基于马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞全长转录组数据补体样组分的鉴定与分析

补体系统作为先天免疫的重要组成部分,是一种复杂的限制性蛋白水解系统,其在免疫系统中发挥着重要的防御作用。为分析马氏珠母贝补体系统的组成及作用机制,使用血细胞样品进行了全长转录组测序建库、基因比对、功能注释,共挖掘到212个潜在补体样组分相关基因。补体样组分基因经同源性比对和结构域检测分析表明,检索到的基因分别编码89个含C1q结构域蛋白、57个C型凝集素蛋白、33个纤维胶凝蛋白、11个纤维蛋白原相关蛋白、8个甘露糖结合型凝集素关联丝氨酸蛋白酶、2个含硫酯蛋白(1个C3分子,1个TEP分子)、1个补体受体、2个补体因子、9个丝氨酸蛋白酶。随机选择12个补体相关基因,使用溶藻弧菌刺激前后的血细胞样品进行实时定量PCR检测其表达水平,结果显示C1q(C1q domain containing protein)、C-lectin、MBL(mannose-binding lectin)、ficolin、MASP(mannan-binding lectin serine protease)等基因均呈现出显著差异表达,表明马氏珠母贝补体系统是一个复杂的多组分效应系统,且可能通过凝集素途径或类似于凝集素途径激活补体系统的免疫作用。研究结果为进一步验证马氏珠母贝中存在的原始补体系统提供了分子生物学证据,同时对深入了解马氏珠母贝免疫防御机制,丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容也具有重要理论意义。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞转录组测序数据中SNP标记的开发及其功能注释分析

本文基于马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞比较转录组学数据进行单核苷酸多态性标记(SNP)的开发和关联基因的功能注释分析,以期为SNP标记的利用提供有效信息。在转录组测序获得的67632条SNP-unigenes中共获得962995个SNP位点,位点平均发生频率约为1个SNP/100bp;转换SNP数目与颠换SNP数目比值约为0.5,与理论比率相符;而6种单核苷酸变异类型中,以A/T颠换SNP最多。SNP-unigene功能注释分析表明,30376条unigenes(44.91%)匹配到GO分类条目;18150条unigenes(26.84%)获得COG注释信息,并以"一般功能预测"类最多;10981条unigenes(16.24%)富集到32条KEGG子集,其中以"信号转导"子集中富集的SNP-unigene最多。进一步富集分析显示629个SNP-unigenes注释到"Platelet activation"等多条免疫防御相关信号通路中;同时,根据SNP位点分布情况筛选到123个溶藻弧菌感染前、后转录组中特异分布的免疫防御相关候选SNP位点。基于标准化的基因表达水平分析,在17个差异表达免疫防御相关基因中共检测到1594个SNP位点。     

合浦珠母贝精子激活机制的初步研究

分别用氨海水、不同盐度的氨海水、Na＋,K＋,Ca2＋,Mg2＋的氯化物及Na＋,K＋的硝酸盐和NH4Cl,NH4NO3,（NH4）2SO4和（NH4）2CO4为激活剂,对人工解剖获得的合浦珠母贝Pinctada martensii精子进行激活。实验结果表明,合浦珠母贝精子的细胞膜离子通道为闸门控制类型。其激活途径主要是通过NH4＋或HCG类激素开启该闸门,发生Na＋和Cl－的交换,使精子细胞获得或释放能量而激活。pH太低则会影响它们的激活作用。     

合浦珠母贝精子激活机制的初步研究

分别用氨海水、不同盐度的氨海水、Na~ ,K~ ,Ca~2 ,Mg~(2 )的氯化物及Na~ ,K~ 的硝酸盐和NH_4Cl,NH_4Cl,NH_4NO_3,（NH_4）_2SO_4和（NH_4）_2CO_4为激活剂,对人工解剖获得的合浦珠母贝Pinctadamartensii精子进行激活。实验结果表明,合浦珠母贝精子的细胞膜离子通道为闸门控制类型。其激活途径主要是通过NH~ _4或HCG类激素开启该闸门,发生Na~ 和Cl~-的交换,使精于细胞获得或释放能量而激活。pH太低则会影响它们的激活作用。     

马氏珠母贝群体内遗传多样性的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术,对一马氏珠母贝养殖群体中个体大和个体小的两个组的遗传多样性进行分析。5个引物在2个组100个样品中共得到72个清晰的扩增位点,其中多态性位点71个,多态位点百分率(PPB)为98.61%。POPGENE分析结果表明:个体大的组的遗传多样性水平高于(PPB=94.44%,I=0.3523,h=0.2181,na=1.9444)小个体组(PPB=80.61%,I=0.3008,h=0.1915,na=1.8056)。两组间的遗传分化系数Gst=0.0948。UPGMA聚类分析表明大个体组内几乎所有的贝(47个)聚在一起,而小个体组的贝(50个)聚成另一支。     

