盐度突变对凡纳滨对虾渗透调节中血蓝蛋白和糖酵解影响的初步研究

实验室条件下测定盐度突变对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血淋巴渗透压、血蓝蛋白、血糖、己糖激酶(HK)以及丙酮酸激酶(PK)活力的影响。以蜕皮间期对虾为实验材料(初始湿体重为(2.485±0.303)g),设盐度30为对照组,4个不同的盐度突变幅度(为2、4、6、8)为处理组(用S2、S4、S6和S8表示),于降低盐度和恢复盐度至30的不同时间点采样,实验持续7d。结果表明:(1)凡纳滨对虾血淋巴渗透压会随盐度变化而变化,S4组对虾血淋巴含量在整个实验过程中处于较低水平;(2)随着盐度突变幅度的增加,血蓝蛋白含量与对照组呈现显著性差异(P<0.05)的采样点增多;(3)S4组对虾血糖含量整个实验过程中一直处于较低水平,而S6、S8组对虾血糖含量相对较高;(4)整个实验过程中,S4组对虾肝胰脏中HK活力处于较低水平,而S6与S8组对虾肝胰脏中HK活力处于较高水平;(5)S2、S4组对虾肝胰脏中PK活力与对照组没有显著性差异(P<0.05),而S6和S8组对虾肝胰脏PK活力在盐度突变后与对照组肝胰脏PK活力表现出显著性差异(P<0.05)。     

注射病原菌对凡纳滨对虾血蓝蛋白合成、酚氧化酶活力的影响

研究注射病原菌对凡纳滨对虾血蓝蛋白合成、酚氧化酶活力的影响。结果表明:注射哈维氏弧菌对凡纳滨对虾血淋巴中血蓝蛋白含量、肝胰脏内血蓝蛋白mRNA和p75、p77亚基表达以及血淋巴、血细胞、血蓝蛋白酚氧化酶活力的影响显著(P<0.05),而对照组无显著变化。血蓝蛋白含量和p75、p77亚基表达在0～24 h内呈峰值变化,其中血蓝蛋白含量在6 h内逐渐下降、且6 h时达到最低值,而p75、p77亚基表达在3 h内无明显变化,然后均表现为逐渐上升趋势,各指标在12 h时达到最大值,而且亚基表达与注射哈维氏弧菌浓度呈正相关,24 h后各指标趋于稳定,与对照组无显著差异。在注射哈维氏弧菌短时间内血蓝蛋白mRNA表达呈迅速上升趋势,其中注射6×106cells/mL处理组mRNA表达在6h内呈峰值变化,3 h时达到最大值,6～48 h内保持稳定,但仍明显高于对照组水平(P<0.05),而注射6×105cells/mL处理组mRNA表达量虽然增加,但只在6 h达到最大值时与对照组差异显著(P<0.05),其余时间均与对照组差异不显著。血淋巴、血细胞和血蓝蛋白酚氧化酶活力分别在12 h,24 h内呈峰值变化,其中血淋巴、血蓝蛋...     

溶解氧对凡纳滨对虾血淋巴血蓝蛋白、渗透压和鳃丝离子转运酶活力的影响

研究了环境溶解氧含量(D.O.=3.0,1.5mg/L)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血淋巴血蓝蛋白、总自由氨基酸含量、渗透压和鳃丝离子转运酶活力的影响。结果表明:溶解氧对凡纳滨对虾血淋巴血蓝蛋白、总自由氨基酸含量和渗透压、鳃丝Na+-K+-ATPase活力影响显著(P0.05)。而对照组(D.O.=5.5mg/L)无明显变化。低溶解氧实验组血蓝蛋白含量在36h内呈峰值变化,在12h时达最高值,在36～48h时低于对照组水平,且变化平稳,至72h时恢复至对照组水平;同时,实验组总自由氨基酸含量在24h时达到最大值,分别在48h后和72h时与对照组水平无明显差异;血淋巴渗透压和鳃丝Na+-K+-ATPase活力在0～48h内呈峰值变化,分别于6,12h时达到最小值和最大值,48h后恢复至对照水平,且与溶解氧变化值无关,而鳃丝V-ATPase活力在试验时间内无显著变化。而对照组(D.O=5.5±0.25mg/L)无明显变化。     

