超声波提取-固相萃取联用检测河鲀毒素的研究

使用热处理、震摇、超声波等手段改善水产品中的河鲀毒素提取率,利用多种固相萃取柱纯化提取液,采用高效液相色谱-紫外检测法进行检测,重点对河鲀毒素的提取和固相萃取纯化进行了研究。试验发现,结合振荡和加热双重作用的索氏提取法和超声波加热辅助提取法具有较高的提取能力,其中超声波(35kHz,强度100%,60℃)提取10min即可达到最好效果,耗时短,效率更高;比较SCX、PRS、WCX、C18、SAX 5种固相萃取柱对河鲀毒素的吸附作用,SCX、PRS、WCX柱则能够将河鲀毒素完全保留在其上。样品纯化试验结果显示,C18-WCX小柱的组合纯化样品的效果最好,回收率在75%—82%之间,相对标准偏差小于15%。研究结果对河鲀毒素的提取、纯化和检测工作具有重要的参考意义。     

膝沟藻毒素液质联用快速检测及其在海洋生物体内的累积

采用高效液相色谱-质谱联用技术分析了微小亚历山大藻中的膝沟藻毒素(Gonyautoxin,GTX1,4和GTX2,3)以及蒙古裸腹潘和菲律宾蛤仔摄食该藻后对膝沟藻毒素的累积状况.结果表明,采用高效液相色谱-质谱联用方法,可快速(4h内)检测出这三种海洋生物中的膝沟藻毒素,且培养的微小亚历山大藻每个细胞的膝沟藻毒素含量为9.46fmol.蒙古裸腹潘摄食微小亚历山大藻2h、18h、24h后,其体内GTX1,4的含量分别为4.8908、12.6241、31.4968mg/g,GTX2,3的含量分别为1.656、3.8533、10.9026 mg/g,且对GTXl.4积累量比GTX2,3高,在24h内GTX1,4含量是GTX2,3的2.89倍.菲律宾蛤仔摄食微小亚历山大藻2h、24h和48h后,肌肉中GTXI.4含量分别为3.1271、3.6709和4.6906 μg/g,GTX2,3含量分别为7.1874、8.1675和9.1476 μg/g;内脏团中GTX1,4含量分别为4.7088、4.2178和5.5064 μg/g,GTX2,3含量分别为7.6774、9.1476和13.066 μg/g,表明GTX1,4和GTX2,3在肌肉中含量逐步增加,且GTX2,3累积量比GTX1,4高,在48h内肌肉GTX2,3含量是GTX1,4的1.95倍,内脏团GTX2,3含量是GTX1,4的2.37倍.在停食净水培养96h后,内脏团和肌肉对GTX1,4消解率已达100%,而肌肉和内脏团对GTX2,3消解率分别为16.1%和45%.本文结果表明采用高效液相色谱-质谱联用方法能快速测定赤潮藻、浮游动物和贝类中的膝沟藻毒素含量,但不同生物对膝沟藻毒素有不同的累积方式.     

高效液相色谱-质谱联用技术在海洋药用生物化学成分快速鉴别中的应用

高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术,将HPLC的高分离效能与MS的强大结构鉴定功能结合起来,已逐渐成为天然产物化学成分快速分离、鉴别的强有力手段。本研究采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用(HPLC-ESI-MS)技术,成功建立了刺参皂苷快速鉴别方法,并对市售干刺参中的4种皂苷进行了鉴别。此外,应用该技术对罗氏海盘车中的13种化学成分进行了快速鉴别。为海洋药用生物化学成分快速鉴别提供了1种值得推广的新方法,为更好的开发利用海洋天然药物奠定了基础。     

