三疣梭子蟹线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段序列的比较研究

本文采用 PCR扩增和序列测定等技术 ,对三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus)线粒体DNA1 6Sr RNA和 COI基因片段进行了初步研究。经 PCR扩增和序列测定 ,分别得到 1 6Sr RNA和 COI2个基因片段的碱基序列 ,其中 1 6Sr RNA基因片段的大小为 566bp,碱基 A,T,G,C的含量分别为 35.1 6% ,34.45% ,1 2 .37%和 1 8.0 2 % ;COI基因片段的大小为 658bp,碱基 A,T,G,C的含量分别为 36.63% ,2 6.44% ,2 0 .52 %和 1 6.41 %。在 2种基因片段中 ,AT含量均明显高于 GC含量 ,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的 1 6Sr RNA和 COI基因片段研究结果相似。通过对三疣梭子蟹 1 6S r RNA和 COI2个基因片段遗传特征的研究 ,发现其种内变异较低 ,在 3个样本中 1 6Sr RNA基因片段序列完全一样 ,COI基因片段中也只有 2个 T/ C位点转换。另外 ,比较本研究所得序列与 Gen Bank中梭子蟹科 5个属的 1 6Sr RNA基因片段序列后 ,发现其聚类结果与传统分类相一致。     

中国和越南青蟹线粒体16S rRNA基因序列分析

为确定我国青蟹的分类地位及其资源的合理利用与保护提供理论依据，对中国和越南青蟹的线粒体16S rRNA基因片段序列进行了测定，并同Genbank中其他青蟹的序列进行了比较，分析研究了青蟹种内和种间的遗传差异及其分类地位。结果显示：中、越青蟹个体间序列差异极小，与Genbank中Scylla paramamosain同源片段序列的相似性达到99％以上．而与其他3种青蟹的差异达3．91％～8．41％。所得序列与S．paramamosain，S．serrata，S．olivacea及s．tranquebarica的遗传距离分别为0．002，0．075，0．087，0．042，种间遗传距离远大于种内距离。序列特征、遗传距离和系统进化分析结果都表明本文研究的中国和越南青蟹均为S．paramamosain。     

基于线粒体COI和16S rRNA基因的中国沿海相手蟹系统发育研究

相手蟹科的诸多种类因其形态极其相似成为方蟹总科分类中疑问较多的一个类群。通过对中国沿海相手蟹线粒体COI和16S rRNA基因序列进行分子系统发育分析,结果表明14种相手蟹COI和16S rRNA基因序列之间差异分别为5.7%～14.5%和1.5%～12.1%,均达到了种间差异水平。构建的系统发育树显示,14种相手蟹分别为独立有效物种,但分属于拟相手蟹属和近相手蟹属的4种拟相手蟹和3种近相手蟹,没有分别形成2个独立的支系,而是混合聚成一大支系。而属于螳臂相手蟹属的无齿螳臂相手蟹则首先与属于中相手蟹属的中华中相手蟹聚成一支,再与红螯螳臂相手蟹聚为一大支,表现出与形态分类的不一致。错综复杂的分子系统关系预示着相手蟹类为多系起源,也表明它们之间的种间关系乃至于属间关系尚有诸多问题有待进一步厘定。     

3种蛏类线粒体16SrRNA和COI基因片段的序列比较及其系统学初步研究

对3种蛏类大竹蛏（Solen grandis），长竹蛏（Solen strictus）和小刀蛏（Cultellus attenuatus）的线粒体16SrRNA和COI基因片段序列进行了比较并对其系统学进行了初步研究。得到的序列总长度分别为472-481bp（16S）和658bp（COI）。3种蛏序列的碱基组成均显示出较高的A＋T比例（16SrRNA基因62．1％；COI基因62．8％）。对位排序比较表明，16SrRNA片段种内个体间变异较小，3种类间存在128个碱基变异位点（其中包括127个简约信息位点）和5个插入／缺失位点，总共12个碱基长；COI片段有200个碱基存在变异，其中包括191个简约信息位点，不存在任何插入／缺失位点。数据分析结果表明16SrRNA和COI基因片段大竹蛏与长竹蛏两片段的遗传距离分别为0．0856和0．1712，两竹蛏类与小刀蛏的遗传距离分别为0．3054，0．2798和0．2662，0．2933。作者认为小刀蛏与竹蛏之间的遗传距离已达到科之间的水平，结果支持将其提升为刀蛏科的分类观点。3种蛏类线粒体16SrRNA和COI基因在种间明显的多态性，证实了16SrRNA和COI基因序列均普遍适用于蛏类种及以上阶元的系统学分析。     