凡纳滨对虾ATF 2分子克隆及表达特征分析

激活转录因子-2(ATF-2)作为细胞内应激活化蛋白激酶下游效应分子,参与调控了生物体诸如细胞增殖、凋亡以及免疫炎症反应等许多细胞生物学过程.本研究首次从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中克隆得到了ATF-2基因全长编码序列,命名为Lv ATF-2.序列分析表明,Lv ATF-2基因开放阅读框长1 719 bp,可编码572个氨基酸.其编码的蛋白具有特征性的锌指结构和碱性亮氨酸拉链结构域,并且在N端具有两个保守的苏氨酸磷酸化位点(Thr71和Thr73).进一步的系统进化树分析显示,Lv ATF-2蛋白与脊椎动物及软体动物ATF-2蛋白聚为一簇,且与软体动物ATF-2蛋白亲缘关系更近.半定量RT-PCR结果显示,Lv ATF-2基因在所检测的各个组织中均有转录,但在鳃和肠道中转录量较高.此外Lv ATF-2基因在白斑综合症病毒(WSSV)感染早期转录水平显著下降,提示该基因与WSSV感染密切相关,可能参与了对虾应答病毒的免疫反应过程.本文通对Lv ATF-2基因的克隆与表达特征分析,为将来研究该基因在对虾免疫应答过程中的功能提供了依据.     

凡纳滨对虾高密度养殖实验

实验时间 4 0天 ,放苗密度 5 0 0尾 /m2 、10 0 0尾 /m2 。凡纳滨对虾初体长为 2 .5 88±0 .341cm ,初体重 (0 .2 39± 0 .0 86 ) g。养殖水体中放置筛绢隔断 ,在不换水的条件下 ,监测水体中无机磷、氨氮的变化趋势 ,初步实验高密度和分隔养殖的效果。结果表明 ,高、低密度氨氮、无机磷差异均为极显著 (P <0 .0 1) ;成活率、产量差异均为显著 (P <0 .0 5 )。高、低密度特定生长率 体重 差异不显著 (P >0 .0 5 )。观察到不同时间不同密度凡纳滨对虾对筛绢隔断的反应不同 ,表明对虾能利用隔断筛绢 ,从而有效提高养殖容量     

凡纳滨对虾CTSL基因与生长相关的SNP位点的特征

对3个凡纳滨对虾品系的CTSL基因进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）筛查,发现在生长指标差异的对虾中存在特征较为显著的7个SNP位点,其中3个属于外显子上的突变,4个属于内含子上的突变．B210对虾品系体重月平均生长量约为7．58g,体长月平均生长量约为2．31cm,B310对虾品系体重月平均生长量约为3．96g,体长月平均生长量约为1．48cm,HNIT对虾品系体重月平均生长量约为3．04g,体长月平均生长量约为2．18em．从市场价值来看,B210和B310品系比HNTr品系生长相对好些．进一步的PCR产物直接测序比较分析表明在生长指标较好的对虾品系,这7个SNP位点表现为纯合子;而在生长指标较差的对虾品系,在这7个SNP位点上31．6％表现为杂合子．虽然国内外有不少关于CTSL基因SNP位点的报道,但是与生长快慢的相关分析还鲜有报道,且这些SNP位点与前人发现的位点有所不同．本研究发现的CTSL基因的SNP位点与对虾生长快慢相关,将为凡纳滨对虾生长研究提供有用信息,从而有助于为对虾选育提供可靠的分子标记．     

凡纳滨对虾血淋巴、类淋巴细胞培养

以 ×L-15 培养基为基础,添加不同比例的胎牛血清和对虾肌肉提取液配制成不同的培养液,当 22×L-15培养基、胎牛血清和对虾肌肉提取液的比例分别为 60 %、20 %、20 %时,培养效果较好。培养液 pH 维持在7.0 ~ 7.2时血淋巴和类淋巴细胞生长最好,且类淋巴细胞迁出迅速。绝大部分血淋巴细胞贴壁迅速并伸展成多角样或披针形,一般存活 7 ~ 9 d,少部分呈悬浮状态的血淋巴细胞存活达 60 d 以上。培养中如未及时去除对虾血清,血淋巴细胞迅速衰老并死亡。类淋巴组织细胞 6 d可形成单层,迁出细胞主要有两种形态: 多角样和成纤维样,细胞可存活 16 d以上。     

