舟山近海环境DNA保存方法的建立及优化

近年来,环境DNA(environmentalDNA,eDNA)技术开始被广泛应用于水生生物多样性研究。本文通过绝对定量和高通量测序技术对舟山近海高浊度水样eDNA的保存方法进行了建立和优化。研究结果如下:(1)"酒精+低温"保存法的eDNA获得量是"酒精+常温"保存法的0.78—1.06 (7d)、0.89—1.80 (15d)、1.05—2.75 (30d)和2.69 (60d)倍;(2)酒精保存法(低温、常温)存在eDNA富集物渗漏及滤膜黏附现象;(3)短期内冷冻保存样品的eDNA获得量是酒精保存样品获得量的1.25—1.59倍(7d)和1.07—1.20倍(15d);(4)酒精保存法的eDNA降解速率慢于冷冻保存法,长期内酒精保存样品的eDNA获得量是冷冻保存样品获得量的1.99—2.10倍(30d)和2.84—7.64倍(60d);(5)二次富集(过滤)能显著提高eDNA获得量,富集组eDNA浓度是未富集组浓度的1.60—4.95倍("酒精+低温")和1.21—2.04倍("酒精+常温");(6)"酒精+低温"保存的样品在高通量测序总丰度、各鱼种分丰度、物种多样性指数等多个方面优于冷冻保存样品;(7)微生物(micro-organism)的eDNA降解速率慢于大生物(macro-organism),不同界(Kingdom)的eDNA最优保存方法可能并不相同。本研究首次建立了舟山近海高浊度水样eDNA最适保存方法,为相似水域的eDNA保存提供了借鉴参考。     

DNA/RNA提取及处理方法对评价沉积物中纤毛虫分子多样性的影响

环境DNA(eDNA)技术结合高通量测序已广泛应用于评价微型生物多样性与群落构成。相较于eDNA,RNA在环境中易降解,环境RNA(eRNA)可更准确地反映群落近期生命活性状态。理论上,基于eRNA检获的生物多样性要低于eDNA检获的总体多样性。但前期已发表研究显示同一站点eDNA获得的多样性低于eRNA检获量,推测可能原因包括:1)样本量不同;2)RNA中存在DNA污染。为验证假设,本研究以陆架区2个站位沉积物中的纤毛虫为实验对象,系统性比较4种DNA/RNA提取方法:DNA直接提取(0.9 g沉积物),大样本量DNA直接提取(2 g), DNA洗脱法(2 g), RNA直接提取法(2g);以及3种RNA提取后的处理方法:无DNA酶反转录,含DNA酶反转录,先纯化RNA再反转录。研究结果表明,大样本量(2 g)DNA直接提取法所检获的可操作分类单元(OTUs)约为小样本量(0.9 g)的2倍。相同样本量下, DNA洗脱法检获的OTUs最多,而DNA直接提取检获的OTUs低于有/无DNA酶反转检获的数量,先纯化再反转录所获得OTUs最少。就群落构成而言, DNA洗脱法和RNA纯化可有效...     

环境DNA技术在生态保护和监测中的应用

生物多样性减少、生态系统功能退化、全球气候变化是全球性重大问题,在避免对当前生态环境再破坏的前提下,开展全面准确的生态监测来查清和明确生物多样性,对生态保护和可持续利用极其重要。环境DNA技术（eDNA）的发展提供了一种生态和生物多样性监测的新手段,是近年来的前沿热点技术之一。国际上已经将其广泛应用于生态监测中,而我国的相关研究成果,尤其是在海洋生态监测中的研究成果则相对缺乏。本文综述了eDNA技术的发展和国内外基于eDNA技术取得的相关成果,主要从eDNA技术与传统监测方法的互补性、基于eDNA技术监测物种生活史过程、基于eDNA技术推算物种丰度、基于eDNA技术研究生态系统结构变化等几个主要方面进行了介绍;阐释了eDNA技术应用的研究领域和方向;揭示了eDNA技术在生态监测中的适用性和重要性;指出了eDNA技术存在的一些问题。本综述对于生态保护与监测、资源的保护和可持续利用具有一定的参考价值。     

环境DNA技术在渔业资源生物量评估中的研究进展:现状与展望

近年来,由于过度频繁的人类活动,导致全球渔业资源正遭受威胁.与传统渔业评估方法相比,环境DNA(eDNA)技术具有操作简便、侵入性低、灵敏度高等优点,因而在渔业资源评估中应用广泛.eDNA技术在物种丰度和生物量评估中已经被证明是可行的,本文总结了eDNA技术在渔业资源生物量评估中的研究现状,从eDNA技术与传统方法互补...     