魁蚶线粒体16S rRNA和COI基因片段序列测定及其应用前景

魁蚶（Ｓｃａｐｈａｒｃａｂｒｏｕｇｈｔｏｎｉｉ）是蚶科贝类的一种大型经济种类，主要分布于我国、日本和朝鲜半岛及俄罗斯东南部沿海。在我国，主要分布于辽宁、河北和山东沿海，生活在３～５０ｍ（多为２０～３０ｍ）水深的软泥或泥沙质海底，是我国北方沿海重要的经济贝类之一。但但有有关关其其自自然然群群体体的的遗遗传传变变异异及及群群体体间间遗遗传传分分化化等等方方面面的的研研究究不不多多 ;;同同时时，，作作者者和和日日本本研研究究者者发发现现，，中中国国、、韩韩国国和和日日本本魁魁蚶蚶群群体体在在形形态态和…     

日本蟳线粒体16SrRNA和COI基因序列比较分析

对采自莱州湾和胶州湾的日本蟳野生群体的线粒体16S rRNA和COI基因片段进行了PCR扩增和测序,分别得到长度为519和658 bp的碱基序列.研究结果显示这2个基因片段在种内的变异都较低,对2个基因同源序列分析表明,在线粒体16SrRNA基因片段中共检测到7个变异位点(包括6个单一变异位点,1个简约信息位点)和7种单倍型;在COI基因中共检测到8个变异位点(包括6个单一变异位点,2个简约信息位点)和7种单倍型.通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了两群体间的序列差异和遗传多样性水平.结果显示2个日本蟳野生群体的遗传多样性比较丰富.用MEGA4.0软件构建了NJ和UPMGA系统树,基于16SrRNA基因片段的系统树显示梭子蟹科的4个属聚为两大支:日本蝇不同的单倍型先聚在一起,然后与青蟹属的3种蟹聚为一支;梭子蟹属的三疣梭子蟹、远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚在一起;再与美青蟹属的美洲蓝蟹、巴西蓝蟹等聚为一支.基于COI基因显示日本蟳不同的单倍型先聚在一起,再与其他3种蟳聚为一支;梭子蟹属的远海梭子蟹和三疣梭子蟹相聚,然后与美青蟹属的2种蟹相聚为一支.该结果与传统分类一致.这些数据为我国日本蟳的种质资源保护和利用提供了基础的分子生物学依据.     

基于线粒体COI和16S rRNA基因研究3个地理群体黑龙江河蓝蛤的遗传多样性

采用通用引物对辽宁盘锦、辽宁大连、山东日照的3个地理群体黑龙江河蓝蛤(Potamocorbula amurensis)COI和16S r RNA序列进行扩增、测序分析,得到30条658bp的COI基因部分序列和27条450 bp的16S r RNA基因部分序列。其中COI和16S r RNA基因部分序列T、C、A、G和A+T的平均含量分别为45.4%和32.0%、13.5%和13.3%、20.7%和29.3%、20.4%和25.3%、66.1%和61.3%,AT含量高于GC含量,这与其他软体动物门动物的COI和16S r RNA的观测结果相近。COI和16S r RNA分别检测到了24个单倍型、43个核苷酸多态位点和9个单倍型、19个核苷酸多态性位点。AMOVA分析表明,3个群体间COI和16S r RNA部分基因总遗传分化系数分别为Fst=0.0090(P0.001)和Fst=0.0674(P0.001),群体内遗传分化远大于群体间、群体内存在较高的遗传分化。用NJ法构建分子进化树,3个地理群体的黑龙江河蓝蛤聚为一个族群,有少数个体和其他群体的个体聚在一起。     

