微卫星标记在大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)家系系谱印证中的应用研究

用8个微卫星标记对大菱鲆7个人工选育家系进行了系谱鉴别和遗传多样性研究。8个微卫星位点的平均多态信息含量为0.6721,平均杂合度为0.7206。8个微卫星位点在7个家系分析中,共检测到40个等位基因,每个位点的等位基因数在38个之间,每个位点平均有5个等位基因。根据已知亲本及子代基因型,成功的推断出了7个家系中缺失亲本的基因型。在双亲未知的情况下8个微卫星位点累积排除概率是97.07%,已知单亲时累积排除概率达99.63%。用UPG-MA法对7个家系的137个子代个体进行了聚类分析,90.5%同一家系的子代个体能完全聚类到一起,分类结果与系谱来源基本一致。微卫星标记可以为大菱鲆混养家系进行亲权鉴定和系谱构建提供技术支持。     

大菱鲆与耐高温性状相关的微卫星标记筛选

采用微卫星分子标记(SSR)技术分析大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)耐高温相关特性,为耐高温大菱鲆的分子辅助育种提供合适的分子标记.将大菱鲆经过高温实验处理,区分为耐高温组与高温敏感组,用于实验分析.采用Salah.M法抽提大菱鲆肌肉组织的DNA,根据已知的30个大菱鲆微卫星位点的侧翼保守序列设计引物,进行微卫星引物PCR(SSR-PCR)扩增.对PCR扩增出的差异条带进行个体统计,最后进行微卫星位点与耐高温性状的相关性分析.结果表明,有1个微卫星位点与大菱鲆耐高温性状存在一定的负相关性;有3个微卫星位点与大菱鲆耐高温性状存在正相关性,其中位点Sma-USC27 286 bp的等位基因片段与耐高温性状的正相关性极显著,相关系数达到0.383(P＜0.01),其余2个位点为一般显著性相关.微卫星位点Sma-USC27所扩增出的差异等位基因片段可作为分子标记指导耐高温大菱鲆的辅助育种.     

基于核酸适配体的差减荧光法检测鳗弧菌(Vibrio anguillarum)

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)可感染鳗鲡、虹鳟和大菱鲆等多种水产动物,是水产养殖中的一种重要病原菌,对其进行快速检测是病害防控的前提和基础。利用鳗弧菌与其核酸适配体之间有较强的亲和特异性,首次建立了一种基于核酸适配体的可定量检测鳗弧菌的差减荧光法。该方法对鳗弧菌有较好的特异性,对鳗弧菌的检测荧光值是其他菌(溶藻弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌、变形假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和大肠杆菌)的4～11倍,对鳗弧菌的最低检测限为10²CFU/mL,可用于10²～10⁸CFU/mL的范围内的定量检测。通过对不同盐度海水和鱼体组织样品进行加标回收检测,结果表明,回收率和相对标准偏差等指标均符合相应的标准,说明该检测方法可用于海水样品和水产动物组织中鳗弧菌的检测。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长性状相关的微卫星标记筛选

采用分群分离分析法,以同一批受精卵孵化的同池养殖大菱鲆生长性状发生分离的群体为材料,进行微卫星DNA遗传分析,以揭示影响大菱鲆生长发育速度方面的遗传信息。30个多态性微卫星位点对生长高值组(F组)和生长低值组(S组)各10个样本建立的DNA混合池进行扩增时,在两池间出现了7个差异片段。通过对两组大菱鲆个体PCR扩增出的差异条带进行统计,分析微卫星位点与大菱鲆生长性状的相关性。结果表明,有1个微卫星位点(SmaC10)在355bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在一定的负相关性;有4个微卫星位点(SmaC02、SmaC06、SmaC09、B11-I12/6/3)分别在258bp、182bp、226bp、175bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在正相关性,其中位点Smac09在226bp的等位基因片段与生长性状的正相关性极显著,相关系数达到0.354。位点SmaC09所扩增出的等位基因片段可作为具有良好生长特性人工选育群体的分子标记,指导大菱鲆的辅助育种。     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)侵染对青蛤(Cyclina sinensis)磷酸酶活性的影响

对500个成体青蛤分别用鳗弧菌和生理盐水注射,在感染后3h、6h、12h、24h和36h分别取不同处理组的肝胰脏、鳃和闭壳肌组织,测定上述样品的碱性磷酸酶(ALP)及酸性磷酸酶(ACP)活性,分析鳗弧菌对青蛤体内免疫相关酶活性的影响。结果表明,鳗弧菌感染组的ALP与ACP活性从高到低依次为肝胰脏鳃闭壳肌,其中青蛤肝胰脏和鳃组织中ALP和ACP活性均有显著升高的趋势,并且在12h时达到最高,与对照组差异显著(P0.05),随后呈现下降趋势。而青蛤闭壳肌组织中侵染组ALP和ACP活性与对照组之间没有显著差异(P0.05)。鳗弧菌对青蛤的磷酸酶活性影响较大,对其免疫防御系统有明显的刺激作用。     

