太平洋牡蛎内切葡聚糖酶基因的克隆、序列特性和表达分析

内切葡聚糖酶是一种重要的纤维素酶,在纤维素水解过程中起到重要作用。本实验利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得了太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)内切葡聚糖酶基因,并对其基因结构和系统进化进行了分析。内切葡聚糖酶cDNA全长802bp,开放阅读框架630bp,编码209个氨基酸。基因组DNA全长505 6bp,含有两段内含子长度分别为205 3和231 3bp。cDNA具有与已发现的内切葡聚糖酶基因相同的保守区结构和功能域,并且与其他已知贝类的内切葡聚糖酶有较高的同源性。利用RT-PCR方法研究了该基因在太平洋牡蛎消化腺、外套膜、鳃、肌肉、性腺和唇瓣组织中的表达,发现内切葡聚糖酶基因仅在消化腺中表达,而在其他组织中没有表达。     

3种鲍16S rRNA基因片段序列的初步研究

本文对引自日本的盘鲍 (H aliotisdiscusdiscus)、皱纹盘鲍 (H.discushannai)和大鲍 (H.gi-gantiea) 3个自然群体的线粒体 DNA 1 6S r RNA基因片段进行了扩增和测序 ,分析了 52 8bp的碱基序列 ,结果显示 :3种鲍的基因序列中 A+T含量为 56.74%～ 57.1 2 %。 3个自然群体间碱基片段序列差异不显著 ,盘鲍与皱纹盘鲍、大鲍彼此均仅有 1处核苷酸检测到变异 ,皆为碱基转换 ,同源性为99.81 % ;皱纹盘鲍与大鲍有 2处碱基转换 ,同源性为 99.61 %。 1 6Sr RNA基因在鲍属内表现出很高的保守性。     

12种石鲈科鱼类线粒体16S rRNA基因的部分序列分析

分析了5属12种石鲈科鱼类的线粒体16S rRNA基因部分序列特征,并参照RNA二级结构模型区分配对区和非配对区。结果表明,配对区对G有偏好(33.5%),非配对区对A有偏好(38.5%);与配对区相比,非配对区存在更多的变异和系统发育信息。从序列的Jukes-Cantor遗传距离结果看,石鲈科胡椒鲷属Plectorhynchus、矶鲈属Parapristipoma、石鲈属Hapalogenys、髭鲷属Pomadasys、Haemulon属5个属属间的差异水平都接近或超过了其与外类群科间的差异水平。从构建的ME系统发育树结果看,石鲈科鱼类分成二大分支,未能形成单一类群。在亲缘关系上,胡椒鲷属和矶鲈属较近,石鲈属和Haemulon属较近,髭鲷属与其它4个属较远,髭鲷属在鲈亚目中的分类地位可能应提高到科的水平。初步确定研究中选用的16S rRNA基因片段基本适用于石鲈科属间和属内种间关系的研究。     

一种基于16S rRNA基因检测海洋浮游细菌群落的微阵列基因芯片

A better understanding of bacterioplankton community shifts following change in marine environments is critical to predict the marine ecosystem function. In order to get a snapshot of the microbial taxonomy profiling of a wide range marine area, a quick, convenient and low cost method would be favorable. In this study, we developed a 16S rRNA gene-based microarray using ARB software, which contained 447 probes targeting 160 families of marine bacteria. The specificity, sensitivity and quantitative capability of this microarray were assessed by single cloned16S rRNA genes. The reliability of this microarray was tested by eight environmental samples. The results showed that the microarray was specific, only 1.16% false results were detected in five single-clone hybridization tests. The microarray could detect DNA samples as few as 1 ng/μL and the signal intensity could reflect the relative abundance of the bacteria in the range of 1 ng/μL to 100 ng/μL of DNA concentration. Hybridization with environmental samples showed that it can discriminate bacterioplankton communities by sites and time. High throughput sequencing results from the eight samples confirmed the hybridization results. It indicated that this developed microarray could be used as a convenient tool to monitor the bacterioplankton community in marine environment.     

鰶亚科两种鱼类的线粒体16S rRNA基因片段序列的比较研究

对鰶亚科两种鱼类的线粒体16S rRNA基因片段进行了PCR扩增和序列测定,分析比较了两种间的序列差异。斑鰶(Konosirus punctatus)16S rRNA基因片段长度为572bp,在3个个体中检测到2个单倍型,花鰶(Clupanodon thrissa)序列长度为575bp,两种间存在30个核苷酸位点(5.2%)的变异。基于木村双参数进化模型得到两种间的遗传距离为0.043。以太平洋鲱和寿南小沙丁为外群构建的NJ树表明,斑鰶和花鰶的亲缘关系较近,而与美洲真鰶(Dorosoma cepedianum)的亲缘关系较远。     