合浦珠母贝精子的实验生物学初步研究

用光镜观测了海水盐度、pH、温度和激素对合浦珠母口Pinctadafucata精子的激活及运动情况的影响。结果表明,在pH为8．0的自然海水（盐度为30）中,精子不被激活,在pH为9．0—11．5的范围内80％以上的精子能被激活,其中在pH为10．0时的激活率最高,精子活力最强。在pH为9．5的条件下,观察了精子在盐度为10—45范围内的精子活力。在盐度为15—45范围内精子都能被激活,其中在盐度为30左右激活率最高,精子活力最强。同时发现,氢氧化钠没有激活作用。合浦珠母贝精子对温度的适应性很强,在15—40℃内精子激活率都很高。绒毛膜促性腺激素（HCG）也可激活,在浓度为500IU·ml~-1时激活率最高,而促黄体素释放激素A_2（LHRH-A_2）则没有激活作用。     

马氏珠母贝饥饿补偿生长的初步研究

采取饥饿处理时间不等(3、6、9和12d)、但总持续时间相等的方法研究马氏珠母贝Pinctada martensi (Dunker)稚贝在饥饿处理后的生长和存活.结果表明,S12组(饥饿12d)的存活率最低,恢复期的壳长和体重最小,表明饥饿强度大会对其生长和存活造成较大的影响;饥饿处理后的稚贝都表现出补偿生长现象,S9组(饥饿9d)的特定生长率最高,S3组(饥饿3d)的最低,但饥饿组间的差异不明显,其壳长和体重大小排列为S3>S6>S9>S12,恢复期延长,其生长恢复到正常水平.     

马氏珠母贝生长性状的相关分析

对马氏珠母贝(Pinctadamartensi)不同生长时期的壳长、壳高、壳宽和活体质量进行了一年多的跟踪测量。分析表明,在不同生长时期,其4个性状的两两间的相关系数均达到极显著水平(P<0.01),但其相关系数大小排列顺序存在差异,8次测量的平均相关系数大小依次为壳高-壳长>壳宽-体质量>壳高-体质量>壳长-体质量>壳长-壳宽>壳高-壳宽。在不同生长时期,活体质量对壳高、壳宽的偏回归系数均极显著(P<0.01),而对壳长的偏回归系数在第1,3,7,15个月时不显著(P>0.05)。该研究的结果可为珍珠贝的选育种的重要目标性状的确定提供理论指导。     

长耳珠母贝核rRNA基因ITS-2序列分析

以相应引物聚合酶链式反应(PCR)扩增长耳珠母贝(Pinctada chemnitzi)核核糖体RNA基因第2转录间隔区(ITS-2),PCR产物大小约500bp,经克隆、测序,所得序列包含5．8S和28SrRNA基因部分序列和ITS-2全序列,4种碱基含量分别为27．11％(A)、24．95％(G)、21．26％(T)和26．68％(C)。5个克隆的DNA序列差异为0．0％-0．4％,不存在个体内变异。对其潜在应用进行了讨论。     

南海海域红斑后海螯虾(Metanephrops thomsoni)的分子识别与群体遗传分化

利用16S rRNA基因序列分子识别红斑后海螯虾,然后对海南附近海域(18°30′-19°00′N,111 °30′-112°30′ E)、北部湾口海域(15°41′ N,110°40′ E)和南沙群岛海域(5°20′-5°29′N,110°09′-111°26′E)三个地理群体进行ITS1的扩增测序.16S rRNA基因序列的结果表明所取样本准确;三个地理群体分别得到616-623bp、619bp和614bp的ITS1全长序列,A、G、T、C含量平均分别为22.3％、29.4％、17.8％和30.6％;其中562个保守位点,39个多态位点.ML和NJ聚类分析显示三个地理群体共聚为三个大支,其中海南群体有群体分化.表明红斑后海螯虾三个地理群体分化极其显著,且海南群体具有相对高的遗传多样性.     