基于核酸适配体的SYBR Green Ⅰ qPCR法检测鳗弧菌(Vibrio anguillarum)

鳗弧菌（Vibrio anguillarum）可感染鲈鱼、鳗鲡等多种水产养殖动物,是水产养殖中的重要病原菌,对其进行快速检测是病害防控的基础。利用鳗弧菌与其核酸适配体间较强的亲和特异性,通过核酸适配体来识别、结合鳗弧菌,然后以结合的核酸适配体为模板,进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR（qPCR）扩增,通过Ct值来定量检测鳗弧菌的浓度,从而建立了鳗弧菌的适配体-qPCR定量检测方法。从特异性、标准曲线、灵敏度、重复性和应用效果对该方法进行分析,表明该方法具有很强的特异性,能特异性地扩增鳗弧菌,且对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、变形假单胞菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌均无扩增;在10～3～10¹¹ CFU/L的检测范围内有较好的线性关系,可用于鳗弧菌的定量检测;同时,该方法有较高的灵敏度和稳定性,其最低检测限为10～3 CFU/L,组内和组间变异系数分别小于0.17%和1.98%;最后采用该方法对鱼体组织样品进行了应用检测,证明了该方法具有较好的可行性和应用性,可用于水产品或食品中鳗弧菌的定量检测。     

青蛤(Cyclina sinensis)IKK基因的克隆及其在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达分析

利用构建的青蛤(Cyclina sinensis)转录组文库,筛选到青蛤IKK基因的类似序列。经设计引物克隆比对后确认为CsIKK基因。利用生物信息学软件在线对该基因进行结构分析。采用PCR技术克隆基因,并使用实时荧光定量PCR技术克隆得到CsIKK基因在青蛤五个不同组织中的表达情况及在鳗弧菌(Vibrioanguillarum)的刺激下IKK基因在青蛤血淋巴中的时序性表达情况。综合结果得到, CsIKK基因序列开放阅读框长2298bp,编码765个氨基酸。IKK基因在青蛤的血淋巴、外套膜、闭壳肌、肝脏、性腺和鳃六个组织中均表达,在血淋巴中表达量最高。青蛤IKK基因在鳗弧菌胁迫下表达量在6h时达到最大值,与对照组相比差异极显著(P0.01),表明该基因所指导的蛋白是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)细菌性疾病的研究现状

由弧菌科的细菌和其引发的细菌性疾病被认为是目前大菱鲆养殖业的主要危害之一。本文详细介绍了弧菌属的病原及一些典型的发病症状。对其他科属的一些病原菌，也作了相应描述，但它们的致病力相对弧菌科的病原菌致病力要弱，危害范围要小。最后简单介绍了目前细菌病几种可行的防治方法和思路。     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)侵染对青蛤(Cyclina sinensis)髓样分化因子88基因表达的影响

经转录组测序后筛选并克隆得到青蛤(Cyclina sinensis)髓样分化因子88(myeloid differenttiation factor 88,My D88)的c DNA序列。在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)胁迫下,采用荧光定量PCR法分析了My D88基因在青蛤体内的表达过程。结果显示,青蛤My D88基因的开放阅读框为1521bp,编码506个氨基酸,分子量约为57.14k Da,氨基酸N段存在DEATH结构域,C段存在TIR结构域(Toll/Interleukin-1 receptor domain)。My D88基因在青蛤血淋巴、肝脏、外套膜、鳃和闭壳肌等组织中普遍表达,但在血淋巴中表达量最高,与其它组织出现显著性差异(P0.05)。通过检测鳗弧菌刺激下My D88基因在青蛤血淋巴中的表达值,发现My D88基因在24h开始升高,48h达到最大值,约为对照组的10倍,实验组与对照组及空白组均出现了极显著性差异(P0.01);研究结果表明,该基因在软体动物的免疫应答反应中对革兰氏阴性菌有识别作用。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)浸泡免疫鳗弧菌(Vibrio anguillarum)灭活疫苗后11种免疫相关基因的表达变化

