对虾白斑综合征病毒VP28基因在大肠杆菌中的表达

在已构建重组质粒pGEM—vp28的基础上,通过NcoⅠ,HindⅢ双酶切质粒pGEM—vp28和表达载体质粒pET-30a,分别获得携带限制性内切酶粘性末端的vp28基因片段和表达载体质粒片段,两片段经T4DNA连接酶连接获得了重组表达质粒pET30a—vp28,将此重组质粒导入表达宿主菌Escherichia coli BL21中,用IFIG诱导表达4h后,其表达产物在SDS—PAGE和Western blot中的显示的特异性条带大小约27ku,与预期的大小相近。     

用甲基化修饰法抑制钝顶螺旋藻遗传转化中限制性内切酶对外源质粒的降解

胞内限制性内切酶降解外源DNA,是钝顶螺旋藻/节旋藻(Spirulina/Arthrospira platensis)遗传转化的难点之一。通过用EDTA螯合Mg2 抑制限制性内切酶活性的方法,对外源质粒进行了甲基化修饰。结果表明,修饰后的外源质粒可抵抗限制性内切酶3h的降解,有利于钝顶螺旋藻的遗传转化。     

凡纳滨对虾溶菌酶基因在大肠杆菌中的表达和活性检测

将凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)血淋巴细胞中提取的总RNA,经RT-PCR扩增溶菌酶基因(LvLys 基因)的开放阅读框,将其克隆至pMD18-T并测序.用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切取目的基因并与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组质粒pET-28(a+)/LvLys,转移到BL21(DE3)中诱导表达.经亲和纯化得到凡纳滨对虾重组溶菌酶.抑菌活性检测表明重组溶菌酶对大肠杆菌TOP10有一定抑制作用.     

坛紫菜微卫星DNA序列的筛选

自坛紫菜(Porphyrahaitanensis)丝状体中提取的DNA,经Sau3AI限制性内切酶消化后,将300~900bp之间的DNA片段回收,并连接到经BamHI酶切并去磷酸化的pUC18载体上,最后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,构建坛紫菜小片段DNA质粒文库。选用pUC18质粒的通用引物进行PCR反应,对文库进一步筛选并检测插入片段的大小,在384个阳性克隆中,有278个含有大小合适的插入片段。经测序及序列分析,在103个克隆中获得172个微卫星序列,其中完美型107个,占62.2%,非完美型53个,占30.8%。(GC)n与(CG)n在坛紫菜DNA中非常丰富,分别占25%及17%,但重复频率相对较低。     

副溶血弧菌tdh基因在毕赤酵母中的表达及溶血活性检测

通过PCR技术从副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)基因组DNA上扩增耐热溶血素基因tdh,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建重组表达质粒pPICZaA-tdh,经限制性内切酶SacI线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)GS115,经PCR和测序鉴定耐热溶血素基因成功整合到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行tdh的表达,SDS-PAGE分析证明重组TDH(thermostable direct hemolysin,TDH)的分子质量约为23ku,经Western blotting鉴定VP抗体能与表达的TDH发生特异反应,说明tdh基因在毕赤酵母中的表达是准确的。溶血实验证明了表达的TDH具有溶血活性。本研究首次应用毕赤酵母表达耐热溶血素基因tdh,在培养基中获得分泌表达的耐热溶血素,为研究tdh基因的功能奠定了基础。     

条斑紫菜高纯度总DNA及其质粒状DNA的提取

提取条斑紫菜高纯度总DNA及其质粒状DNA的新方法。先用海螺酶处理紫菜叶状体制备细胞,然后用SDS-蛋白酶K裂解细胞提取总DNA,再用玻璃粉浆(glassmilk)对其纯化,经纯化后的总DNA能被EcoRI,Dral与HaeⅢ等限制酶完全酶切,并在酶切图谱上形成明显的DNA带型。当用异硫氰酸胍一十二烷基肌氨酸钠裂解紫菜细胞时,在总DNA提取物中直接发现有一条质粒状DNA带(2.3Kb),即建立了一种极简便的质粒状DNA提取方法。     

