海洋经济贝类分子遗传标记及其应用的研究进展

摘 分子遗传标记是随着分子生物学技术的发展而出现的遗传标记技术,它突破了形态和细胞水平上遗传标记的局限性,发挥着独特的优势。本文简要介绍了同工酶、RFLP、RAPD、AFLP、mtDNA、SSR等几种常用的分子遗传标记技术方法,并比较了各种技术的优点和局限性;概述了这些遗传标记技术在海洋经济贝类群体遗传结构和变异、遗传分化、遗传育种、种质鉴定、基因定位和构建遗传图谱研究等方面的应用和取得的研究成果。     

贝类雌激素受体的同源建模与分子对接研究

采用多模板同源建模方法构建了斑马鱼(Danio rerio)、长牡蛎(Crassostrea gigas)和菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)雌激素受体配体结合区(ER-LBD)的三维结构模型,并开展了与苯并芘(B[a]P)、四溴双酚A(TBBPA)和对壬基酚(4-NP)的分子对接研究.采用P...     

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路研究参苓白术散对IBS-D大鼠的干预机制

目的：基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路研究参苓白术散对腹泻型肠易激综合征（IBS-D）大鼠的干预机制。方法：将48只大鼠随机分为空白组、模型组、匹维溴铵组［20 mg/(kg·d）］、参苓白术散组［SLBZ组,1.44 g/（kg·d）］、TLR4抑制剂组［TAK-242组,1 mg/（kg·d）］、TLR4抑制剂+参苓白术散组（TAK-242+SLBZ组）,每组各8只。除空白组外,其余各组均采用4%乙酸构建IBS-D大鼠模型。造模成功后,各给药组给予相应的药物灌胃,连续7 d。观察大鼠一般情况,体质量及粪便Bristol评分,结肠组织病理学变化,血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）及白细胞介素-1β（IL-1β）水平,结肠组织闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、紧密连接蛋白（Occludin）、Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）、核转录因子-κB p65（NF-κB p65）蛋白表达水平。结果：成功造模38只。与空白组比较,模型组大鼠体质量下降,粪便Bristol评分升高,HE染色可见炎症细胞浸润,血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高,结肠组织ZO-1与Occludin蛋白水平降低,TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平升高（P＜0.05）。与模型组比较,匹维溴铵组、SLBZ组、TAK-242组、TAK-242+SLBZ组大鼠体质量增加,粪便Bristol评分降低,HE染色炎症细胞浸润减少,血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平均显著下降,ZO-1和Occludin蛋白表达水平升高,TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达水平下降（均P＜0.05）。与匹维溴铵组、SLBZ组、TAK-242组比较,TAK-242+SLBZ组大鼠结肠组织ZO-1与Occludin蛋白表达水平升高,TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平下降（均P＜0.05）。结论：参苓白术散可改善IBS-D大鼠腹泻症状,降低血清炎症因子水平,修复肠黏膜,其机制可能是通过调控TLR4 /MyD88 /NF-kB信号通路来达到减轻肠道炎症反应的目的。     

基于三种分子标记的外伶仃岛石珊瑚系统进化关系研究

以广东省珠海市外伶仃岛地区常见的4属5种石珊瑚为研究对象,对线粒体COI、16S rRNA和ITS三种基因片段数据进行分析,并计算了种间遗传距离。序列分析结果表明5种石珊瑚的COI、16S rRNA基因片段碱基AT含量大于GC含量,而ITS序列碱基AT含量小于GC含量;5种石珊瑚种间的三种基因平均遗传距离分别为0.043、0.134和0.763,所得遗传距离结果存在一定差异。将三种基因串联起来并利用邻位连接法(NJ)、最大似然法(ML)和最小进化法(ME)分别构建了分子系统树。在系统发育树中,科一级的系统进化关系与形态学分类一致,但蜂巢珊瑚科内的分子系统分类结果与形态学分类阐述的遗传进化关系略有差别,说明石珊瑚传统分类可能受骨骼可塑性的影响。研究结果为外伶仃岛石珊瑚的亲缘关系研究提供相关基础数据,并为该地区石珊瑚资源保护奠定理论基础。     