海绵和海鞘中可培养放线菌的分离与多样性比较

在相同的分离培养条件下,为比较地域差别较大的福建海域海绵动物(山海绵Mycalesp.和网架海绵Stylissasp.)和海南海域海鞘动物(皱瘤海鞘Styelaplicata和乳突皮海鞘Molgulamanhattensis)之间可培养放线菌多样性的差异,作者采用5种放线菌分离培养基和1种细菌通用培养基,对海绵和海鞘中的放线菌进行分离培养。采用16SrRNA基因限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)分析和序列分析,揭示其多样性。共获得可培养放线菌198株,其中从海绵中分离到87株放线菌,从海鞘中分离到111株放线菌。RFLP分析表现为38种不同的图谱类型。16SrRNA基因序列分析表明,从海绵中分离到的放线菌包括6个放线菌属,其中有2株菌的16SrRNA基因序列与最相近的菌株相似性低于97%,可能是潜在的新菌株;从海鞘中分离到的放线菌包括7个放线菌属,有8株可能是潜在的新菌株。比较海绵和海鞘中可培养放线菌的多样性发现,从海绵中分离到的放线菌,除节细菌(Arthrobacter)以外,均包括在海鞘分离的放线菌属中。海鞘相关放线菌多样性水平不容忽视,是除海绵之外另一获得新型放线菌资源以及药用天然活性产物的重要来源。     

海南养殖罗非鱼(Oreochromis niloticus)致病链球菌的分离、鉴定及其药敏试验

采用常规的形态及生理生化特性检验、API 20 strep 快速鉴定及分子生物学等方法, 对引起2009 年海南罗非鱼大规模死亡的病原菌进行了致病性、表型生物学, 分子生物学及药敏试验的系统研究。结果表明, 2 株分离菌均为无乳链球菌, 对罗非鱼具有很强的致病性。分离菌 16S rRNA 基因序列(GenBank 登录存取号分别为 GU363869 和 GU363870)与其它链球菌的 16S rRNA 基因同源性相似性在 96.5%—100%之间, 所测 2 株病原菌 16S rRNA 基因之间的同源性为 100%。16S rRNA 基因构建的系统进化树表明, 2 株病原菌均与无乳链球菌聚类。药敏试验结果表明, 分离菌株对头孢类药物、阿莫西林、强力霉素等 27 种试验药物较敏感, 对复方新诺明、卡那霉素等 11 种试验药物不敏感, 对庆大霉素的敏感性不同。     

南海北部陆坡神狐海域HS-373PC岩心表层沉积物古菌多样性

利用分子生物学技术分析南海北部神狐海域天然气水合物潜力区HS-373PC岩心表层沉积物中古菌多样性,从沉积物中提取总DNA并扩增古菌16SrRNA基因序列,对克隆文库进行系统发育分析。结果显示所有古菌序列均属于泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota)。其中泉古菌以C3为主要类群,另有少量序列属于Marine Benthic Group(MBG)-B,MBG-C,Marine Crenarchaeotic Group I(MGI),Marine Hydrothermal VentGroup(MHVG)和Novel Group of Crenarchaea(NGC);广古菌以MBG-D为主,其它序列分别属于UnclassifiedEuryarchaeotic Clusters-1/2(UEC-1/2)。     

Molecular analyses of bacterioplankton communities with highly abundant Vibrio clades: a case study in Bohai Sea coastal waters

We investigated the bacterioplankton abundance, community composition and the associated Vibrio clades of natural seawater in Bohai Sea coastal waters. Seawater samples (10 L in triplicate) were collected at 0.5, 3, and 5 m depths near the coastal aquaculture zone of the Bohai Sea on May 12, 2016. Real-time PCR and 16S rRNA gene amplicon high-throughput sequencing methods were employed by which 485 operational taxonomic units (OTUs) at a 97% sequence similarity level were generated. Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, and Bacteroidetes were the most abundant groups, accounting for 49.5%, 23.5%, and 18.9% of the total assemblage, respectively. Obvious variations in Pseudoalteromonas, Vibrio, and Octadecabacter , which were the most abundant genera, could be observed among diff erent samples. Notably, the results of Vibrio -specifi c real-time PCR indicated that Vibrio had extremely high 16S rRNA gene copy numbers. The 16S rRNA gene sequencing results across all the samples also indicated that they occupied a large proportion of the total assemblage. Both the alpha diversity and major bacterioplankton group Pseudoalteromonas had significant correlations with the concentration of PO4^3-. Overall, studies on bacterioplankton communities with highly abundant Vibrio clades can provide interesting insight into the microbial function and health assessment of the Bohai Sea coastal ecosystem.     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)病原副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的表型及分子特征