重组七鳃鳗PHB2蛋白的原核表达及纯化

为了研究PHB2蛋白的生物学活性及后续抗体的制备,作者以前期构建的p MD18-T-Lm-PHB2质粒为模板,PCR扩增Lm-PHB2基因全长CDS区,PCR产物经Hind III和Eco R I双酶切后连接至表达载体p ET-32a,构建重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2。将鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta Blue,经IPTG诱导表达后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blotting进行检测,利用镍柱亲和层析纯化得到纯度较高的目的蛋白r Lm-PHB2。结果表明,经PCR、双酶切和测序鉴定,所构建的重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2序列正确,表达产物存在于裂解菌液的上清和沉淀中,经SDS-PAGE和Western blotting证实在约47 ku处有目的蛋白r Lm-PHB2的表达条带。本研究构建了重组七鳃鳗(Lampetra japonica)PHB2蛋白的原核表达载体,并大量表达和纯化目的蛋白,为该蛋白后续的抗体制备及生物活性研究奠定了基础。     

海藻酸裂解酶基因在毕赤酵母中的表达及重组酶性质的初步研究

褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)是一种海藻酸降解菌.本实验采用PCR的方法,以褐球固氮菌基因组DNA为模板,克隆出约1.05 kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL.重组质粒线性化后用聚乙二醇(PEG)法导入毕赤酵母菌株GS115中,获得高效分泌表达海藻酸裂解酶的毕赤酵母工程菌株.用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到43 kDa的目的蛋白,酶活力可达1 400 U/cm3左右.经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃,并且在20~55℃,pH2.0~11.0具有较好的稳定性.另外,10 mmol/cm3的Cu2+,Fe2+,Co2+,Mn2+和Ca2+对酶有不同程度的抑制作用.     

哈维氏弧菌VIB645毒性相关质粒的结构解析

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是水产养殖动物的常见致病菌。前期研究发现,哈维氏弧菌致病性最强的菌株VIB645含有2个核苷酸序列非常相似的溶血素基因—vhhA和vhhB,分别位于染色体DNA和1个大小约为65.6 kb的质粒上(命名为pVH1)。本研究用碱裂解法提取该菌株的毒性相关质粒pVH1,利用多种限制性内切酶进行酶切,构建随机DNA文库并测序。合计测序97.63 kb,覆盖度为148.3%,鉴定出125个ORF(开放阅读框,>150 bp)。这些预测的ORF,根据其功能主要分为以下几类:(1)毒力相关基因,包括RTX毒素钙离子结合蛋白、转铁蛋白结合蛋白A前体、外膜粘附蛋白;(2)结合转运相关基因,包括TraC、-D-、F-、G-、H-、I-、K-、N-、U-、W、TrbB-、C;(3)转座相关基因;(4)其他功能基因,如甲基转移酶,DNA结合蛋白,DNA复制蛋白DnaC等;(5)未知基因。本研究结果对揭示哈维氏弧菌的致病机理具有重要意义。     

钝顶螺旋藻基因组质粒文库的构建及其在获得功能基因上的应用

利用改良的SDS法提取钝顶螺旋藻基因组DNA,经Sau3AI酶切,回收1～2kb大小的片段,与BamHI（Sau3AI的同尾酶）酶切并去磷酸化后的pBR322质粒载体相连接,转入大肠杆菌（Escherichia coli）Top10细胞,构建了螺旋藻基因组质粒文库。根据pBR322载体上多克隆位点两侧序列设计锚定引物,根据丝状蓝藻丝氨酸／苏氨酸激酶（STK）保守序列设计简并引物,以螺旋藻质粒文库为模板,“巢式”扩增出了STK基因部分序列。螺旋藻基因组质粒文库的构建为功能基因研究提供了极大方便。     

Construction of full length cDNA expression library of hepatopancreas of Penaeus monodon

mRNA was isolated from the hepatopancrease of shrimp Penaeus monodon with a PolyAT-tract System 1000 Kit. By using mRNA as template, double - strand cDNA with EcoR I/Xho I ends was synthesized by using a ZAP Express cDNA Synthesis Kit. The cDNA was inserted into the lambda ZAP Express vector predigested with EcoR I/Xho I, and the recombinant DNA was in vitro packaged into lambda phage with GigapackIII Gold packaging extracts. These recombinant phages were then used to transfect E. coli XL1 - Blue MRF', and finally a cDNA expression library was constructed. The library is 7.2 × 10~5 pfu in capacity and its recombination ratio is higher than 99 % . The size of the inserted cDNAs was determined by EcoR I/Xho I digestion of 9 phagemids prepared by in vivo excision of plaques selected randomly from amplified cDNA library . The longest inserted cDNA is about 1.6 kb in length. The complete sequence (about 1.2 kb) of actin cDNA was amplified from the library by PCR reveals that this library contains full-length     

