温度、盐度对海湾扇贝(Argopecten irradians)南北亚种回交幼虫生长和存活的影响

开展了海湾扇贝南北亚种杂交子代同海湾扇贝北方亚种间回交、杂交子二代及北方亚种对照组等群体的基因型和温度、盐度等环境因素之间的互作研究。研究结果表明,杂种F2和回交组别相对纯种组别存在生长优势。温度和盐度均对不同基因型群体的生产和存活产生显著的影响,其中在逆境温度下杂种F2和回交组能够更加适应并表现出更高的生长优势,而在盐度中结果却并非如此,这表明基因型和环境之间的互作机制比较复杂。研究结果为继续在不同海区环境下开展海湾扇贝回交育种提供了积极的理论依据和实践参考。     

海湾扇贝维甲酸受体(RXR)cDNA克隆与表达分析

维黄酸受体(RXR)是核受体超家族的重要成员,已有研究表明其在脊椎动物中广泛参与调控生长发育、新陈代谢等多种重要的生理过程。本研究采用RACE技术克隆获得海湾扇贝(Argopecten irradians)RXR(AiRXR)cDNA序列,采用荧光定量RT-PCR技术分析该基因在性腺发育不同时期的不同组织中的表达特点。结果表明,AiRXR的c DNA序列开放阅读框为1338bp,含有两个亚型:AiRXRα和AiRXRβ,两个亚型之间在T-box中相差4个氨基酸。该蛋白序列与人(Homo sapiens)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)等的RXR相似性很高。AiRXR进化树分析显示,AiRXR与软体动物RXR聚为一支。AiRXR基因具有广泛的组织表达特点,在检测的组织中(外套膜、鳃、性腺、闭壳肌)均有表达,推测AiRXR以信号分子的形式参与多种组织细胞的生命过程;在海湾扇贝性腺发育过程中AiRXR基因在性腺发育的各时期均有表达且增殖期表达量最高,说明AiRXR基因可能参与调节性腺发育和分化的过程。     

海湾扇贝(Argopecten irradians)金属硫蛋白基因的克隆与分析

金属硫蛋白是一种普遍存在于生物体内的低分子量、半胱氨酸含量丰富、易于被外界刺激诱导的金属结合蛋白。采用表达序列标签法,结合cDNA末端快速扩增技术,首次获得了海湾扇贝金属硫蛋白(AiMT)的全长cDNA序列。该序列全长787bp,5′UTR(UntranslatedRegion)为79bp,3′UTR为270bp,开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)长度为438bp,可编码145个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸含量丰富,甘氨酸含量也较高,芳香族氨基酸含量低,不含组氨酸,存在有无脊椎动物和软体动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXX-CXCX,C-末端的氨基酸序列也符合软体动物金属硫蛋白标签序列C-x-C-x(3)-C-T-G-x(3)-C-x-C-x(3)-C-x-C-K。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族的成员。     

不同贝壳颜色海湾扇贝(Argopecten irradians)家系的建立及生长发育研究

海湾扇贝是雌雄同体的贝类 ,其壳色有橙、棕、黄、紫、白等色彩。利用壳色可遗传的特性 ,采用自体受精的交配策略 ,于 2 0 0 2年成功地建立了 4个橙色、3个紫色、4个白色等 3类共 1 1个海湾扇贝自交系 ,并对不同家系的受精卵大小、胚胎孵化率及幼虫、稚贝和养成阶段的生长速率与存活率等生物学参数进行了比较。结果表明 ,在幼虫和稚贝等早期发育阶段 ,3类壳色的不同家系在生长速率和存活率等方面没有表现出差异 ,但是在养成阶段 ,在高温的7、8月 ,白壳色家系的生长速率和存活率均明显高于其它 2种壳色的家系。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)中ChIP-seq 方法的建立