采用常规的形态及生理生化特性检验及分子生物学等方法,对引起凡纳滨对虾幼虾发生毁灭性死亡的病原菌进行了致病性、表型生物学及分子生物学的系统研究。结果表明,分离菌为弧菌属(Vibrio Pacini 1954)的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),对凡纳滨对虾、中国对虾及日本对虾仔虾均有强致病性。分离鉴定的4株副溶血弧菌具有淀粉酶、明胶酶、卵磷脂酶活性,但不具有蛋白酶、脂肪酶活性,KP溶血均呈阴性,且均具有K抗原;代表菌株(JGB080708-1株)的16S rRNA基因序列(长度为1456bp,GenBank登录号为GQ205448)和gyrB基因序列(长度为1195bp,GenBank登录号为GQ205453)与副溶血弧菌的两种基因序列相似性均可达98%以上。病原菌的耐药性检测结果显示,对供试49种抗菌药物中的林可霉素等6种药物耐药。     

三疣梭子蟹线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段序列的比较研究

本文采用 PCR扩增和序列测定等技术 ,对三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus)线粒体DNA1 6Sr RNA和 COI基因片段进行了初步研究。经 PCR扩增和序列测定 ,分别得到 1 6Sr RNA和 COI2个基因片段的碱基序列 ,其中 1 6Sr RNA基因片段的大小为 566bp,碱基 A,T,G,C的含量分别为 35.1 6% ,34.45% ,1 2 .37%和 1 8.0 2 % ;COI基因片段的大小为 658bp,碱基 A,T,G,C的含量分别为 36.63% ,2 6.44% ,2 0 .52 %和 1 6.41 %。在 2种基因片段中 ,AT含量均明显高于 GC含量 ,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的 1 6Sr RNA和 COI基因片段研究结果相似。通过对三疣梭子蟹 1 6S r RNA和 COI2个基因片段遗传特征的研究 ,发现其种内变异较低 ,在 3个样本中 1 6Sr RNA基因片段序列完全一样 ,COI基因片段中也只有 2个 T/ C位点转换。另外 ,比较本研究所得序列与 Gen Bank中梭子蟹科 5个属的 1 6Sr RNA基因片段序列后 ,发现其聚类结果与传统分类相一致。     

相手蟹属两种蟹类线粒体16SrRNA基因序列的比较

测定了相手蟹属（Sesarma）红螯相手蟹（S．haematocheir）和褶痕相手蟹（S．plicata）线粒体16SrRNA基因部分片段的序列,二者的序列长度相同,均为533bp,且A、T、G、C的含量相似,分别为198bp（37．1％）,206bp（38．6％）,84bp（15．8％）,45bp（8．4％）和200bp（37．5％）,205bp（38．5％）,81bp（15．2％）,47bp（8．8％）;二者的序列有49处差异,其中21个位点为转换、22个位点为颠换和6个缺失／插入位点。进一步对20种相手蟹属蟹类的长度为361bp的16SrRNA基因同源序列进行分析,发现AT的含量为78．6％～82．9％,明显高于GC的含量,且存有91个变异位点。从NJ树和遗传距离来看,在分布于中国的3种相手蟹中,无齿相手型（S．dehaani）和红螯相手蟹的亲缘关系最近（d=0．0151）,而它们与褶痕相手蟹的亲缘关系则较远（d=0．0924／0．09231。分布于中国的相手蟹和分布于北美的相手蟹之间存在着较大的遗传距离（差异）,表明它们之间有着较远的亲缘关系,互为单系起源。     

以16S和16S—23S rDNA间区为靶区建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) PCR快速检测技术

提要应用BLAST程序和DNAstar软件,比较分析了5株副溶血弧菌和其他细菌的16S—23S rDNA间区序列,选取IGSIA作为扩增靶区,结合相邻的16S rDNA序列,设计合成了一对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了快速检测副溶血弧菌的PCR方法,对其特异性和敏感性进行了探讨,并初步进行了应用研究。结果表明,新建的PCR方法能特异性地扩增出大小为306bp和552bp的2条带,分别对应于副溶血弧菌的IGS0和IGSIA,检测灵敏度为5.6×102CFU/ml,半个工作日即可得到准确的结果,能有效检测出在杂色鲍、凡纳滨对虾和各种水质中的副溶血弧菌,适用于海洋水产动物副溶血弧菌病的早期快速诊断、水产品的检疫及水质环境的监测。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的表型与分子鉴定

从江苏连云港某养殖场养殖死亡的泥鳅肝脏、血液及腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对泥鳅具有很强的致病性。采用表观分类学及分子生物学方法,对分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶活性及溶血活性等生物学性状检验;用PCR方法同时扩增其16SrRNA和gyrB基因,分析了16SrRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,通过基因序列分析,比较了两种基因在相似细菌的检测和鉴定能力;基于16SrRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌(LD081008B-1)所扩增的16SrRNA和gyrB基因序列均与GenBank数据库中霍乱弧菌具有较高的相似性,且gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;16SrRNA基因序列长度为1446bp(GenBank登录号:GQ205447),gyrB基因序列长度为1207bp(GenBank登录号:GQ205452);根据分离菌的表型特征及分子特征,判定病原菌为弧菌属(VibrioPacini1854)的霍乱弧菌(Vibriocholerae)。胞外酶活性及溶血活性检测表明分离菌均具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、明胶酶及DNA酶活性,在含7%家兔脱纤血...