Construction of white spot syndrome virus (WSSV) whole genome phage display library

A rebuilt vector pCANTAB 5 EE was obtained by inserting a 34 bp double-stranded oligonucleotide which contained a EcoRV recognition sequence into pCANTAB 5 E. White spot syndrome virus (WSSV) genome DNA was fragmented by sonication to isolate fragments mainly in the range of 0.8~2.0 kb, then the fragments were blunt-ended with T4 DNA polymerase and cloned into the EcoRV site of pCANTAB 5 EE. The primary recombinant clone of the library was 3.0×105. Colony PCR of random selected recombinants showed that the size of the inserts was 0.12~1.77 kb. After the whole library recombinant phages infected Escherichia coli HB2151 cells, the extracellular and periplasmic extracts were dropped on PVDF membranes to perform dot blot, using polyclonal mouse anti-VP24 serum, anti-WSV026 serum, anti-WSV063 serum, anti-WSV069 serum, anti-WSV112 serum, anti-WSV238 serum, anti-WSV303 serum and anti-VP26 serum as the primary antibody, respectively. The results showed that the display library could express the viral proteins.     

Cloning and sequence analysis of the self-fertilizing fish Rivulus marmoratus immediate early gene c-fos

We have cloned the proto-oncogene c-fos from a self-fertilizing fish Rivulus marmoratus (Cyprinodontiformes, Rivulidae) after screening of R. marmoratus λGEM-11 genomic DNA library, and sequenced over 12 kb including all exons, introns and the promoter region. The R. marmoratus c-fos gene consisted of one noncoding exon and four exons with high similarity to those of fugu and mammals. We sequenced ≈7 kb of the R. marmoratus c-fos gene promoter region to gain a better understanding of the molecular anatomy of the immediate response of this gene upon cellular damage. In the promoter region, R. marmoratus c-fos gene has seven xenobiotic response elements (XREs) and eight metal response elements (MREs) as well as two estradiol (E2), 4 NFκB, 2 CarG, 2 prolactin (PRL) motifs and one pit1 site, while the 3^′-UTR of this gene contains the estrogen response element (ERE). The seven XRE and eight MRE motifs raise the possibility of its regulation by exposure to environmental pollutants. In this paper, we discuss the gene structure of R. marmoratus c-fos gene and compare its promoter region with those of other organisms' c-fos genes. We propose its potential use in ecotoxicology.     

冬季大亚湾微表层浮游植物群落结构与DNA指纹的日变化

为了解海洋微表层浮游植物群落结构的日变化特征,于2013年12月3日清晨(6:00)、正午(12:00)、傍晚(18:00)采集了大亚湾海域3个站位微表层和次表层水样,利用PCR-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)和显微镜观察对浮游植物DNA指纹及群落结构进行了分析比较。共分析鉴定出浮游植物79种,微表层和次表层浮分别为61种、68种,清晨、正午和傍晚观察的种类数分别为49种、61种、51种;清晨、正午和傍晚的平均细胞密度分别为1.2×106、1.6×106、1.6×106个/L,微表层和次表层平均细胞密度分别为1.72×106和1.22×106个/L。硅藻占有绝对优势,硅藻的数量百分比均在98%以上,主要优势硅藻为角毛藻(Chaetoceros spp.)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、丹麦细柱藻(Leptocylindrus danicus)等。微表层对总浮游植物、硅藻及优势硅藻具有明显富集作用,其中对中肋骨条藻和丹麦细柱藻的富集系数分别为4.20和5.47,富集率均为100%。浮游植物DNA指纹条带也较丰富,每个样品DNA指纹条带数为12~28条,其中傍晚指纹条带最为丰富。由于优势种类对非优势种的屏蔽作用,DNA指纹条带数低于浮游植物种类数,但在剔除数量上小于0.5%的非优势种后,DNA指纹条带数与浮游植物种类数相近,说明PCR-DGGE技术对浮游植物检测灵敏度为优势度0.5%左右。     