盐度变化对携带白斑综合症病毒(WSSV)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的影响

研究盐度渐变和突变对WSSV在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体内增殖的影响。结果表明,盐度由起始盐度(23±1)往高盐度(32±1)和低盐度(14±1)突变在整个实验中对凡纳滨对虾的累积死亡率和对虾体内病毒增殖的影响显著(P0.05),先感染WSSV实验,高盐度、起始盐度、低盐度累积死亡率分别为(61.1±10.7)%、(48.9±1.9)%、(63.3±12.0)%,病毒含量分别为6.0×107、3.7×106、5.3×107 copy/g;后感染WSSV实验,分别为(75.6±3.8)%、(52.2±13.4)%、(63.3±3.3)%;病毒含量分别为5.7×107、2.3×106、2.8×107 copy/g。盐度渐变实验各组至24h对虾死亡率低于18.9%,48h出现死亡高峰,72—96h存在显著差异(P0.05),先感染WSSV实验,高盐度、起始盐度、低盐度最大死亡率分别为(75.6±5.1)%、(38.9±5.1)%、(69.3±6.9)%,病毒含量分别为7.6×107、5.3×106、2.4×106copy/g;后感染WSSV实验分别为(46.7±10)%、(45.6±18.9)%、(74.4±13.9)%;病毒含量分别为5.1×106、4.8×105、1.0×107 copy/g。因此盐度变化会影响对虾的抗病能力,可造成对虾体内WSSV快速增殖;对携带WSSV对虾,盐度变化会大大提高WSSV从潜伏感染转为急性感染的可能,盐度是引起WSSV从潜伏感染转为急性感染的关键影响因子之一。     

凡纳滨对虾G蛋白Gaq基因的克隆和功能鉴定

为了寻找并克隆凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）G蛋白α亚基,为研究对虾的生理调控提供理论基础,通过简并PCR和RACE反应获得目的基因的全长cDNA序列;用Blast,DNAstar和Genedoc软件对所得序列进行分析,确定所得序列为凡纳滨时虾G蛋白Gnq基因,命名为pvGnq。将该基因的编码序列克隆到表达载体,通过免疫共沉淀实验和胞内Ca^2＋,IP3浓度的测定鉴定该Gαq亚基的功能,发现该亚基的序列和功能与其他Gαq家族成员具有高度保守性。用Western blotting分析发现pvGαq在对虾身体各部位存在普遍分布,尤其在脑神经、眼柄、腮和颚片中有大量表达,在嗅觉器官触角也有适量分布。说明了pvGαq在对虾生命活动中的重要性,为研究对虾的生理调控奠定了理论基础。     

凡纳滨对虾对多巴胺免疫响应的研究

研究凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对多巴胺的免疫响应。结果表明:注射多巴胺对凡纳滨对虾血细胞数量、吞噬率和血淋巴酚氧化酶、溶菌、类α2-巨球蛋白活力影响显著(P<0.05),而对照组各免疫指标无明显变化。在实验时间内,多巴胺处理组各指标均呈峰值变化,3类血细胞、总血细胞数量和血淋巴类α2-巨球蛋白活力在3h时分别达到最小值和最大值,而血淋巴酚氧化酶、血细胞吞噬率和血淋巴溶菌活力于6h时分别达到最大值和最小值,同时各免疫指标变化与多巴胺的注射剂量具有明显的负、正相关性;其中颗粒细胞、半颗粒细胞数量和血淋巴酚氧化酶、类α2-巨球蛋白活力在12h后趋于稳定,透明细胞、总血细胞数量和吞噬率于18h后保持稳定,而溶菌活力在24h后保持平稳,稳定后各免疫指标均恢复至对照组水平。这说明多巴胺对凡纳滨对虾血细胞具有明显的调节作用,能在短时间内引起对虾免疫力的显著下降,并表现出明显的剂量效应性。     