基于16S rRNA与COI基因40种石斑鱼亚科鱼类分子系统进化关系

本研究采集了分布在西太平洋的石斑鱼亚科10属共40种鱼类,采用PCR扩增及测序技术获得所有样品16S rRNA、COI基因部分序列,利用最大似然法构建系统进化树并分析。结果表明：40种鱼类COI基因为651 bp,编码227个氨基酸,16S rRNA基因同源序列566 bp,序列存在一定的碱基插入与缺失,各物种16S rRNA基因序列变异比COI要少,序列较为保守。构建的系统进化树上,在本研究的石斑鱼亚科10个属中,鳃棘鲈属分类地位最原始,位于进化树基部,6种鳃棘鲈能聚成一个单系;烟鲈属与九棘鲈属关系较近,两者聚为一支,侧牙鲈属的进化地位介于鳃棘鲈属与九棘鲈属之间;石斑鱼属的进化地位最高,位于进化树顶部,形成两个平行分支,但是石斑鱼属种类未能聚成一个单系;驼背鲈属、鸢鮨属、下美鮨属、光腭鲈属及宽额鲈属均未能形成独立分支,而是与石斑鱼属种类聚在一起,显示其与石斑鱼属有很近的亲缘关系,部分可能是石斑鱼属的特化类群。     

12种石鲈科鱼类线粒体16S rRNA基因的部分序列分析

分析了5属12种石鲈科鱼类的线粒体16S rRNA基因部分序列特征,并参照RNA二级结构模型区分配对区和非配对区。结果表明,配对区对G有偏好(33.5%),非配对区对A有偏好(38.5%);与配对区相比,非配对区存在更多的变异和系统发育信息。从序列的Jukes-Cantor遗传距离结果看,石鲈科胡椒鲷属Plectorhynchus、矶鲈属Parapristipoma、石鲈属Hapalogenys、髭鲷属Pomadasys、Haemulon属5个属属间的差异水平都接近或超过了其与外类群科间的差异水平。从构建的ME系统发育树结果看,石鲈科鱼类分成二大分支,未能形成单一类群。在亲缘关系上,胡椒鲷属和矶鲈属较近,石鲈属和Haemulon属较近,髭鲷属与其它4个属较远,髭鲷属在鲈亚目中的分类地位可能应提高到科的水平。初步确定研究中选用的16S rRNA基因片段基本适用于石鲈科属间和属内种间关系的研究。     

基于线粒体16S rRNA与COI基因序列的刻肋海胆属系统发育研究

本研究以16S rRNA和细胞色素氧化酶I(Cytochrome oxidase subunit I,COI)基因片段序列为标记,以杂色角孔海胆(Salmacis sphaeroides)为外群,基于距离法(NJ)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML)分别构建分子系统树,对刻肋海胆属(Temnopleu rus)进行了系统发育学研究.结果表明,哈氏刻肋海胆、细雕刻肋海胆、T.alexandri三者亲缘关系较近,芮氏刻肋海胆和T.michaelseni亲缘关系较近.两个基因片段的核苷酸替代速率顺序为COI＞ 16S rRNA.以3.49％/百万年的核苷酸分歧速率应用于5种海胆的COI基因片段,推断5种海胆分化事件主要发生在约500～590万年前,为中新世晚期(Late Miocene)或上新世早期(Early Pliocene).     