制备鳗弧菌(Vibrio anguillarum)全菌灭活疫苗浸泡免疫牙鲆(Paralichthys olivaceus),分别于免疫后0h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、7d、14d取脾、头肾、鳃组织,提取m RNA,应用实时荧光定量PCR法检测3种组织中Toll-like受体(TLR)2、TLR5M、髓样分化因子My D88、核转录因子(NF)-κB、白介素(IL)-6、干扰素(IFN)γ、趋化因子CXC、补体C3、热休克蛋白(HSP)70、T细胞表面分子CD4、自然杀伤细胞增强因子(NKEF)十一种免疫相关基因的表达变化。结果显示,免疫后除TLR5M、NKEF以外其它九种基因表达均显著上调,表达高峰出现在24—72h,基因表达量最高值是对照组的2—12倍;TLR5M的表达量与对照组无显著差异;NKEF基因的表达量出现显著下调趋势,下调峰值出现在24h,为对照组的0.49倍。在脾脏和肾脏中,NF-κB和CD4基因的表达峰值高于鳃;在脾脏和鳃中,IL-6、HSP70和NKEF基因的表达峰值均高于头肾;IFNγ、CXC、C3和My D88在三个组织中的表达峰值差异不大。在三个组织中每个基因表达峰值出现的时间基本一致。结果表明,浸泡免疫后,IL-6和HSP70基因在三个组织中的表达变化迅速、且丰度高,可以作为疫苗浸泡免疫后的效果评价指标;除肾和脾主要的免疫器官外,鳃也是浸泡免疫后重要的检测组织。研究结果为浸泡免疫疫苗效果的评价积累了数据。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)病原鳗利斯顿氏菌的鉴定

采用表观分类学及分子生物学方法,对从大菱鲆细菌性败血感染症的病(死)鱼中分离到的相应病原菌,进行了形态特征、理化特性等较系统的鉴定及代表菌株DNA中G Cmol%的测定;同时,择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明,所检30株菌均为利斯顿氏菌属(ListonellaMacDonellandColwell1986)的鳗利斯顿氏菌[L·anguillarum(Bergeman1909)MacDonellandColwell1986],择S010610-1株、S010610-3株及S010623-1株作为代表菌株进行的16SrRNA基因序列测定,不包括引物结合区,所扩增的16SrRNA基因序列长度,S010610-1株为1466bp(GenBank登录号:AY963630)、S010610-3株为1416bp(GenBank登录号:AY963631)、S010623-1株为1424bp(GenBank登录号:AY963632),与GenBank数据库中弧菌属细菌的同源性在97%—99%。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)微卫星序列的开发与分析

采用FIASCO (Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats)法和标记初步筛选法, 进行了大菱鲆(Scophthalmus maximus)微卫星标记开发的研究, 分析了大菱鲆基因组中微卫星DNA序列的特征, 并进行了拟作图标记的初步筛选。结果表明, FIASCO法的富集效率为78.56%, 二次筛选出655个阳性克隆, 测序后经分析有469条含有微卫星位点的单一序列, 共得到597个微卫星位点。其中完美型占51.76%, 非完美型占34.67%, 复合型占13.57%; 核心序列的重复次数在3—96次之间, 平均重复数为13.39次; 重复单元类别最多的是(CA/GT)n, 占77.6%。利用Primer Premier 5.0共设计413对引物, 其中有360对能够得到稳定表达的产物; 再经标记初筛试验得知, 183对引物(50.8%)的PCR产物有多态性, 其中110个微卫星位点(30.6%)符合遗传连锁图谱作图标准。     

大菱鲆四倍体的人工诱导研究

大菱鲆(Scophthalmus maximus)为我国北方沿海主要的海水经济品种,其四倍体的获得对种质改良和三倍体的规模化生产具有重要的价值。到目前为止,有关大菱鲆四倍体的人工诱导尚未见报道。本文采用静水压抑制受精卵卵裂的方法,进行了四倍体诱导条件的摸索。结果显示,在14.8—15.5?C培育时,在卵裂前15min用67.5MPa处理6min可获得较好的诱导效果,其孵化率最高可达72%,染色体制片计数法计算其原肠胚期诱导率可达70%,初孵仔鱼流仪检测诱导率最高为73%。诱导组胚胎发育与对照组在形态学上基本一致,仅发育孵化时间比对照组略有滞后。     

大菱鲆（Scophthalmus maximus）胚胎发育的形态学和组织学研究

采用显微镜和连续切片技术,观察了大菱鲆胚胎发育阶段的形态学和组织学特征。结果表明,大菱鲆胚胎发育主要经历6个时期;在14℃,胚体经108h即可孵化出膜。胚胎在64细胞期出现纬裂,分裂球分化为外层的包被层和内部的深层细胞;多细胞期形成卵黄合胞体层;低囊胚期形成囊胚腔。受精后26h30min胚盾出现。胚盘下包65%时,头突...     

大菱鲆（Scophthalmus maximus）大规模家系选育优良家系的生长发育规律

运用Logistic、Gompertz和von Bertalanffy3种生长模型分别对大菱鲆的5个优良家系E♂1×E♀2、F♂4×N♀3、F♂2×E♀4、E♂2×F♀1、F♂1×F♀4及对照组群体的生长曲线进行了拟合和比较分析。结果表明,家系E♂1×E♀2、F♂2×E♀4和E♂2×F♀1的最优拟合模型为Gompert...     