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)作为研究DNA 结合蛋白与DNA 相互作用最有力的工具, 越 来越受到重视。但目前该技术在牡蛎等贝类中的应用尚未见相关报道。为了研究长牡蛎早期胚胎发 育过程中表观遗传信息的变化模式, 本文在长牡蛎胚胎中探索并建立了一套完整的染色质免疫共沉 淀方法, 构建了高质量的高通量测序文库, 首次获得了牡蛎全基因组水平的组蛋白H3K4me3 修饰分 布, 从而为研究牡蛎的表观遗传调控奠定了基础。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)黑色壳表面微生物多样性的研究

为探究自然海区与室内养殖环境对软体动物壳色及壳表面细菌群落多样性的影响，以黑色壳长牡蛎（Crassostrea gigas）为研究对象，在自然海区与室内环境分别暂养30 d后，对长牡蛎的壳色及壳表面细菌群落的多样性和差异细菌功能进行分析。结果表明，室内养殖的黑壳长牡蛎出现较为明显的壳褪色现象，其黑色素含量显著下降，远低于自然海区养殖的黑壳长牡蛎。16S rRNA基因测序结果显示，变形杆菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝细菌（Cyanobacteria）为长牡蛎壳表面的主要优势菌，其中变形杆菌的丰度超过50%。在门水平上，放线菌（Actinobacteria）、俭菌超门（Parcubateria）和Bacterial rice cluster 1（BRC1）在室内、外养殖长牡蛎之间存在较为显著的差异（P<0.05），而具有降解作用的放线菌和俭菌超门细菌在室内养殖的黑壳长牡蛎壳表面丰度较高。在属水平上，两组之间存在显著差异的细菌共计67种。该研究揭示了不同生境条件下，黑壳长牡蛎壳表面的微生物群落物种组成及差异，为解析长牡蛎壳色的形成机制提供了新的分析视角。     

水温和盐度对长牡蛎“海大1号”早期生长发育的影响

为确定长牡蛎新品种"海大1号"苗种繁育的最适环境条件,研究了盐度对其胚胎发育的影响以及盐度、水温对其幼虫生长、存活率和附着率的影响。结果表明:长牡蛎"海大1号"受精卵孵化的最适盐度为30~35,孵化率最高可达90%。幼虫生长的适宜盐度为20~35,最适盐度为20~30;存活的适宜盐度为20~35,最适盐度为20~25;幼虫附着的适宜盐度为20~35,最适盐度为25~30;对长牡蛎"海大1号"幼虫生长、存活、附着的适宜水温分别为为20~30℃、20~25℃、20~30℃,最适水温分别为30、25、30℃,高温35℃时幼虫全部死亡。综上,长牡蛎"海大1号"苗种培育的适宜盐度为20~35,适宜水温为20~25℃。上述结果为长牡蛎"海大1号"规模化苗种繁育提供了重要的基础资料。     

三种壳色硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)的生长性状差异及通径分析

壳色是影响商品贝类经济价值的重要性状。本研究以不同壳色的硬壳蛤（Mercenaria mercenaria）群体为繁殖亲贝，采用个体间随机交配的方法，成功选育了白、红和杂3种壳色的子代群体，并在池塘培育至360日时测量了其壳长（X₁）、壳高（X₂）、壳宽（X₃）及活体质量（Y），并使用相关性分析、主成分分析和通径分析等方法，探究了不同壳色硬壳蛤在幼虫期和稚贝期的生长性状差异及壳形态性状（壳长、壳高、壳宽）对活体质量的影响。研究结果表明：在幼虫期，与白色和红色群体相比，杂色群体生长速度更快、变态率更高，但存活率低（P<0.05）；在稚贝期，白色群体表现出显著的生长优势（P<0.05）。相关性分析结果显示，3种壳色硬壳蛤的壳形态性状（X₁、X₂、X₃）与活体质量（Y）的相关系数均达极显著水平（P<0.01）。主成分分析和通径分析结果表明，硬壳蛤的壳长（X₁）是影响其活体质量（Y）的主要因素。本研究结果能够为不同壳色硬壳蛤良种选育提供重要理论依据和基础数据。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)野生与选育群体的微卫星遗传多样性分析