马氏珠母贝(Pinctada martensii)2个地理群体杂交子代的杂种优势和遗传变异

采用马氏珠母贝的印度群体(II0)和三亚群体(SS0)的2×2双列式杂交获得了4组子代,II1(II0♀×II0♂)、IS1(II0♀×SS0♂)、SI1(SS0♀×II0♂)和SS1(SS0♀×SS0♂);分析表明,杂交组子代IS1和SI1在壳高、壳长、绞合线长、壳宽、壳重上都表现出杂种优势;IS1在壳宽指数上表现出杂种优势,而在总重和壳重指数上未表现杂种优势;SI1在总重和壳宽指数上表现出杂种优势,而在壳重指数上未表现杂种优势;SI1在壳高、壳长、绞合线长和壳重上的杂种优势较IS1高,差异极显著(P0.01),而IS1在壳宽上的杂种优势较SI1高,差异极显著(P0.01)。应用6个微卫星位点分析4个组合子代的平均FST值为0.357,表明4个组合子代间有较大的遗传差异和较高的分化水平;平均等位基因数依次为SI1(6.17)IS1(6.00)II1(5.00)SS1(4.67),等位基因丰度依次为SI1(5.34)IS1(5.04)II1(4.47)SS1(4.55),期望杂合度(He)依次为IS1(0.55)SI1(0.54)SS1(0.44)II1(0.42),观察杂合度(Ho)依次为SI1(0.52)IS1(0.46)SS1(0.35)II1(0.29),杂交子代的杂合度和遗传多样性高于自繁子代,杂交增加了杂交子代的杂合度和遗传多样性,杂种优势与杂合度和遗传多样性增加直接相关;综合考虑杂种优势与遗传变异的结果,确定三亚野生群体♀×印度养殖群体♂杂交组合作为"珍珠贝育种规划POBs"的主要育种方式。     

紫菜(Porphyra遗传差异的ISSR分析

采用ISSR标记技术对来自不同产地的6个坛紫菜(Porphyra haitanensis)无性系和两个条斑紫菜(P.yezoensis)无性系进行了遗传差异的分析。结果表明,7条ISSR引物在8个紫菜系中共扩增出59条片段,全部表现出多态性。根据Nei等的相似性系数得出8个紫菜系间的遗传距离在0.274—0.746之间。用UPGMA方法作出的系统树中各紫菜基本上是按照产地进行聚类,从而推测紫菜的遗传差异可能与地域分布相关。本文结果也证明了ISSR与RAPD、AFLP等标记技术一样适用于紫菜的遗传多样性分析。     

基于D-LOOP基因的中国沿海鳓鱼(Ilisha elongata)种群遗传结构研究

采用线粒体控制区基因序列测定技术,分析了我国沿海重要经济鱼类鳓鱼4个地理群体的遗传结构及其变异。结果表明,我国的鳓鱼资源经过度捕捞后仍保持着丰富的遗传多样性,在检测的45个鳓鱼个体中共得到44个单倍型,单倍型多样性指数（H）高达0．964—1．000,平均核苷酸多样性指数（Pi）高达0．0100—0．0152,鳓鱼种群的多样性还表现在线粒体控制区的序列长短上,研究表明,鳓鱼线粒体控制区存在一个40bp长度的重复序列,依据重复次数的多寡而造成鳓鱼个体间的显著差异;对鳓鱼群体的遗传结构进行检测发现,我国鳓鱼群体内部存在明显的遗传分化,青岛群体与广州、厦门、舟山3个群体之间分化系数Fst达0．5284（P〈0．01）,群体间基因流则仅有0．4463,而3个群体内部则基因流明显;AMOVA检测和聚类分析也证实了上述观点,遗传距离分析表明青岛群体和其它3个群体净遗传距离达到0．034,仍属于种内群体之间的分化水平,依据分子钟理论推断两群体间的分化时间为更新世晚期,可能由更新世晚期海平面的反复升降导致了这两个类群的隔离与分化,并依靠鳓鱼本身的生物学特性维持至今。     

马氏珠母贝(Pinctada martensii)2个不同地理种群遗传变异的EST-SSR分析

应用17个EST-SSR位点分析表明,马氏珠母贝印度种群和三亚种群的平均FST值为0.486,两个种群的分化程度高;三亚种群的等位基因数为1—6,有效等位基因数为1.0—3.3;印度种群的等位基因数为2—7,有效等位基因数为1.1—3.3;三亚种群和印度种群的平均有效等位基因数分别是1.8和1.9;三亚种群和印度种群的等位基因丰度分别为3.16和3.39;印度种群无论是期望杂合度(HE)还是观察杂合度(HO)都高于三亚种群,印度种群的期望杂合度和观察杂合度分别是0.42和0.16;三亚种群的期望杂合度和观察杂合度分别是0.38和0.15;三亚种群与印度种群的Nei’s遗传距离为1.119。两个种群都保持了中等水平遗传多样性。由于两个种群高度的遗传分化和保持丰富的遗传多样性为开展两个种群间杂交及获得杂种优势奠定了基础。     