光照对凡纳滨对虾幼体变态发育的影响

为了解光照对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体发育和存活率的影响,作者在研究中设定了4种单色光(红、黄、蓝、绿光)及不同光照强度(0、1 500、5 500、12 000 lx)进行实验并就光照对幼体产生的影响进行分析。实验表明:4种单色光对幼体发育变态时间和成活率都有较大影响。幼体从ZⅠ变态发育至仔虾P1,蓝光的幼体发育时间最长,为262.83 h,比对照组多28 h;黄光存活率最低,只有14.49%,比对照组低25.00%,差异显著(P0.05)。同时,凡纳滨对虾幼体在不同的发育阶段对不同光色的敏感度不同,红光和黄光只对溞状幼体变态有较明显的抑制作用,但对糠虾幼体的发育却有促进作用;蓝光和绿光对整个发育阶段都有影响。光照强度对幼体的存活和变态影响差异显著(P0.05)。幼体从ZⅠ发育至P1,12 000 lx光照下幼体变态发育耗时最长(257.33 h),存活率最低(1.63%)。在溞状幼体期,光照大于1 500 lx时,幼体的变态时间增加,存活率下降。糠虾幼体期可适应光照在5 500 lx以下的环境,而仔虾期则可适应120 000 lx的光照。建议根据不同发育阶段调整光照强度,当幼体在ZⅠ时,光强应控制在1 500 lx以下,之后可逐渐增强。本实验结果可为凡纳滨对虾育苗期间的光照管理提供基础数据和理论依据。     

盐度胁迫下凡纳滨对虾体内虾青素在着色与抗氧化的资源权衡

工厂化养殖中产生的环境压力,会导致对虾应激反应的发生以及体色的减弱。为了探究胁迫下对虾体内虾青素的消耗规律以及对虾的着色与抗氧化之间的关联性,本研究通过虾青素强化后盐度胁迫的方法进行了实验。结果表明,与强化前相比,虾青素强化后植物源(夏侧金盏花)虾青素(d-AST)、合成虾青素(p-AST)处理的对虾肝胰腺中虾青素含量分别增加48.0%和17.5%;虾壳中分别增加42.8%和45.2%。富含酯化型虾青素的d-AST在肝胰腺中具有更高的沉积量;而由游离虾青素组成的p-AST在虾壳中具有更高的沉积量,不同形式的虾青素在不同组织中的沉积具有一定的偏好性。两个处理组对虾的体色明显增强。与盐度胁迫前相比,胁迫后d-AST、p-AST肝胰腺中虾青素含量分别减少了15.1%和5.7%,对照组(Ctrl)含量无变化;虾壳中分别减少了17.8%、52.9%和14.3%,各组对虾的体色均显著减弱。胁迫24 h检测到编码虾青素转运蛋白β-1,3-葡聚糖结合蛋白(βGBP-HDL)基因的显著上调表达,可能与虾壳中虾青素的减少有关。随着胁迫的进行,与对照组相比,两个处理组的抗氧化基因均呈现上调表达的趋势;各组抗氧化能力呈现先上升后下降的趋势,并在48 h时达到最大值,d-AST、p-AST分别为对照组的1.35和1.30倍。据此,作者推测对虾体内的虾青素是按照资源权衡的原则在着色和抗氧化功能中进行分配的,在遭受环境胁迫时,对虾会优先将用于着色部分的虾青素(虾壳中)转运至肝胰腺中参与抗氧化,进而表现为体色的减弱和抗氧化能力的上升。     

凡纳滨对虾P23蛋白基因的筛选、表达和生物信息学分析

克隆凡纳滨对虾极端体重个体的组织差异表达基因P23基因并进行生物信息学分析, 为进一步研究该基因的功能以及凡纳滨对虾的分子选育等研究提供信息。以凡纳滨对虾雌虾极端体重个体腹部肌肉为实验材料, 利用抑制消减杂交(SSH)技术构建极大体重雌性个体和极小体重雌性个体腹部肌肉组织正反向消减cDNA文库:正库(以极大体重个体为试验组, 以极小体重个体为驱动组, L-S)和反库(以极小体重个体为试验组, 以极大体重个体为驱动组, S-L)消减cDNA文库, 并采用实时定量技术分析P23基因的组织表达规律, 利用生物信息学对其功能和结构进行预测。以β-actin为看家基因检测两个文库的消减效率分别为210和25, 实时定量技术分析结果表明P23基因在体重的调节中起上调作用。P23基因编码区序列全长495bp, 编码165个氨基酸, GenBank登录号:JF806619。生物信息学分析发现P23蛋白部分序列含有强疏水性, 无跨膜螺旋结构, 两种信号肽预测都显示P23含有信号肽。     