为了评估长牡蛎(Crassostrea gigas) 2个壳长性状(掌心形)快速生长选育群体(LY2-K4、LY2-K7)、1个壳高性状(速生型)快速生长选育群体(LY2-K11)和6个野生群体(QHD、LS、HD、ZH、WD、KTD)的遗传多样性和遗传结构, 用21对多态性丰富的微卫星引物对9个长牡蛎群体的269个个体进行了遗传分析。结果显示: 21个微卫星位点共检测出了460个等位基因(N_a),平均等位基因数为21.905; 21个微卫星位点的多态信息含量(PIC)均大于0.5, 具有高度遗传多态性; 选育群体LY2-K11的遗传多样性最低(N_a=13, I=2.128,H_e=0.831, PIC=0.825), 野生群体KTD的遗传多样性最高(N_a=29,I=3.112, H_e=0.941, PIC=0. 938); 189个群体位点组合有66%偏离哈代-温伯格平衡, 表明这些群体存在一定程度的杂合子缺失; 9个群体间的遗传分化指数(F_st)为0.012~0.064, 处于较低的遗传分化水平; AMOVA分析显示遗传变异主要来自于个体内; PCoA分析结果与UPGMA聚类树一致, LY2-K11群体单独聚为一类, QHD和HD群体聚为一类, 其他6个群体聚为一类。综上所述, 长牡蛎3个选育群体和6个野生群体遗传多样性均较高, 遗传分化水平较低; 选育群体LY2-K11多样性略有下降, 选育过程中应保证亲本的数量及质量, 防止因近交衰退造成遗传多样性降低, 苗种抗逆性变差。该结果将为长牡蛎新品种的选育和野生种质资源的保护提供科学指导。     

外源CaCl2调控浒苔(Ulva prolifera)高温逆境的比较转录组研究

钙(Ca~(2+))作为一种必需的信号分子,在植物的生长发育和非生物胁迫调节中起着至关重要的作用。本实验采用BGISEQ平台进行高通量测序,获得浒苔外源CaCl_2添加(UpCa)和高温对照(UpHT)处理下相关的转录组数据,分析了在高温(35℃)下外源CaCl_2的添加转录组的变化。结果显示,根据UpHT和UpCa处理分析共获得36625条基因;与UpHT相比,在UpCa下鉴定出7513个差异表达的基因,包括6002个上调基因, 1151个下调基因,对差异基因进行了GO富集和KEGG富集分析。对膜转运、植物信号转导和环境适应性相关的差异基因进行KEGG富集分析,主要富集在内吞(Endocytosis)、植物病原菌互作(Plant-pathogeninteraction)、丝裂原激活的蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway-plant)、植物激素的信号传递(Plant hormone signal transduction)、ABC转运(ABCtransporters)和磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidylinositolsignalingsystem)等代谢通路上。植物激素信号转导途径中,细胞分裂素、脱落酸、油菜素内酯和乙烯信号转导途径增强。抗氧化酶中FeSOD、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽S转移酶和抗坏血酸过氧化物酶等基因表达上调,下调的基因主要是热激蛋白。Ca~(2+)信号组分基因钙结合蛋白、钙调素、钙/钙调素依赖的蛋白激酶以及钙/钙调蛋白依赖性3′,5′环核苷酸磷酸二酯酶的基因表达上调,丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶和磷脂酰肌醇信号相关的基因也差异性上调。本研究系统阐述了植物信号转导、抗氧化酶、MAPK信号系统以及Ca~(2+)信号组分基因在外源CaCl_2对浒苔高温压力的调节中的重要作用,可为进一步阐明Ca~(2+)信号对高温的调节适应机制提供理论基础。     