超低温保存后大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子的生理活性及其超微结构研究

采用计算机辅助分析和电子显微镜方法, 对大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子生理活性(运动率、运动速度和寿命)和超微结构进行观察, 研究其精子经超低温保存后质量变化情况, 得到了新鲜精子的路径速度[(101.91±9.30)?m/s]、运动率(88.30%±2.62%)和寿命[(368.00±111.50)h], 以及冷冻精子的路径速度[(76.78±8.49)?m/s]、运动率(65.60%±4.76%)和寿命[(120.00±12.00)h]。结果表明, 新鲜精子的生理特性好于冷冻精子。同时通过电镜去进行超微结构分析, 发现大菱鲆精子经过超低温保存后, 40%—60%的精子基本保持正常的形态结构, 其余精子遭受不同程度的机械损伤。其中膜损伤为主要损伤, 损伤精子中60%—70%带有膜损伤。推测大菱鲆精子在冷冻解冻过程中遭受到的机械损伤可能是导致冻精生理活性显著下降的主要原因。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)耐高温品系选育及耐温性能评估

采用家系选育方法,进行了大菱鲆耐高温性状选育研究,对两代家系耐温性能进行测定,并利用bCOX回归分析了各家系的耐温性优势比。结果表明:各家系耐温性差异达到了显著水平(P<0.05),并且耐高温能力的优势比也存在显著差异,这反映出在大菱鲆耐高温选育中家系选择的高效性;经过一代选育,获得4个耐高温家系,并据此构建选育二代家系。耐温性能评估,选育二代比一代有显著提高,在27℃高温条件下,选育一代的平均死亡率为49%,选育二代的平均死亡率为10.26%;28℃条件下,选育二代耐高温子代的平均死亡率为32.83%,对照组的平均死亡率为88.9%;经过筛选后,选育二代的耐温性比选育一代提高了1—2℃左右。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)四个不同地理群体数量形态特征比较

采用聚类分析、单因子方差分析和主成分分析方法,对4个不同地理群体大菱鲆进行了12项形态性状的测定,比较了4个群体的外部形态特征。聚类分析结果表明,4种大菱鲆群体中,丹麦和挪威之间及英国和法国之间的差异较小,丹麦、挪威和英国、法国之间的差异较大。方差分析多重比较结果表明,4个群体在部分形态特征上表现出明显差异,其中,英国和法国群体、挪威和丹麦群体之间形态特征差异显著指标较少,丹麦群体和英国群体、丹麦群体和法国群体、挪成群体和英国群体、挪威群体和法国群体之间差异显著指标较多。主成分分析构建了3个反映形态特征信息的综合性指标——主成分1、主成分2和主成分3,三者的贡献率分别为38.663%、14.117%和8.976%,三个主成分的累积贡献率为61.756%.分析结果显示,英国和法国群体、挪威和丹麦群体之间形态差异不显著,丹麦群体和英国群体、丹麦群体和法国群体、挪威群体和英国群体、挪威群体和法国群体之间形态差异显著,且差异主要来源于主成分1,而主成分1主要由经方差分析多重比较差异显著的指标组成,显然,主成分分析与聚类分析、方差分析的结论基本上是类似的,它们从不同的角度反映了群体间的形态学差异.     

大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)胚胎及仔稚幼鱼发育研究

采用体视镜对大菱鲆胚胎期发育全过程进行连续观察，研究其胚胎正常发育特征，并继续对胚后期的仔、、幼鱼发育阶段采用测量、手绘、照相等方法进行形态学与生态学研究。结果表明，大菱鲆胚胎发育与其他硬骨鱼浮性卵鱼类基本相似，属端黄卵，盘状分裂。在水温13℃条件下，约经116h完成孵化。胚后仔、稚、幼鱼阶段，体背部色素逐步增深，鱼体逐渐由透明变为不透明，由两介对称变为不对称。3日龄仔鱼开口；1－9日龄仔鱼，体色呈红色，称之为“红苗”；10－24日龄，黑色素增多，称之为“黑苗”；25日龄以上，体披大量花状色素，称之为“花苗”，由此鱼体变宽，右眼开始上升；30日龄苗，右眼已上移至头顶背部；35－38日龄苗，右眼已完全转移至左侧，变态完成而达鲆鲽类所特有的形态、生态和生理状态；60－90日龄苗，背部正常体色为沙色（sand color)，全长已达50-60mm，可以作为商品苗出售。上述研究资料对于大菱鲆生产性育苗工艺的建立和操作管理均具有非常重要的意义。