海洋污损细菌群落结构及其发酵液中化学成分的研究

从烟台附近海域通过挂板取样获得了污损微生物膜样品。利用高通量测序鉴定其中细菌有假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.),芽孢杆菌(Bacillus sp.),盐单胞菌(Halomonas sp.),嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.),肠杆菌(Enterobacter sp.)。通过对微生物膜污损细菌进行发酵培养,结合天然产物分离纯化和核磁共振鉴定技术,共从发酵液中分离并鉴定了9种次级代谢产物,其中4种是二酮哌嗪(Diketopiperazine,DKP)类信号分子,环(脯氨酸-甘氨酸)(1),环(脯氨酸-丙氨酸)(2),环(4-羟基-脯氨酸-亮氨酸)(3),环(脯氨酸-酪氨酸)(4),以及尿嘧啶(5),胸腺嘧啶(6),对羟基苯乙醇(7),十五烷酸(8),邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(9)。研究结果表明,烟台海域污损微生物膜中细菌组成多样,以假交替单胞菌和芽孢杆菌为主;污损细菌产生了多种代谢物,其中包括4种DKP类信号分子,该类物质可能对生物污损的发生具有调控作用,为探究生物污损和生物膜的作用机制奠定了基础。     

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii)Toll样受体2(TLR2)基因克隆及免疫功能

为探究Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)及下游免疫分子对瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii)机体的保护作用,本研究采用RT-PCR及RACE法获得瓦氏黄颡鱼TLR2全长c DNA(2611bp),编码789个氨基酸残基,含有10个富含亮氨酸的重复序列(Leucine Rich Repeat,LRR)和Toll/IL-1R(Toll/IL-1 Receptor Domain,TIR)同源区结构域,属I型跨膜受体。序列同源性比对发现,瓦氏黄颡鱼TLR2 c DNA与斑点叉尾、鲤及虹鳟的同源性分别为78%、62%及49%。系统进化树分析表明,瓦氏黄颡鱼TLR2与斑点叉尾聚为一支。q RT-PCR分析表明,TLR2 m RNA在检测的组织中均有表达,且在头肾和脾脏中表达水平显著高于其他组织(P0.05)。嗜水气单胞菌感染能显著上调瓦氏黄颡鱼肝脏、头肾及脾脏中TLR2 m RNA表达(P0.05),分别在24h、48h及12h达到最大值。头肾中的TLR 2信号通路下游的髓样分化因子、半胱氨酸蛋白酶8、核转录因子kappa B、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1βm RNA均显著上升(P0.05),分别在24h、12h、48h,48h和48h达到最大值。结果表明,嗜水气单胞菌感染激活了TLR2信号通路,通过上调表达,肿瘤坏死因子α,白细胞介素1β等。本研究表明,TLR2在瓦氏黄颡鱼抵御嗜水气单胞菌侵染的过程中发挥了重要的免疫作用。     

基于RNA-seq数据分析长牡蛎(Crassostrea gigas)天然免疫的可变剪接事件

大部分无脊椎动物缺乏基于经典抗体和记忆细胞的适应性免疫, 因而天然免疫在无脊椎动物免疫防御中发挥不可或缺的作用。可变剪接正是产生天然免疫多样性和特异性的重要途径。牡蛎(Crassostrea)是全球范围内的大宗养殖贝类和我国产量最高的海水养殖贝类, 理解其天然免疫系统的多样性和特异性对牡蛎病害防治和养殖业健康可持续发展至关重要。通过对不同病原诱导以及诱导后不同时间的转录组进行生物信息分析, 系统地研究了长牡蛎天然免疫应激反应的可变剪接事件。发现在弧菌诱导下可变剪接事件的总数显著增加, 表明弧菌的感染会诱导长牡蛎可变剪接事件的产生。对病原诱导后可变剪接体的组成类型及表达量显著变化的基因的功能富集分析, 表明免疫系统相关功能被显著富集, 病原感染不同阶段以及不同病原感染后可变剪接体的组成类型和表达量均不一致, 表明长牡蛎免疫系统可通过可变剪接产生免疫响应的特异性和多样性。研究结果为长牡蛎等无脊椎动物天然免疫多样性和特异性提供了典型实例, 也为长牡蛎病害防御提供了理论支撑。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)微卫星多重PCR 体系构建及其在家系鉴定中的应用