麻痹性贝毒毒素研究Ⅱ.麻痹性贝毒毒素纯化产品的高效液相色谱和质谱分析

麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning， PSP)毒素由石房蛤毒素(saxitoxin， STX)及其衍生物组成，目前已发现20余种，在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等方面均有应用潜力。由于PSP毒素的稀有来源和国际社会对STX交易的禁止，限制了国内PSP毒素应用及研究的全面深入展开，因此本文作者对PSP毒素进行了自行制备，并采用不同方法对制得的PSP毒素进行了分析研究。 目前已建立了多种PSP毒素的生物和化学分析方法。小鼠法作为PSP毒素监测和定量的标准方法已有60余年的历史(Sommer et al.，1937；McFarren et al.1958；Helich，1990)，它对海产品毒性的测定是很有效的方法，但难以揭示毒素的化学本质。其他生物分析方法如免疫分析等尽管灵敏度比小鼠法有所提高，但同样都面临难以揭示毒素的化学本质的难题。因此，对PSP毒素的分析还需借助仪器分析进行确证。尽管现在已针对PSP毒素建立了薄层色谱、毛细管电泳、高效液相色谱等多种化学分析方法，但真正得到广泛应用的只有高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)方法。对于这类PSP毒素的分离是基于离子对反相色谱原理，采用磷酸四丁基铵、己基磺酸盐、庚基磺酸盐、辛基磺酸盐等做离子对，在C-8或C-18反相色谱柱上进行分离。检测手段是基于PSP毒素在碱性条件下氧化——酸化后可以生成荧光衍生物这一原理(Bates et al.，1975)，将PSP毒素衍生生成荧光物质，用荧光检测器进行检测。 Oshima(1989)用三个等梯度洗脱法分别成功地分离分析了PSP毒素中的N-磺酰氨甲酰基类毒素(C1-C4)，膝沟藻毒素(GTX1-6)和石房蛤类毒素(STX，dcSTX和 neoSTX)，全部分析采用C-8反相柱。由于这种方法几乎可以分析已知的绝大多数PSP毒素，因而被广泛接受。     

虾夷扇贝毒素yessotoxins(YTXs),中国沿海贝类中首次发现的一组贝类生物毒素

采用高效液相色谱-串联质谱方法对我国近海贝类中腹泻性贝毒成分进行研究,结果发现采自北黄海大连附近海域的海湾扇贝和虾夷扇贝含有25~41μg/kg的虾夷扇贝毒素(yessotoxin,YTX),在虾夷扇贝体内还含有37.2μg/kg的45-OH-YTX,并在5种贝中发现微量的Homo-YTX毒素组分,这是首次报道在我国贝中检出此类毒素。虾夷扇贝毒素YTXs是一类含有2个磺酰基的脂溶性多环聚醚类化合物,对小鼠的腹腔注射急性致死毒性很高,毒理作用机制尚不清楚。本研究的结果说明我国贝类体内生物毒素成分复杂,亟需进行毒素成分结构、来源生物、生态毒理效应、分布规律及安全限定标准的研究。     

基于高效液相色谱法的扇贝毒素-2制备方法研究

本文以渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata)为实验原料,建立了基于高效液相色谱法(HPLC)的扇贝毒素-2(Pectenotoxin-2,PTX2)的制备方法。研究重点对鳍藻细胞的破碎、PTX2毒素的提取及HPLC纯化等三个步骤的方法进行筛选和优化。结果表明,反复冻融与超声波细胞破碎相结合可获得最大的细胞破碎率和毒素提取率,分别为99.2%和81.5%。采用四种有机试剂(甲醇、丙酮、乙醚、二氯甲烷)及三种固相萃取小柱(Solid Phase Extraction,SPE)(Oasis HLB SPE,Phenomenex Strata-X SPE,Sep-Pak C18 SPE)对PTX2毒素进行提取,其中乙醚-二氯甲烷的提取效率最高,达78.2%。在HPLC对PTX2毒素的纯化实验中发现,流动相的pH会影响毒素组分的分离,其中在碱性流动相(含6.7mmol/L氨水的水溶液和乙腈溶液,pH=10.94)条件下,PTX2的分离效果最佳,响应值最高。实验使用Phenomenex Kinetex C18(4.8mm×250mm,5μm)色谱柱,在上述碱性流动相条件下,分离得到纯度为93.2%的PTX2毒素。本研究选定的藻细胞破碎、PTX2毒素提取、及HPLC纯化方法简单快捷,高效易操作,为从大规模培养的鳍藻细胞中制备高纯度PTX2毒素提供了技术支持。     

UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS非定向筛查贝类中氮杂螺环酸毒素及其代谢产物

为了分析复杂贝类和微藻中的氮杂螺环酸毒素（AZAs）及其代谢产物,建立一种基于超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱（UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS）联用技术的非定向筛查分析方法。采用Full MS/dd MS²、PRM和Target-SIM/dd MS²三种质谱鉴定模式,整合多种数据采集挖掘策略,通过研究多种AZAs在不同基质样品中的质谱裂解规律及特征碎片离子丰度,实现AZAs及其衍生物的快速筛查检测和精准鉴别。结果表明：PRM模式能有效排除AZAs同分异构体的干扰,获得更高的专属性,适用于目标代谢物筛查;应用Full MS/dd MS²和PRM结合的方式,根据AZAs裂解途径及多种AZAs代谢产物裂解规律,在贝类中共鉴别出20种AZAs系列化合物,其中包括初步推测了3种新型AZAs代谢产物的结构。应用本方法还发现AZA9、AZA10、AZA19等代谢物均随代谢过程持续升高,是AZA2在贝类代谢过程中的末端产物。该方法能够为复杂基质中的AZAs系列毒素及其衍生常规检测与精准鉴别提供参考,可应用于解析AZAs毒素在贝类体内的代谢转化机制研究。     

淡水产品中微囊藻毒素固相萃取-高效液相色谱检测方法的建立

研究利用固相萃取-高效液相色谱技术检测淡水产品中的微囊藻毒素MC-LR和MC-RR.样品经80％甲醇水溶液提取后,以固相萃取小柱进行净化,氮吹浓缩后以高效液相色谱进行分析.以65％甲醇水溶液(含0.05％三氟乙酸)为流动相,经C18反相色谱柱分离,以紫外检测器进行定量分析.线性定量范围0.1～2.0μg/g,检出限0....     

适用于快速远程检测海水中氰化物的方法研究

建立了一种适用于海洋远程快速检测氰化物的检测方法,设计了一体化检测装置,未来可搭载到无人艇上实现自动快速检测。针对最佳检测条件进行了一系列优化,得到最佳检测条件:对于100 mL的待测样品,加入酒石酸固体1.5 g;用1～2滴浓度为150 g/L的碳酸钠溶液浸润苦味酸试纸;加热温度80℃,加热时间10min。在最佳检测条件下,检测检出限达0.3mg/L。该方法实现了适用于海水氰化钠的远程检测,大大提高了检测效率,无需人员进入污染现场,安全性高。可广泛用于海洋危化品泄漏、湖泊污染、现场应急筛选等场合的水体样品快速检测。     

江苏沿海贝类软体中麻痹性贝毒素种类及含量变化的多年观测研究

Paralytic shellfish toxins(PSTs) are notorious neurotoxins that threaten public health and food safety worldwide.Although PST monitoring programs have recently been established throughout China, the profiles and variation of PSTs in important commercial clams(e.g., Mactra veneriformis, Ruditapes philippinarum, and Meretrix meretrix) along the Jiangsu Province coastline remain largely unexplored. In this study, a validated hydrophilic interaction liquid chromatography–tandem mass spectrometry(HILIC-MS/MS) method was used to examine PST profiles and levels in 540 clam samples from natural production areas along Jiangsu Province coastline during2014–2016. Although the PST levels(≤6.38 μg saxitotoxin equivalents(eq)/kg) were consistently below European Union regulatory limits(≤800 μg saxitotoxin eq/kg) during this time period, saxitotoxin, decarbamoylsaxitotoxin,and gonyautoxins 1 and 4 were detected, and nearly 40% of the samples were saxitotoxin-positive. The PST levels also varied significantly by seasons, with peak values observed in May during 2014–2016. This is the first systematic report of PSTs in clams from Jiangsu Province, and additional research and protective measures are needed to ensure the safety of clams harvested in this area.     

高效液相色谱 串联质谱法测定水产品中的4种四环素类药物残留量

建立了水产品中四环素(Tetracycline)、土霉素(0xytetracycline)、金霉素(chlortetracyline)和强力霉素(Doxycycline)4种四环素类抗生素残留量的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定方法.以MTC缓冲液提取水产品中的四环素类残留物,经HLB固相萃取柱净化,采用LC-MS/MS选择反应监测(SRM)正离子模式测定,可一次对水产品中的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素进行定性和定量.4种物质定量下限均可达到2.0μg/kg.适用于水产品中四环素类抗生素多残留的同时确证检测.     