环境DNA技术在长江口水生生物监测中的应用潜力

环境DNA(Environmental DNA,eDNA)技术是一种正在蓬勃发展的生物采样监测技术,可以根据需要同时监测特定对象或多种水生生物,因其便利快捷,对检测对象和生态环境友好等优点而在水生生物资源监测中具有广阔的应用潜力.长江口水域作为我国最大的河口,是诸多水生生物季节性洄游、觅食和栖息的重要场所,因此对该水域...     

基于环境DNA metabarcoding和底拖网调查的南黄海西部鱼类多样性比较

为探究环境DNA metabarcoding(eDNA metabarcoding)和底拖网在陆架海域环境下获取鱼类多样性和分布的差异,基于2020年夏季南黄海西部13个站位的环境DNA采样和底拖网调查数据,使用Alpha多样性指数和Beta多样性分析,比较了环境DNA metabarcoding和底拖网检测鱼类生物多样性的表达程度,探讨了使用环境DNA metabarcoding技术监测海洋生物多样性和空间分布的效果。研究显示：环境DNA metabarcoding检测出45种鱼类,底拖网调查检测出32种鱼类,重叠种类23种;在环境DNA metabarcoding结果中,小黄鱼(Larimichthys polyactis,27.20%)、方氏云鳚(Pholis fangi,21.16%)、黄鮟鱇(Lophius litulon,18.67%)、日本鳀(Engraulis japonicus,8.59%)、小眼绿鳍鱼(Chelidonichthys spinosus,4.06%)占有相对较高的读数;底拖网调查的结果中,小黄鱼(L.polyactis,16.14%)、日本带鱼(Tri...     

环境RNA技术在水生生态系统生物多样性监测中的应用

随着人类活动在全球范围内的不断增强，水生生态系统的生物多样性丧失，群落结构发生巨大变化。因此，进行准确可靠的生物多样性监测来确定目标区域的物种丰度和群落结构对生态保护和资源可持续利用至关重要。环境DNA技术（eDNA）作为一种非入侵性的新手段，正在迅速发展，然而，eDNA技术易出现假阳性，从而导致实时生物多样性监测不准确的现象仍然普遍存在。与eDNA技术相比，环境RNA技术（eRNA）的快速降解使得它具有减少eDNA监测结果假阳性的潜力。本文概述了eRNA技术在水生生态系统的生物多样性监测中的可行性，主要从eRNA技术在水生生态系统中的可检测性和提高检测分辨率的潜力两个方面来介绍；综述了eRNA技术目前在水生生态系统生物多样性监测方面的研究进展；指出了eRNA技术目前存在的问题并分析了未来的研究方向。本文对未来将eRNA技术实际应用于水生生态系统的生物多样性监测、生态保护和资源可持续利用具有一定的参考价值。     

环境DNA技术在渔业资源生物量评估中的研究进展

近年来,由于过度频繁的人类活动,导致全球渔业资源正遭受威胁。与传统渔业评估方法相比,环境DNA(eDNA)技术具有操作简便、侵入性低、灵敏度高等优点,因而在水生生态系统中应用广泛。eDNA技术在物种丰度和生物量评估中已经被证明是可行的,本文总结了eDNA技术渔业资源生物量评估中的研究进展,从eDNA技术与传统方法互补性、eDNA浓度影响因素及模型、生物量定量模型以及应用前景等方面展开阐述,为以后eDNA技术在渔业资源生物量评估中应用提供参考。     