筛选多态性高、特异性好、片段大小适中的10 个长牡蛎微卫星位点进行优化组合, 根据扩 增片段大小及同一荧光不重叠原则构建了两组五重PCR 体系。运用CERVUS 3.0 软件对0527 组27 个长牡蛎全同胞家系的643 个子代和0612 组27 个全同胞家系382 个子代分别进行亲权鉴定。结果 发现, 用两组微卫星五重PCR 鉴别时, 在0527 组和0612 组的鉴定成功率均为100%; 只用第一组微 卫星五重PCR, 可以将0527 组96%的子代和0612 组96%的子代鉴定到亲本; 只用第二组微卫星五 重PCR, 可以将0527 组97%的子代和0612 组95%的子代鉴定到亲本。本研究中筛选出的两组微卫 星五重PCR 体系在两组家系中的鉴定效率均较高, 可以快速有效地将子代个体鉴定至所属父母本, 在长牡蛎家系鉴定中具有很好的应用价值。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)不同组织中蛋白酶的分布及冷藏过程中酶活力与鲜度变化

以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,采用酶活力测定和Western blotting鉴定牡蛎不同组织中氨肽酶、胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶、组织蛋白酶等几种主要蛋白酶的分布,探讨牡蛎肉在4°C冷藏过程中酶活力和鲜度指标的变化规律。结果显示:在牡蛎的外套膜、鳃、闭壳肌和性腺-内脏团四种组织中,亮氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、精氨酸氨肽酶均有较高酶活力;胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶主要分布于性腺-内脏团,在另外三种组织中活性较低;组织蛋白酶B和B+L绝大部分在性腺-内脏团中表达。在4°C冷藏过程中,酶活力发生明显变化,经7d冷藏后,性腺-内脏团中亮氨酸氨肽酶的酶活力为初始值的25.15%,丙氨酸氨肽酶的酶活力为初始值的31.65%,精氨酸氨肽酶的酶活力为初始值的23.19%;组织蛋白酶B和B+L的酶活力分别是初始值的2.59和4.23倍;胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶酶活力上升44%。随着冷藏时间的延长,牡蛎的鲜度指标发生变化:牡蛎pH值呈现先降低,9d后上升的趋势;氨基酸态氮含量由初始的(0.26±0.05)g/100g增加至第7d的(0.31±0.03)g/100g;挥发性盐基氮含量从(5.60±0.64)mg/100g上升至第7d的(17.50±0.37)mg/100g;SDS-PAGE分析显示,牡蛎冷藏过程中四种组织的蛋白质均发生了不同程度的降解。本研究揭示了牡蛎在短期冷藏过程中几种主要蛋白酶和鲜度指标的变化规律,为牡蛎的冷藏保鲜提供了参考。     

青蛤(Cyclina sinensis)TLR2基因的克隆与表达分析

利用转录组文库分析得到青蛤(Cyclina sinensis)的Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)基因序列,采用荧光定量PCR法分析该基因的表达过程。结果显示,青蛤TLR2基因的cDNA开放阅读框为2082bp,编码693个氨基酸,具典型的LRRs、单次跨膜区和TIR结构域。该基因在血淋巴中的表达量最高,与肝脏、鳃、外套膜、闭壳肌和性腺有显著性差异(P0.05)。在鳗弧菌和Poly I:C刺激下,青蛤血淋巴中TLR2基因3h开始升高,48h达到最大值,与对照组和空白组有极显著性差异(P0.01);藤黄微球菌刺激下,血淋巴中CsTLR2基因3h开始升高,48h亦达到最大值,实验组与对照组有显著性差异(P0.05)。     

香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)与长牡蛎(Crassostrea gigas)种间杂种遗传力评估