基于转录组数据的凡纳滨对虾微卫星标记开发

对虾遗传多样性和育种研究需要大量的分子标记。作者利用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)转录组测序数据,采用MISA软件进行微卫星序列挖掘,共获得14 767条微卫星序列。统计发现在凡纳滨对虾中微卫星出现的频率为16.76%;在所有的微卫星序列中,2碱基微卫星最多,占59.53%;其次是3碱基微卫星,占35.78%。随机选取其中74条序列设计引物,通过DNA混池扩增和分型的方法进行微卫星标记的开发,PCR扩增的显示有54对(72.97%)能扩增出清晰的目的条带,进一步分型的结果显示27条(36.49%)微卫星显示出多态性,从这些多态性的微卫星位点中选择11个位点在"科海1号"种质库材料中进行个体分型,结果显示在该群体中微卫星标记的等位基因数目为2~11个不等,期望杂合度值为0.256~0.858,观察杂合度为0.213~0.875,多态性信息含量为0.221~0.830,在11个位点中有4个位点显著偏离HWE(P0.05)。本研究结果为后续使用微卫星标记进行对虾遗传学研究,促进对虾的遗传选育和种质资源保护提供了重要基础。     

生物饲料对凡纳滨对虾生长、免疫及消化功能的影响

通过8周的生产性养殖试验,研究了以生物酶解小肽、益生菌发酵植物蛋白、破壁酵母蛋白等配制的生物饲料对凡纳滨对虾生长、部分免疫酶活性及消化功能的影响。结果表明,生物饲料组平均产量为1242.5kg/ha,高于普通饲料组平均产量1180.5kg/ha,具有更优的生长性能;此外生物饲料组的对虾成活率为91.5%,高于对照组的86.2%;生物饲料的饲料系数为0.96,而普通饲料为1.01;喂养15~30 d后,生物饲料组对虾的SOD、血清总蛋白含量及溶菌活性较普通饲料组有显著提高;抑菌活性未发现显著差异。生物饲料组对虾总蛋白酶活性有显著提高;生物饲料组水体中的NH4-N、NO2-N等指标略低于普通饲料组,但两者无显著差异。     

二溴海因和碳水化合物水平对凡纳滨对虾生长和免疫的影响

研究了低盐度条件下,二溴海因和碳水化合物水平对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长和免疫的影响,共3个实验。实验1研究了二溴海因对凡纳滨对虾存活的影响,发现在0.2、5和20三个盐度水平,随着二溴海因浓度的升高,凡纳滨对虾存活率呈下降趋势;二溴海因对凡纳滨对虾的安全浓度随盐度的增加呈上升趋势。实验2和实验3研究了盐度、二溴海因浓度和饲料中碳水化合物水平对凡纳滨对虾生长和免疫的影响,结果表明:在低盐度养殖条件下,凡纳滨对虾长期生活于二溴海因环境中,可导致对虾处于应激状态,需要消耗体内较多的免疫因子,血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性降低,生长速度下降,而在饲料中适量增加碳水化合物不仅可促进对虾生长又可起到饲料蛋白质节约作用。     

凡纳滨对虾幼体不同生长发育时期应答氨氮胁迫的敏感性研究

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界上最重要的对虾养殖品种之一。为比较凡纳滨对虾不同生长发育时期应答氨氮胁迫的敏感性差异,作者对其不同生长发育时期24 h半数致死浓度(LC_(50))进行测定,并分析其胁迫效应。结果表明,24 h LC_(50)值在虾的不同生长发育时期差异显著(P0.05),不同时期凡纳滨对虾的LC90与LC_(50)变化趋势相同。在溞状幼体Ⅱ期(Z2)LC_(50)值最低,为17.811 mg/L,在仔虾第V期(P5)时,LC_(50)值最高,为44.808 mg/L。根据LC_(50)和LC90的变化趋势可以看出,仔虾比幼体期的耐受性强。本试验结果不仅为凡纳滨对虾不同生长发育时期的苗种培育提供了重要的基础数据,而且为凡纳滨对虾耐氨氮品系选育提供了重要指导。     