高效液相色谱-串联质谱法同时测定海洋沉积物中27种有机磷酸酯

应用广泛且具有毒性的有机磷酸酯(organophosphate esters,OPEs)类阻燃剂,通过水、气输送等多种途径进入海洋环境,可能会导致人类和海洋生物面临潜在的健康风险。因此,建立高效可靠的分析方法对于揭示OPEs在海洋环境中的赋存状况,评估其生态风险具有重要的科学意义。文章建立了同时测定沉积物中27种OPEs的超声提取、固相萃取(SPE)净化以及高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测的分析方法。结果表明:30mL乙酸乙酯(EA)和乙腈(ACN)混合溶剂(体积比为3︰7)的提取效果明显优于单独使用甲醇(MeOH)、二氯甲烷(DCM)、EA和ACN;用5mL EA经LC-C18固相萃取小柱洗脱两次回收率最好;以MeOH和含0.0025%甲酸的水溶液作为流动相时,质谱离子丰度最高。27种OPEs的线性范围为5~500 ng/g (R²>0.99),方法检出限(MDL)范围为0.004~1.250 ng/g,定量限(LOQ)为0.01~4.17 ng/g。三个加标水平(低、中、高)基质加标样品的平均回收率在45%~130%之间,相对标准偏差(RSD)最高11.0%,表明此方法可靠,精密度和灵敏度较高。采用优化的方法分析我国长江口、杭州湾入海口以及东海和黄海交界处海域表层沉积物中OPEs的含量,共检出了21种OPEs,浓度范围为9.83~48.70 ng/g,平均浓度为28.40 ng/g。该方法检测结果高效准确,可用于海洋沉积物中27种OPEs的同时测定。     

甲基睾丸酮在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肌肉中的代谢和消除规律研究

在实验水温(28±2)℃条件下,以60mg/kg单剂量甲基睾丸酮对尼罗罗非鱼混饲口灌给药后,采用超高效液相色谱-串联质谱联用(UPLC-MS/MS)法测定尼罗罗非鱼肌肉中的药物水平,研究甲基睾丸酮在尼罗罗非鱼肌肉中的代谢及消除规律。结果表明,肌肉中药物浓度时间数据符合一级吸收二室开放模型,主要药代动力学参数达峰时间T(peak)为3.04h,质量浓度C(max)为33.331ng/g,消除半衰期T(1/2)β为23.073h。肌肉中甲基睾丸酮浓度24h内呈指数型下降,具有较高的消除速率,其后消除得较缓慢,消除方程符合C=46.18e0.101t。29d后罗非鱼肌肉中甲基睾丸酮水平在美国FDA的检测限0.8ng/g以下,给药120d后肌肉中检测不到甲基睾丸酮残留。     

皱纹盘鲍脂肪酸及脂肪醛二甲基缩醛的气相色谱/质谱分析

研究了用气相色谱/质谱法测定皱纹盘鲍中脂肪酸及脂肪醛二甲基缩醛的方法。皱纹盘鲍经Folch法提取总脂,用10%硫酸-甲醇溶液进行反应,通过气相色谱/质谱法对其脂肪酸及脂肪醛二甲基缩醛的组成进行分析。实验结果表明:10%硫酸-甲醇溶液能有效地对脂肪酸进行甲酯化衍生;同时促使烯醚键断裂,并与甲醇发生缩醛反应生成脂肪醛二甲基缩醛。通过气相色谱/质谱分析,从皱纹盘鲍中共鉴定出32个化合物,包括26种脂肪酸和6种脂肪醛二甲基缩醛;脂肪酸以C16:0、C20:4(n-6)、C20:5(n-3)、C18:1(n-7)和C22:5(n-3)为主;脂肪醛二甲基缩醛以C18:0DMA和C20:1DMA为主。皱纹盘鲍肌肉和内脏中的脂肪酸及脂肪醛二甲基缩醛的组成基本一致,但内脏中的4,8,12-三甲基十三烷酸含量远高于肌肉,具有极显著差异(P<0.01)。     

两个大洋多金属结核标准物质中27种元素的等离子体质谱法测定

从样品制备、仪器操作参数最佳化、内标补偿等几方面着手,利用两个标准物质(GSPN-2,GSPN-3)发展了大洋多金属结核中27种元素的等离子体质谱(ICP-MS)测定方法.这27种元素包括Ba,Ce,Co,Cu,Dy,Er,Eu,Gd,Ho,La,Li,Lu,Mo,Nd,Pr,Sb,Sc,Sm,Tb,Th,Tm,U,V,W,Y,Yb和Zn.各元素测定值与保证值相当吻合.对GSPN-2和GSPN-3,Ba,Sb,Sc,Y,Zn等5种元素可用外标校准法准确测定,其平均回收率(n=3)在91.4%～106.9%之间;可用内标(103Rh)校准法准确测定其他22种元素,其平均回收率(n=3)在89.4%～110.2%之间;各元素3次测定的相对标准偏差(RSD)为0.0%～11.0%.