基于沉积物eDNA评估三疣梭子蟹资源量的方法初探

本文旨在通过沉积物eDNA (environmental DNA)的分析,建立一种快速评估三疣梭子蟹资源量的方法。采用柱状采泥器对莱州湾同一地点(37°30″E、119°20″N)不同深度(0~24 cm,7个深度)进行样品采集,提取不同深度地层沉积物中的eDNA,并以此为模板,运用三疣梭子蟹COI基因通用型引物和特异性引物分别进行普通PCR和实时荧光定量PCR (quantitative PCR,qPCR)扩增,评估莱州湾近年来三疣梭子蟹的资源量变化。结果显示:7个样品的eDNA中均能扩增出700 bp长度的DNA产物,表明在不同深度沉积物所代表的年份均有三疣梭子蟹的存在;通过Clustal X与MEGA 7.0软件比对各序列碱基之间的差异性,发现不同柱深沉积物中的COI基因共出现11个变化位点,包括8个转换位点、2个颠换位点和1个插入位点;qPCR结果显示,8~9 cm处的三疣梭子蟹COI基因拷贝数要大于其他深度地层沉积物,说明此柱深代表的年份中三疣梭子蟹的资源量高于其他年份。利用沉积物eDNA评估莱州湾海域内的三疣梭子蟹资源量的方法,可以打破时间和空间的限制,检测不同年份三疣梭子蟹的资源量的变化。     

近海水体环境DNA沉降对沉积物中纤毛虫分子多样性评估的影响

在陆架海区沉积物中, DNA高通量测序技术可检获大量浮游寡毛类和舞毛类等非底栖纤毛虫,这些源于水体的环境DNA(eDNA)如何影响对沉积物中纤毛虫分子多样性的评估,以及影响程度如何尚不明确。本研究选取了黄海冷水团中的两个站位,通过提取水体和沉积物中DNA和RNA,并采用直接提取法和洗脱法提取沉积物DNA,结合DNA和cDNA测序技术,探讨了水体和沉积物中纤毛虫分子多样性的关系。研究表明,基于洗脱DNA法、直接提取DNA法和cDNA法获得的沉积物中纤毛虫OTUs数分别为451、312和324个,其中211个OTUs同时由三种方法检获;而164个OTUs仅通过洗脱DNA法检获,其中89%为相对丰度低于0.1%的稀有类群。直接提取DNA法所获的寡毛类和舞毛类序列数占比达46%,而在洗脱DNA法和cDNA法中占比仅为12%和10%。沉积物中检获的43%—71%的舞毛类和寡毛类OTUs与浅层水(40m)共有,仅19%—29%与深层水(40m)共有,且这些共有的OTUs可同时在浅层水中检获。本研究发现,对沉积物中纤毛虫分子多样性评价造成影响的浮游类群主要来自浅层水,洗脱DNA与cDNA测序均可显著降低浮游类群eDNA的影响。鉴于洗脱DNA法较之cDNA法操作更简便,且避免了反转录过程导致的偏差,因此推荐用于对近海沉积物中纤毛虫等真核微生物的分子多样性研究。     

海洋贝类功能基因的研究进展

本世纪初人类基因组序列图谱的完成从分子水平上揭示了DNA内部结构和遗传机制的本质,极大地推动了生命科学的发展,同时也使人们意识到基因资源的巨大科研和商业价值.在此后的10年间,基因组测序及分析技术取得了一系列重大突破,大量模式生物基因组数据库相继发布,生物信息量呈爆发式增长.在海洋贝类方面,有太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)全基因组序列图谱的完成[1]、文蛤(Meretrix meretrix)[2]和虾夷扇贝(Patinopecten yes-soensis)[3]转录组以及虾夷扇贝[4]、文蛤[5]、泥蚶(Tegillarca granosa)[6]、 缢蛏(Sinonovacula constricta)[7]等多种贝类eDNA文库的成功构建等.     

乳山湾外海溶氧低值区细菌多样性初步研究

采用化学裂解法从乳山湾外海溶氧低值区不同溶解氧质量浓度(3.7～7.0mg.L-1)的6个站位海水样品中提取了环境DNA样品。以试剂盒纯化后的DNA样品为模板扩增其16SrRNA基因V3区,通过变性梯度凝胶电泳、分子文库构建及DNA测序对溶氧低值区海水中的细菌群落结构进行研究。结果表明,乳山湾外海溶氧低值区不同溶解氧质量浓度的6个站位底层海水样品中的细菌群落结构是相似的,它们均由隶属于Alteromonas(交替单胞菌属)、Salegentibacter(需盐杆菌属)等10个属的18种细菌组成。系统发育分析发现这些细菌分别属于α变形菌纲(2种)、γ变形菌纲(12种)和黄杆菌纲(3种)三个大类。在乳山湾外海溶氧低值区的海水样品中细菌多样性最高的类群是γ变形菌纲。     