基于AMMI模型分析凡纳滨对虾选育家系基因型与环境互作效应

为选育出具有广适性和适应某一特定环境的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)家系,实验采用巢式交配设计建立了凡纳滨对虾选育家系,并从中选出7个体质量性状优良的家系进行主效可加互作可乘模型(AMMI)分析,得出7个凡纳滨对虾选育家系体质量基因型与环境互作效应。结果表明,凡纳滨对虾7个家系的基因型与环境互作效应(G×E)达极显著水平(P<0.01);G×E效应平方和占总平方和的20.608%,家系效应平方和占总平方和的12.814%,环境效应平方和占总平方和的64.289%,说明家系体质量差异受环境效应影响显著,此外环境与基因型互作效应对体质量也存在影响,且影响力大于家系效应;基于双标图AMMI模型分析和稳定性参数分析,家系G2产量较高,为12.90 g,但G2对环境的选择能力以及依赖性较强,不适合广泛推广;G6产量为9.00 g,与G2相比虽然产量稍低,但其家系稳定性较高,对环境选择能力以及依赖性较弱,适合在多种类型环境下养殖,因此G6为中产、稳定、广适应性的家系,其基因型适合新品系的选育及推广;通过AMMI模型双标图功能形态分析,G11在E1环境中体质量最高产,适合与在E1环境下推广;G2在E2环境中最高产,适合在E2环境下推广;G5在E3环境中体质量最高产,适于在E3环境下推广。     

3个凡纳滨对虾引进群体对温度和盐度耐受力的配合力分析

为筛选凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)人工选育亲本的最佳组合方式,作者采用完全双列杂交交配设计,对3个凡纳滨对虾引进群体建立了9个自繁和杂交组合群体,研究了亲本和子代对温度和盐度的耐受力。研究结果表明:9个群体对温度、盐度胁迫的耐受性均存在显著差异(P0.05),耐高温性状中亲优势(MP)和超亲优势(BP)的变化范围是–17.71%~52.95%和–30.07%~37.96%,其中UM和UH群体的杂交中亲优势均值最高,达到38.61%;耐低温性状MP和BP的变化范围是–22.04%~77.03%和–33.93%~31.17%,其中UM和TZ群体的杂交中亲优势均值最高,为60.85%;耐高盐性状MP和BP的变化范围是–39.41%~76.96%和–42.12%~19.07%,其中UM和TZ群体的杂交中亲优势均值最高;耐低盐性状MP和BP的变化范围是–44.89%~37.05%和–45.68%~28.21%,而UM和TZ群体的杂交中亲优势均值最低,仅为–9.855%;杂交后代耐受性的表现受到父本、母本一般配合力以及杂交组合特殊配合力共同影响,其中UM群体耐高低温性状的一般配合力较高,而TZ群体耐高低盐性状的一般配合力较高;特殊配合力分析表明,UM×UH为强优势组合,存在较强的抗逆非加性效应,杂交优势明显。本研究从数量遗传水平评估选育群体对温盐的耐受性能,可为进一步家系选育提供候选材料。     

Toxicity of metal mixtures to the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei postlarvae

According to the literature, the safe level of a toxic substance for any given organism may be calculated from its median lethal concentration multiplied by a suitable application factor (AF: usually 0.1 and 0.01). The medial lethal concentrations for Litopenaeus vannamei postlarvae exposed to the mixtures in equitoxic proportions of Cd–Hg, Hg–Zn and Hg–Pb were close to one order of magnitude lower than the values calculated from individual toxicity tests, indicating a synergistic effect, while the mixture Cd–Zn showed an antagonistic effect. Exposure to the mixture of Cu, Fe, Mn, Zn, Cd, Hg and Pb caused 63.3% and 100% mortality after 21 and 13 days for 0.05 and 0.1 AF, showing that environmental safe concentrations of toxicants should not be calculated from individual toxicity tests.