蛋白数据库进行检索,鉴定了66个中国明对虾血浆蛋白质.运用生物信息学手段,对鉴定的蛋白进行功能分类,包括转录、细胞结构和骨架、信号转导、蛋白质合成与处理、蛋白质折叠、分拣和降解、免疫功能、生长和发育、能量代谢、细胞周期、碳水化合物代谢、钙离子平衡、抗氧化剂和氨基酸和脂类代谢等.本研究丰富了中国对虾血浆蛋白质表达谱,可为进一步研究对虾免疫机制提供有力的支持.     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) “黄海2号”人工感染WSSV的荧光定量分析

采用人工投喂的方法对人工选育的104个"黄海2号"中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)家系的5557尾个体[体重(2.1±0.7)g]进行WSSV感染实验,分别选取存活时间最长(342h)和存活时间最短(45h)的48尾个体,定义为抗病组和敏感组。用荧光定量PCR方法检测两组对虾体内WSSV含量,结果表明,抗病组和敏感组对虾体内WSSV含量范围分别为(2.64×104)—(3.13×106)和23.2—1.92×106copies/ngDNA,平均值分别为8.71×105和3.19×105copies/ng DNA,抗病组对虾WSSV含量显著高于敏感组(P<0.05),显示抗病组比敏感组具有更强的抗病性能。对感染测试的所有对虾的死亡情况进行统计分析,结果表明,其死亡曲线不符合数量性状的正态分布特征,提示中国对虾对WSSV的抗性可能由少数几个主基因决定。本研究可为揭示中国对虾抗WSSV性状的基因决定机制提供依据。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)Akt/PKB 基因在病原刺激下的表达和功能分析

本文在对中国明对虾转录组数据进行生物信息学分析的基础上,克隆获得了其Akt/PKB基因(FcAkt)的开放阅读框(ORF)的cDNA序列,分析了对虾FcAkt基因的结构特征,并利用实时定量RT-PCR技术分析了FcAkt基因在鳗弧菌、溶壁微球菌和白斑综合征病毒(WSSV)注射后的转录表达变化。结果表明,中国明对虾FcAkt基因的ORF全长为1536bp,编码511个氨基酸,预测蛋白分子量为58.9kDa,理论等电点pI为5.60。同源比对显示该基因的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性。进化分析发现FcAkt与地蟹、果蝇、埃及伊蚊、家蚕等节肢动物的蛋白激酶B(Akt/PKB)亲缘关系较近。FcAkt的转录表达在不同细菌或WSSV刺激后具有明显的变化,提示对虾FcAkt基因可能在对虾的免疫防御中发挥了重要作用。     

抑制性消减杂交技术结合cDNA MICROARRAY技术在中国明对虾WSSV感染后差异表达基因研究上的应用

以中国明对虾WSSV感染6h的头胸部组织为实验材料,提取总RNA分别进行正反向抑制性PCRcDNA消减杂交,消减杂交后的PCR产物经纯化并克隆到T载体,进而转化成正反向消减文库。消减文库库容分别为:正向库,3.7×104;反向库,1.2×104。利用消减文库的克隆构建了cDNA表达谱芯片,共有1536个靶点,其中正、反向文库各768个。使用该cDNA芯片对WSSV感染后6h的对虾组织进行了表达谱分析,对其中80个出现明显表达调控变化的阳性克隆进行了测序。结果显示,在WSSV感染后6h,病毒基因开始大量表达,而宿主糖酵解,嘌呤、嘧啶代谢以及精氨酸代谢等代谢途径的关键基因出现明显下调。这表明病毒已在宿主体内大批量复制并开始抑制宿主代谢。病毒上调表达的WSV482可能与病毒毒力的增强有关,而宿主蛋白的管家基因如Actin,EFα的下调表达提示:在利用基因表达技术研究WSSV病毒的实验中,管家基因的选择要十分慎重。此外,根据作者已有的研究结果,TPI基因是比较好的候选管家基因。而WSV414、WSV215和WSV482是对WSSV进行RNA干涉实验较好的候选靶标基因。     

中国对虾微卫星DNA的筛选

于2000年2月以中国科学院海洋研究所水族楼暂养的中国虾对材料，采用常规方法从尾部肌肉中提取DNA，构建小片段部分基因组文章，采用人工设计合成的（CT）7，（AT）7重复征段作引物，利用RCR法对中国对虾小片段部分基因组文库进行筛,一实验首冼 对中国对虾中获得31个微卫星序列，分别分析于18个阳性重组克隆中，其中perfect共23个，占74％，imperfect2个，占7％，compound perfect1个，占3％，compound imperfect5个，占16％，结果还表明，在中国对虾基因组DNA中，（CT）n,(AT)n)形式的微卫星序列的含量非常丰富。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)丝氨酸蛋白酶同源物基因(Fc-SPH)的重组表达及活性分析