CLONINGAND EXPRESSION OF TWO GENES ENCODING TYPE I CRUSTACEAN HYPERGLYCEMIC HORMONE FAMILY FROM THE MUD CRAB SCYLLA

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆了两种I型高血糖激素CHH基因（分别命名为C1与C2）cDNA全序列。序列分析结果表明：Cl基因全长1859bp,开放阅读框长420bp,编码139个氨基酸,分子量为15．326kDa,等电点为5．540;C2基因全长1739bp,开放阅读框长426bp,编码141个氨基酸,分子量为15．621kDa,等电点为7．618。与其它物种CHH氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹CHH基因与榄绿青蟹CHH基因同源性最高（92％）,依次为日本鲟（80％）、三疣梭子蟹（78％）。聚类分析表明,拟穴青蟹CHH氨基酸序列与榄绿青蟹和日本鲟紧密聚为一支。经荧光定量检测,拟穴青蟹CHH基因在眼柄、肝胰腺、心脏、肠中表达量较高,鳃、胃中表达量很少,肌肉中表达极少。盐度骤变试验结果表明：盐度胁迫24h后,c2的表达量是C1的30倍以上;C2基因盐度5时与对照组的表达量差异不显著（P〉0．05）,盐度15时差异显著（P〈0．05）,盐度22、25、30时差异极显著（P〈0．01）;盐度变化越大,C2的表达量越大。上述结果为进一步深入研究CHH基因的功能及调控机理奠定基础。     

北部湾拟穴青蟹(Scylla paramamosain)群体遗传结构及其扩张分析

利用线粒体16SrRNA基因片段分析北部湾拟穴青蟹群体遗传结构及其扩张历史。结果表明,16SrRNA基因片段长度在521—523bp之间,6个拟穴青蟹群体具21种单倍型。群体总体水平的单倍型多样性(h)和核甘酸多样性(π)分别为0.6259和0.001851。群体间遗传距离与地理距离之间无相关性。群体间遗传分化系数(Gst)在0.02008—0.04362之间,基因流(Nm)值在5.48—12.20之间。AMOVA分析表明,群体间遗传变异占0.1%,群体内遗传变异占99.9%。群体间固定指数(Fst)的绝对值在0.00026—0.02977之间,暗示群体间没有产生遗传分化。单倍型邻接树和单倍型中介网络图显示,单倍型没有按采样地形成谱系分支。中性检验和错配分析揭示,北部湾拟穴青蟹群体在历史上经历过群体扩张。群体扩张时间大致在更新世晚期的0.04698—0.01879MY前或0.04520—0.01808MY前。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)蛋白二硫键异构酶基因的分子克隆与表达分析

蛋白二硫键异构酶(PDI)是内质网中的关键酶, 参与蛋白合成过程中二硫键的形成、还原和异构。本文首次从拟穴青蟹(Scylla paramamosain)克隆获得了PDI基因cDNA全长, 该序列长度为2015bp, 开放阅读框为1452bp, 编码483个氨基酸。荧光定量PCR检测发现PDI存在于拟穴青蟹的多个组织中; 在拟穴青蟹卵巢发育过程中, PDI基因的表达量在前4个时期逐渐上升, 到了第5期(成熟期)表达量则下降, 表明PDI参与了卵巢发育的蛋白合成过程。免疫组化表明, 拟穴青蟹卵母细胞存在PDI阳性反应, 进一步为该分子参与卵巢发育提供了形态学证据。     

锯缘青蟹大颚器发育的组织学研究

采用组织学方法对锯缘青蟹（Scylla serrata)大颚器进行研究。大颚器位于大颚肌几丁质腱的后侧基部，发育过程可分为4期：I期大颚器很小，肉眼难以辨认，腺细胞数量少，细胞界限不清晰；Ⅱ期大颚顺形状不确定，腺细胞开始形成腺泡；Ⅲ期大颚器通常呈肾形，腺泡多；Ⅳ期大颚器体积最大，呈柱状，腺细胞发达，未见退化现象。锯缘青蟹体长、卵母细胞直径、生精小管直径与大颚器腺细胞直径具有良好的线性关系。实验结果提示了锯缘青蟹大颚器与生长、生殖活动密切相关。     

生物胺对锯缘青蟹大颚器发育的调节作用

雌性锯缘青蟹(Scylla serrata)于实验的第1天、第5天、第10天，分别注射100μL剂量为1μg／g体质量的5-HT，OA和DA，第15天解剖。结果表明，5-HT对锯缘青蟹大颚器发育具有显的促进作用，OA和DA的作用不明显。经免疫细胞化学检测，大颚器内存在5-HT免疫阳性细胞，免疫阳性细胞多数为卵圆形，少数具有很长的胞突，该结果首次为5-HT参与大颚器的生理活动提供了形态学证据。     