海湾扇贝混交家系中优先受精以及自然选择压力下杂合子过剩的研究

以中国海湾扇(Argopecten irradians)贝养殖群体为亲本分别构建了5个配对混交的海湾扇贝混交系,通过5对微卫星分子标记为手段对海湾扇贝卵子在同一个体和不同个体精子间的优先受精问题和不同生命阶段的海湾扇贝混交系杂合子比例的变化进行了研究。结果发现在受精后6 h的担轮幼虫期3个混交系中有2个混交系杂合子显著过剩。5个混交系的1d D形幼虫、20d稚贝、40d稚贝、3个月稚贝以及成贝在自然选择压力下杂合子比例逐渐上升,以壳长计算的杂交优势率也呈逐渐上升趋势,并且各个阶段的杂合子比例同杂交优势率的变化成显著正相关。     

基于RNA-Seq技术的海湾扇贝闭壳肌近交衰退的分子机理研究

了解近交效应对评估贝类长期育种的可行性及分析自交和全同胞交配子代的近交衰退有重要意义。海湾扇贝是典型的性腺雌区与雄区严格分开的雌雄同体型海洋贝类,行体外受精。它是研究贝类遗传近交衰退和交配系统进化的一个模式物种。目前双壳贝类的近交衰退研究多集中在表型和分子标记等方面,但基因组表达层面的研究较少。本研究比较了亲本遗传背景相同的海湾扇贝近交系F=0.5和杂交系闭壳肌组织的基因表达。表型方面：近交系和杂交系在某些生长性状有差异,其中近交系的壳长和总重低于杂交系。基因表达方面：自交系有1175个基因表达量上调,1390个基因表达量下调。差异表达基因主要集中在肌原纤维、收缩纤维和细胞质膜等。GO功能富集主要集中在转移酶、磷酸酶、蛋白激酶和活性肽等方面。差异明显的通路主要集中在氧化磷酸化通路和细胞凋亡通路。利用独立亲本的近交系和杂交系采用qRT-PCR技术,验证了近交系的差异表达基因主要参与氧化磷酸化通路和细胞凋亡通路, 说明自交能影响能量代谢和自稳态。     

海湾扇贝与紫扇贝生殖隔离研究

对海湾扇贝(Argopecten irradians)和秘鲁紫扇贝(Argopecten purpuratus)进行了跨种间的杂交尝试,结果显示两个物种之间正向和反向均可受精和正常发育,没有发现合子前隔离,并且通过internal transcribed spacer 1(ITS1)标记验证了杂交的成功.至杂交子一代性成熟时通过对杂合子成熟性腺进行H.E.染色石蜡切片观察发现,雄性性腺明显退化且不能产生有活力的精子,雌性性腺发达且能形成外观正常卵子,但是却不能与亲本进行回交,即表现为典型的合子后隔离:杂种不育.     

杂交与三倍体诱导对海湾扇贝(Argopecten irradians)幼虫的复合作用

基于2×2交叉实验设计,通过杂交和6-DMAP等诱导处理,构建了二倍体自交组、二倍体杂交组、三倍体诱导自交组和三倍体诱导杂交组等四个实验组家系,探讨了海湾扇贝(Argopecten irradians)幼虫期生长及存活的杂种优势和6-DMAP诱导处理效应的复合作用。分别计算各家系的孵化率,测定了各家系幼虫期第1、5、10天幼虫个体的壳长以及第5天和第10天各家系幼虫的存活率。利用一般线性模型(general linear model (GLM))计算表型变量的原因方差组分,评估了杂交和6-DMAP处理对扇贝幼虫生长和存活的影响。结果显示:6-DMAP处理组孵化率要显著低于非处理实验组(P0.05)。三倍体诱导自交组第5天幼虫存活率显著低于其他组(P0.05),到第10天三倍体自交组全部死亡。三倍体诱导杂交组第10天存活率低于二倍体组但不显著(P0.05)。在第1天幼虫生长中,三倍体诱导杂交组幼虫壳长显著小于其他组(P0.05),第5天幼虫生长中,三倍体诱导杂交组壳长则显著大于其他组,而三倍体诱导自交组则显著小于其他组(P0.05)。在第10天幼虫生长中,二倍体自交组显著小于二倍体杂交组和三倍体诱导杂交组组(P0.05)。上述结果显示扇贝幼虫生长期的杂种优势和三倍体诱导效应间存在一定相互作用。     