深海沉积物宏基因组文库构建及淀粉酶筛选

深海环境通常具有高盐,高压,高/低温,无光照等特点,使得海洋微生物存在一套独特的生理代谢机制和分子细胞结构,然而迄今绝大部分深海微生物不能在实验室条件下被分离培养,深海微生物资源开发遇到很大挑战。本研究通过不依赖培养的方法研究海洋微生物的基因资源,构建了南海深海沉积物fosmid宏基因组文库,共获得约39 600个克隆,插入片段范围在24~45 kb之间,平均插入片段大小为33 kb,克隆片段的总库容达到1 320 Mb。通过功能筛选获得3个具有淀粉酶活性的克隆子,选取其中最适温度较低的amy7作为进一步研究对象。构建amy7插入片段的重组质粒文库,获得一个同样有淀粉酶活性的克隆子amy7-6。经测序,克隆子amy7-6含有3 291 bp插入片段,序列比对分析后发现其中一个大小为1 920 bp的ORF,其编码的蛋白质序列(AmyS)与各种来源的糖苷酶有着较高的相似性。     

一株副溶血弧菌噬菌体VPp1 的分离鉴定及裂解性能

为探究副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的生物防治方法,从水产品市场处污水中分离出一株副溶血弧菌噬菌体 VPp1.并借助噬菌斑形态、电镜、酶切等技术对其进行了分类鉴定,同时测定了其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线以研究其裂解性能.分类鉴定结果表明,其核酸是线型双链DNA,大小在15 kb 左右.具有一个正二十面体的头部,头部直径大约为44 nm,无尾,属盖噬菌体科(Tectivirus);裂解性能研究结果表明,其在双层平板上培养12 h 可形成中心清亮的噬菌斑,周围有大而明显的晕环.最佳感染复数为0.0001,潜伏期为10 min,裂解量为90.3,是符合条件的潜伏期短裂解量大的理想噬菌体,可用作进一步的应用.     

中国对虾6种组织cDNA文库的构建

以中国对虾血液、眼柄、卵巢、雌虾头胸部、雄虾头胸部和三倍体对虾头胸部组织为材料,采用异硫氰酸胍-酸酚法提取总RNA;用磁珠法纯化mRNA;用Uni ZAP cDNA合成试剂盒合成双链cDNA并进行修饰,将cDNA定向连接在UniZAP载体上;经Gigapack Gold Package包装试剂盒包装成为噬菌体颗粒,转染宿主XL1 Blue MRF’菌株细胞,形成初级文库.初级文库经转染进一步扩增,形成稳定的cDNA文库.6个文库的库容在0.2×106~1.3×106之间,重组率都超过90%.从各文库随机取出6~10个清晰的噬菌斑进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测,其插入片段长度为500~2500bp.由初步功能基因克隆获得阳性结果.多项指标表明,所构建的对虾cDNA文库质量较高,为进一步筛选目的基因、EST测序和制作基因芯片提供了有效的工具.     

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(RubisCO)(EC4.1.139)是光合细菌通过卡尔文循环固定二氧化碳的关键酶。本文采用PCR方法,从沼泽红假单胞菌株No.9中克隆到RubisCO基因(cbbM)序列(该序列已提交GenBank,登录号:GU061327)。采用同源建模法,建立了该RubisCO蛋白的三维结构模型,预测其活性位点。将cbbM基因亚克隆到表达载体pTV118N上,构建表达质粒pTV-CBBM,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株BL21(DE3)/pTV-CBBM,该菌株经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE检测。采用气相色谱法测定破菌上清中的RubisCO酶活。结果表明:①cbbM基因编码461个氨基酸,与沼泽红假单胞菌株DCP3和DH1的RubisCO蛋白序列相似性分别为98%和99%;②推测沼泽红假单胞菌No.9中RubisCO蛋白的活性中心由Asn112、Lys192、Asp194、Glu195、His288、Arg289、His322、Gly424、Ser369、Gly370和Gly394等氨基酸残基组成;③重组蛋白分子量约为50kDa左右,与预测相符;④破菌上清中的RubisCO酶比活高于原始菌株中的酶活,说明目的基因在大肠杆菌中得到了有效表达。