鱼类环境DNA metabarcoding片段的近缘物种识别差异

已知的鱼类环境DNA（eDNA）metabarcoding片段均未被针对性考察其对近缘物种的适用性,实际使用过程中存在“物种丢失”风险。为筛选出物种识别率最高的片段,本研究比较了15个主流片段对106属（共935种）鱼类的识别差异。研究结果如下:（1）蛋白质编码基因（COI,片段15）的物种识别率最高,但其引物通用性最差;片段09、片段11、片段07、片段03、片段12的引物序列总平均遗传距离也较大,均存在eDNA低效扩增的风险;（2）片段长度影响物种识别率,核糖体基因中片段05、片段06、片段01、片段02及片段13的物种识别率较高;（3）非度量多维尺度分析（NMDS）显示,不同基因、同一基因不同片段的识别结果存在较大差异,应考虑多片段、多基因组合应用;片段01与片段02、片段05与片段06等在NMDS图上距离较近,存在相互替代性;（4）物种类群影响识别结果,eDNA研究仍需要进一步开发高识别率片段。综合物种识别率、引物通用性、NMDS分析等多方面因素,本研究推荐2×150 bp测序平台使用片段01（MiFish-U）、2×250 bp测序平台使用片段05（Ac12S）,辅以片段13（Vert-16S-eDNA）等进行近缘鱼类多样性调查。本研究旨在为提高鱼类eDNA调查结果准确性提供一定技术支撑。     

MALBAC技术扩增微生物群落基因组的效率评估

环境样品的低生物量是微生物宏基因组学研究面临的首要挑战,通过基因组扩增技术来满足高通量测序对DNA样品量的需求是最常用的解决策略。MALBAC(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles)基因组扩增试剂盒最初为扩增和研究哺乳动物的单细胞基因组而研发。本文中,我们通过人工构建的微生物群落来检测该试剂盒在微生物宏基因组扩增方面的效率和应用可行性。结果表明,每个标准反应中,10 pg的DNA模板量足以满足MALBAC试剂盒对样品扩增的需要。每个标准反应DNA模板用量为10和100 pg时,所扩增DNA样品的基因组覆盖度与原始未扩增样品表现出高度的一致性,证明MALBAC试剂盒扩增效果的高度稳定性和一致性。常用的GenomePlex全基因组扩增试剂盒使我们可以在每个标准反应DNA模板量为100 pg的条件下扩增获得足够的DNA样品,但是结果表明该参照试剂盒无法有效的实现对群落中低丰度细菌菌株基因组的线性扩增。对于MALBAC试剂盒和参照试剂盒而言,在扩增高GC含量的微生物物种基因组DNA方面效率低下。我们的实验结果表明MALBAC试剂盒在高效扩增环境样品宏基因组DNA方面的可行性,但对该试剂盒在扩增环境样品中高GC含量微生物物种方面的适用性存在疑虑。     

16SrDNA克隆文库解析仿刺参(Apostichopus japonicus)苗种培育池中生物絮团的细菌群落结构

通过采集东营和蓬莱地区采用生物絮团技术的仿刺参(Apostichopus japonicus)苗种培育池(DYt和PLt)及其对照池(DYc和PLc)海水样品,构建细菌16S r DNA克隆文库,对其中细菌群落的多样性和群落组成结构进行了分析。结果表明,四个文库Coverage值在34.7%—54.8%之间,文库丰富度指数(Chao)66.2—314.1,Shannon多样性指数从3.01—4.07变动,Pielou均匀度指数0.68—0.85,样品的细菌群落均具有很高的多样性,蓬莱仿刺参苗种培育池细菌多样性均高于东营;生物絮团文库中细菌包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形细菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)等八个菌门和未知类群,黄杆菌群(Flavobacteria)、α-变形菌群(Alphaproteobacteria)和芽孢杆菌群(Bacilli)为主要优势菌群;DYt和PLt处理组文库细菌多样性减少并出现特征菌群,生物絮团调控技术改变了仿刺参苗种培育环境的微生物群落结构。生物絮团的细菌群落结构研究,为揭示生物絮团的作用机制并进一步有效利用提供研究基础和依据。     