锯缘青蟹胸神经团的免疫细胞化学定位研究

采用兔抗哺乳类抗血清，应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫细胞化学技术，研究了锯缘青蟹（Scylla serrata）胸神经团中5-羟色胺（5-HT）、胰高血糖素（Glu）和神经肽Y（NPY）的分布。其分布的主要特征为：5-HT免疫阳性细胞在每对步足神经节都呈对称排列；GLU免疫阳性最强，胸神经节的阳性细胞排列成两条环境胸动脉孔分布的细胞带，神经髓质中免疫阳性物质呈斑块状分布；NPY阳性细胞主要分布于食道下神经节。这3种免疫阳性物质的特定分布模式可为腹神经链的系统演化和参与神经活动提供形态学证据。     

生物胺对雌性锯缘青蟹生殖神经内分泌的调控作用

采用活体注射和体外培养方法，进行生物胺调控雌性锯缘青蟹生殖神经内分泌的研究。结果表明，锯缘青蟹于实验的第1天，第5天，第10天，分别注射100μl剂量为1μg/g体重的5羟色胺(5—HT)、章鱼胺(0A)和多巴胺(DA)，第15天解剖；其中5—HT对卵巢发育具有显著的促进作用，0A和DA的作用不明显。离体条件下，将脑、胸神经团、视神经节分别与卵巢小块进行联合培养，每个实验组分别加入PBS与1μg／g体重的5—HT、OA、DA、HA(组胺)和NE(去甲肾上腺素)，发现卵巢发育的促进作用与5—HT刺激了脑和胸神经团的分泌活动有关。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)PP2A调节亚基B的基因克隆与表达分析

采用RT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹PP2A调节亚基B(PP2A-B)的cDNA全序列,全长2040bp,开放阅读框(ORF)为1332bp,可编码443个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与其它一些物种具有很高相似性,推测PP2A-B基因具有很高的保守性。经荧光定量PCR检测,PP2A-B基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑、卵巢、鳃中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,PP2A-B基因在卵巢未发育期(I期)表达量最高,此后各期逐渐下降,推测PP2A-B在卵巢中可能以PP2A全酶的形式存在,抑制卵巢发育。     

锯缘青蟹神经器官对卵巢发育的调节作用：离体实验

器官联合培养研究表明，锯缘青蟹（Scylla serrata)的脑和胸神经团分泌的性腺刺激激素（GSH）对卵母细胞的生长具有直接的促进作用，对视神经节则没有显的影响。在卵巢发育过程中，脑和胸神经团GSH的生物活性逐渐增强。     

文蛤属(Meretrix)16S rRNA基因及ITS1序列的系统学分析

利用线粒体16SrRNA基因片段及核糖体DNA转录间隔区ITS1序列分析的方法,以近缘属的青蛤(Cyclinasinensis)为外群,对文蛤属的文蛤(M.meretrix)、丽文蛤(M.lusoria)、帘文蛤(M.lyrata)和斧文蛤(M.lamarckii)4种贝类进行了系统学研究。经ClustalX多重比对及DNAsp软件分析后,用PAUP4.0分析软件,计算出种间序列的碱基转换/颠换频率,利用邻接法NJ构建系统发育树。结果表明,帘文蛤与该属其他三种的分歧时间较早,两类序列与其他种类间的相对遗传距离分别在0.25866—0.28218和0.15644—0.20104之间。文蛤与丽文蛤间的16SrDNA及ITS1序列间的遗传距离仅为0.04805和0.04201,拓扑结构图显示关系很近,并且二者的分布区大面积重叠,其序列间的转换/颠换频率接近种内单元型(haplotype)间的序列变化,鉴于它们的贝壳形态有一定差别,应归为同一个种内的不同地理亚种比较恰当。