有效群体大小对海湾扇贝F1生长和存活的影响

有效群体大小(Ne)为群体内所具有的相当于理想群体繁殖个体的数目[1~3],在群体遗传学中占有十分重要的地位,这方面的研究在国外已有很多报道[4~6].当Ne较小时,由于瓶颈效应,野生或养殖群体倾向于近交水平的增加[7].早期研究表明,为了避免近交衰退,确保群体短期内的生存能力,最小的Ne值应为50;如果要维持适当的遗传变异,进而确保长期的生存能力,Ne数量不应小于500[8,9].     

海湾扇贝杂交、近交和自交家系的微卫星标记偏分离分析

海湾扇贝(Argopecten irradians)是典型的雌雄同体型贝类,行体外受精,能自体受精也能异体受精,因此可产生3种不同形式的交配方式:杂交(Out bred)、近交(Inbred)和自交(Selfing).本研究筛选了10对多态性微卫星引物对海湾扇贝4个不同近交梯度共8个家系基因型进行了遗传分离分析.从偏分离标记的个数来看,杂家家系最多,其次是自交一代和自交二代,最后是近交家系.结果表明只有自交家系后代基因型存在纯合子缺失,部分证明了显性遗传效应,同时筛选出3个与有害基因连锁的微卫星标记.     

紫扇贝、海湾扇贝及其正反杂交子代群体遗传结构的AFLP分析

本研究应用 AFLP 分子标记技术,对紫扇贝(Argopecten purpuratu, PP)、海湾扇贝(Argopecten irradians, II)、正交子一代(紫扇贝♀×海湾扇贝♂, PI)及反交子一代(海湾扇贝♀×紫扇贝♂, IP)群体的遗传结构进行了分析和比较。用5对AFLP引物扩增得到433个位点,其中多态位点为88.45%;正反交子代中的扩增位点大部分(97.23%)来源于紫扇贝和海湾扇贝;扩增中出现了非孟德尔遗传位点,如紫扇贝和海湾扇贝的部分扩增位点在杂交子代中丢失,正反交子代中出现12个紫扇贝和海湾扇贝中没有的扩增位点;通过多态位点比率、Nei’ s基因多样性、香农式多样性指数、遗传距离和AMOVA分析发现,正反杂交子代之间的遗传分化最小,与紫扇贝和海湾扇贝的遗传分化均显著。     

海湾扇贝养殖群体遗传多样性的研究

用等位基因酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,研究了大连沿岸不同生态环境条件下的大李家湾低排筏、大李家湾高排筏、凌水桥、棋盘磨4个海湾扇贝养殖群体的遗传多样性.在4个群体的7种等位基因酶和闭壳肌蛋白中均检测到了22个基因位点,各群体的多态位点比例分别为22.73%,22.73%,22.73%,18.18%(P≤0.95)和27.27%,27.27%,31.82%,36.36%(P≤0.99);杂合度观测值分别为0.064,0.071,0.075,0.069;Hardy-Weinberg平衡偏离指数分别为-0.068,-0.020,-0.032,-0.050;近交系数分别为0.568,0.565,0.487,0.550;位点等位基因有效数分别为1.102,1.109,1.143,1.122;遗传变异综合评价指数分别为0.0060,0.0071,0.0088,0.0073.海湾扇贝养殖群体遗传多样性总体水平较低,但在这4个群体中,凌水桥群体的遗传多样性水平最高,大李家湾高排筏和棋盘磨群体的遗传多样性水平较高,大李家湾低排筏群体遗传多样性水平最低.