两种铜(Ⅱ)-司帕沙星配合物与DNA作用及生物毒性比较

选择铜(Ⅱ)-司帕沙星-邻菲啰啉Cu(sf) phenCl(sf代表司帕沙星负离子,phen代表邻菲啰啉)和铜(Ⅱ)-司帕沙星Cu(sf)22种配合物,通过电子吸收光谱法、荧光分析法及琼脂糖凝胶电泳法研究了其与DNA的作用,首次以斑马鱼胚胎为模式生物,研究了它们的生物毒性,并对2种配合物的研究结果进行了比较.光谱实验结果表明:Cu(sf) phenCl与DNA的作用强于Cu(sf)2;琼脂糖凝胶电泳实验结果显示:在抗坏血酸存在条件下,Cu(sf) phenCl对pBR322质粒DNA的切割作用更强;同时,斑马鱼胚胎毒性实验显示Cu(sf) phenCl对斑马鱼胚胎毒性也更大.     

鄂霍次克海冷泉沉积物真核生物多样性的初步研究

从鄂霍次克海沉积物样品中提取总基因组DNA,进行核糖体rRNA基因内转录间隔区(ITS)的扩增,构建克隆文库并进行测序,对该环境下真核生物的多样性进行了初步研究。结果发现,该环境下的真核生物具有较高的多样性,主要为3大类,真核藻类、真菌和微型浮游动物。藻类和微型浮游动物的组成与前人在该海域浮游生物生态学的研究相吻合,而真菌群落具有较高的多样性,这为该区域真核生物多样性、所参与的生物地球化学过程及生态学意义的研究奠定了基础。     

中华白海豚SRAP分子标记多态性的初步研究

首次将SRAP(sequence-related amplified polymorphism)方法引入中华白海豚(Sousa chinensis)多态性研究中,利用高分辨率的毛细管凝胶电泳分析了模板DNA、Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶等因素对SRAP-PCR扩增结果的影响.确定了me1-em5为扩增中华白海豚基因组DNA的最佳引物对.并进一步确立了适合中华白海豚的SRAP最佳反应体系:25 mm3体系中,模板DNA浓度为0.8 ng/mm3,Mg2+浓度为1.0 mmol/dm3,dNTP浓度为0.1 mmol/dm3,引物浓度为0.2μmol/dm3,Taq DNA聚合酶浓度为0.04 U/mm3.利用该反应体系对10个白海豚样品进行SRAP分析的结果表明,不同样品间DNA谱带清晰、多态性丰富.证实该体系稳定可靠,可以用于中华白海豚的分子标记研究.     

半滑舌鳎循环水养殖系统中生物滤池细菌多样性及功能预测分析

生物滤池中生物膜细菌群落是循环水养殖系统水处理的重要组成部分,目前关于半滑舌鳎海水循环水系统生物滤池生物膜细菌群落和功能研究鲜见报道。本研究于2019年4月对海水循环水养殖系统3级生物滤池中水体和生物膜进行采样,采用高通量测序技术对其群落组成进行了研究分析,结果表明生物滤池细菌群落主要由变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、蓝藻细菌门(Cyanobacteria)等27个门组成,具有丰富的群落组成,生物膜和养殖水体样品细菌群落结构有所差异,不同生物滤池中生物膜细菌群落结构有较大差异;生物膜与水体中的浮霉菌门细菌存在显著差异,且在生物膜上发现有5.6%～11.7%的浮霉菌门细菌,推断其可能进行硝化作用。PICRUSt功能预测分析表明生物膜上细菌主要涉及代谢、遗传信息处理和环境信息处理等6类生物代谢通路,各级生物滤池生物膜细菌群落功能有所差异,所有样品均发现有氮代谢功能(Nitrotoluene degradation)的基因。本研究从细菌群落组成、细菌群落多样性及功能预测等角度初步分析了海水循环水系统3...     

南海沉积物中有孔虫分子生物学鉴定的初步研究

本文以南海深海表层沉积物中的有孔虫样品为研究对象,提取了样品的总DNA片段,利用特异性DNA探针,进行有孔虫的SSUrDNA扩增,对获得的PCR产物进行克隆,测序及分析,证实确为潜在的有孔虫DNA.进化树分析揭示了研究样品中可能存在的有孔虫种类,该方法的建立为有孔虫壳体的鉴定提供了新的技术手段