以实验室前期克隆到的中国明对虾丝氨酸蛋白酶同源物基因(Fc-SPH)(GenBank登录号:DQ318859)为基础,利用原核表达系统对Fc-SPH基因成熟肽区域进行了重组表达和纯化复性分析,并对获得的重组目的蛋白开展了抑菌活性及微生物清除功能研究。结果表明:在体外成功获得了大量有活性的对虾Fc-SPH蛋白(rFc-SPH),活性研究显示rFc-SPH对大多数受试菌种都有明显的抑制效果,并可以加速中国明对虾清除体内外源微生物的速度。作者推断Fc-SPH即可以作为一线防御应答效应物直接参与虾类的先天免疫活动而发挥作用,也可以通过调理作用促进血细胞对病原微生物的吞噬和杀灭。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)血淋巴中凝血蛋白的分离纯化、鉴定及 cDNA 片段克隆、 组织表达谱分析

采用层析技术、N末端氨基酸序列分析及同源基因克隆等技术对中国对虾中国对虾血淋巴中的凝血蛋白(CP)进行了研究。结果表明,纯化的CP约为380kDa,其亚基的分子量约为190kDa,说明该蛋白是由两个相同的亚基组成的同源二聚体;中国对虾CP的N末端氨基酸序列与凡纳滨对虾、保罗美对虾具有100%的相似性,与其它对虾的也具有很高的相似性;获得了CP基因518bp的cDNA片段,分析表明该基因序列与其它虾类CP基因序列的具有很高的同源性;CP基因的组织表达谱分析发现心脏和表皮是该基因主要的合成表达部位。     

生存密度和饵料对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)争胜行为和生长性能的影响

为探讨生存密度和饵料对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)争胜行为和生长性能的影响,实验采用中国明对虾仔虾为材料,设置300尾/m2(DL)、600尾/m2(DA)、1200尾/m2(DH)3个密度梯度,鲜活卤虫和人工配合饵料2种饵料及饱喂(FF)、少喂(LF)、不喂(NF)3个投喂丰度,测定中国明对虾的体长增长、存活率,以及投喂前、投喂时、投喂后对虾之间的争斗行为等指标。结果表明,仔虾间的争胜行为随生存密度的升高而增加,生长和存活率逐渐降低;饵料种类和丰度能显著影响中国明对虾的争胜行为和生长性能(P0.05)。结果显示,生存密度、饵料种类及丰度会影响中国明对虾的争胜行为,投喂鲜活饵料有利于提高存活率和生长速度。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)“黄海1号”部分生长相关性状的QTL定位分析

在已构建好的中国对虾"黄海1号"F2代遗传连锁图谱上,使用WinQTLcart2.5软件进行复合区间作图定位,通过置换实验(1000次重复)确定连锁群显著性水平阈值。在对体重、各腹节长和尾节长8个性状的QTL定位分析中,共检测到29个QTL,其中与体重相关的QTL(BW1.2)、腹节1长相关的QTL(A1L2.1、A1L9.2、A1L17.3、A1L26.4)、腹节3长相关的QTL(A3L16.1)、腹节4长相关的QTL(A4L26.1)、腹节6长相关的QTL(A6L20.3)及尾节长相关的QTL(T3L17.3)等9个达到连锁群显著水平(P=0.05),对性状的贡献率为11.14%—23.60%,其中位于第16连锁群(LG16)上的与腹节3长相关的QTL(A3L16.1)的贡献率为23.60%,达到了极显著水平(P0.001),但它们的加性方向并不一样,除了与腹节1长相关的QTL(A1L2.1)和与腹节6长相关的QTL(A6L20.3)方向为负以外,其余7个主效QTL均呈正方向。本研究同时发现了与QTL紧密连锁的分子标记,如位于第1连锁群(LG1)上的分子标记D9f446、位于第17连锁群(LG17)上的M10f246、位于第26连锁群(LG26)上的SX18和位于第30连锁群(LG30)上的B2f260等,这些与QTL距离仅为0.01cM(厘摩)的分子标记,将为QTL精细定位提供参考。