中国沿海7个长蛸(Octopus variabilis)群体COI基因的遗传变异研究

采用线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因序列测定技术分析了中国沿海重要经济头足类长蛸7个野生群体的种群遗传结构及其变异。结果表明,我国长蛸资源存在相对丰富的遗传多样性,635bp长度的核苷酸片段共检测到74个多态位点,多态位点比例达11.7%,检测的108个个体中共获25个单倍型,单倍型多样性指数(H)达0.342—0.934,平均核苷酸多样性指数(Pi)达0.0008—0.0055,高于多数海洋头足类的遗传变异。对7个群体的遗传结构进行检测表明,我国的长蛸群体间存在显著的遗传分化(P0.05),遗传结构基本符合脚踏石模型。7个群体可明显聚类为3个类群,类群间分化系数Fst达0.8858(P0.01),基因流大大小于1;AMOVA检测和单倍型网络关系图也证实了上述类群的分化。遗传距离分析表明,由厦门群体组成的类群与其它2类群间的遗传距离达到0.086—0.098,可能达到了亚种的分化。     

我国沿海鼠尾藻（Sargassum thunbergii）遗传资源RAPD分析

采用RAPD分子标记技术分析了我国沿海五个海区（大连、威海、青岛、温州、福州）鼠尾藻种群的遗传多样性。从60条随机引物中筛选出21条引物,对五个鼠尾藻种群共150份DNA样本进行了扩增,共检测到207个有效位点,多态位点达89．5％,Nei基因多样性指数（H）为0．2966,Shannon信息指数（I）为0．4508;...     

THE GENETIC DIVERSITY AND PHYLOGENETICANALYS OF ITS1 IN MITOCHONDRIAL DNA OF FOUR POPULATIONS OF PORTUNUS TRITUBERCULATUS

对我国沿海4个野生群体三疣梭子蟹的核糖体RNA转录单元内间隔区ITS1基因片段进行克隆和测序,获得长度为515—571bp的ITS1核苷酸序列,在4个群体的三疣梭子蟹中共检测到变异位点56个,多态位点比例为9．5％,其中简约信息位点25个,共检测到40种单倍型。通过统计单倍型多态性、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,结果显示：舟山群体多样性指数最高,其次是鸭绿江口群体和海洲湾群体,莱州湾群体最低。在三疣梭子蟹ITSl序列中共发现5种微卫星位点,AMOVA分析结果显示4个群体间的遗传差异显著。另外,将本研究所得序列结合GenBank数据库中十足目12种蟹ITSl序列构建系统进化树,系统树显示同属的不同种各自聚支,与形态学分类吻合。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)岱衢洋选育群体和官井洋养殖群体的遗传差异分析

应用RAPD技术对大黄鱼岱衢洋选育群体和官井洋养殖群体的遗传差异进行研究,选取15条10bp随机引物,共检测出96个RAPD位点。结果表明,岱衢洋选育群体的多态位点比例为33.33%,平均杂合度为0.3008,Shannon多样性信息指数为0.0879,群体内个体间平均遗传相似系数为0.9079,平均遗传距离为0.0921;官井洋养殖群体的多态位点比例为43.75%,平均杂合度为0.3298,Shannon信息指数为0.1221,群体内个体间平均遗传相似系数为0.8784,平均遗传距离为0.1216。大部分遗传变异(93.52%)存在于群体内,少部分遗传变异(6.48%)存在于群体间。两群体间的Nei氏标准遗传距离为0.0123。以上分析表明,大黄鱼官井洋养殖群体的遗传多样性水平高于岱衢洋选育群体,但两个群体都处于较低的遗传多样性水平,需要对大黄鱼的种质资源进行科学管理和保护,以避免遗传多样性下降。     

6种舌鳎亚科鱼类ITS1序列长度多态性及系统分析

利用核糖体第一内转录间隔区(ITS1)对舌鳎亚科(Cynoglossinae)6种鱼类进行系统分析,发现舌鳎亚科ITS1区具有明显的序列长度多态性(404—744bp),序列长度分为三种类型,分别为404—405bp、462—463bp以及741—744bp,同一长度类型的不同种类间序列高度相似,平均遗传距离分别为0.00248、0.00217和0.00169,而不同类型间序列差异显著,平均遗传距离最小为0.38453。分析表明,序列长度多态性可能与物种分化时间有关。采用NJ(neighbour-joining)法及MP(maximum parsimony)法构建分子系统树,结合形态学特征及GenBank中的线粒体DNA序列进行分析,表明紫斑舌鳎(Cynoglossus purpureomaculatus)与短吻三线舌鳎(C.abbreviatus)可能为同物异名。另外,舌鳎属(Cynoglossus)的中华舌鳎(C.sinicus)与须鳎属(Paraplagusia)的日本须鳎(Paraplagusia japonica)聚为一支,舌鳎属中三线舌鳎亚属(Areliscus)的长吻红舌鳎(C.lighti)与拟舌鳎亚属(Cynoglossoides)的少鳞舌鳎(C.oligolepis)聚为一支,与形态分类学的观点不一致,值得进一步研究。