以平衡巢式设计(1长牡蛎♂:3香港牡蛎♀)构建的45个香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)×长牡蛎(Crassostrea gigas)种间杂交家系为材料,对其生长、存活及产量性状狭义遗传力进行了评估,并对其两两对应性状表型相关及遗传相关进行了分析。结果表明:(1)生长性状的遗传力大小为0.6207—0.8785,以父系半同胞组内相关法估计的幼虫15日龄、稚贝180日龄、幼贝360日龄壳高遗传力分别为0.6355、0.4828、0.5787,其360日龄鲜重遗传力为0.7740;(2)存活性状的遗传力大小为0.2748—0.3957,以父系半同胞组内相关法估计的幼虫15日龄、稚贝180日龄、幼贝360日龄存活率遗传力分别为0.1900、0.2939、0.4064;(3)产量是生长与存活的共同作用结果,360日龄产量的遗传力及以父系半同胞组内相关法估计的遗传力分别为0.6706、0.5018。从其生长相关性上看,幼虫期与稚贝期出现了微弱负向相关;除了幼虫期与幼贝期的壳高及产量,及其稚贝期与幼贝产量间无相关性以外;其它的两两生长性状间均为显著正相关。从存活与产量的相关性上看,无论是表型性状,还是遗传性状均出现了积极的正相关,以遗传相关为主。本研究为建立远缘杂交育种方法和策略提供必要的理论依据。     

酸碱粗提配合超声破碎法制取可溶性长牡蛎(Crassostrea gigas)黑色素的研究

虽然牡蛎黑色素已经提取鉴定成功,但因为大部分实验需要用到黑色素的水溶液,而天然黑色素不溶于水,致使天然长牡蛎(Crassostrea gigas)黑色素的功效验证工作难以开展。本课题组探究总结出一套有效方法,对可溶性长牡蛎黑色素进行制取。首先选用酸碱法,从黑色长牡蛎中提取出天然长牡蛎黑色素,将其溶于氢氧化钠溶液中,利用超声细胞破碎仪进行处理,用盐酸中和至中性,离心取上清并干燥后得到一种黑色可溶性固体;再将该黑色固体分别用激光粒度测试仪、红外光谱仪和紫外光谱扫描仪进行检验后,发现天然长牡蛎黑色素经过超声降解处理后,颗粒粒度大幅下降,其溶解性大幅提高。红外光谱则显示出1630nm左右有明显的峰值,说明超声降解处理并未破坏真黑色素吲哚环等官能团;紫外吸光图谱的比较则显示天然长牡蛎黑色素破碎后,吸收峰仍然出现在210nm左右,但吸收值明显升高,说明超声降解法可以将难溶于水的天然长牡蛎黑色素降解为可溶于水的小颗粒可溶性黑色素,从而提高了紫外吸收值。可溶性牡蛎黑色素的制备成功对推动牡蛎黑色素的功能研究具有重要意义。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)中ChIP-seq 方法的建立

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)作为研究DNA 结合蛋白与DNA 相互作用最有力的工具, 越 来越受到重视。但目前该技术在牡蛎等贝类中的应用尚未见相关报道。为了研究长牡蛎早期胚胎发 育过程中表观遗传信息的变化模式, 本文在长牡蛎胚胎中探索并建立了一套完整的染色质免疫共沉 淀方法, 构建了高质量的高通量测序文库, 首次获得了牡蛎全基因组水平的组蛋白H3K4me3 修饰分 布, 从而为研究牡蛎的表观遗传调控奠定了基础。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)与熊本牡蛎(C. sikamea)杂交的受精细胞学观察及子一代的生长比较

以长牡蛎和熊本牡蛎为材料,进行了4个组合的杂交和自交实验。利用DAPI染色观察了长牡蛎和熊本牡蛎正反杂交的受精卵在受精,减数分裂和早期卵裂过程中的核相变化。结果表明,在长牡蛎♀×熊本牡蛎♂正交组,熊本牡蛎精子进入长牡蛎卵子后,激活卵子完成2次减数分裂,同时,精核出现了两次明显的体积膨大扩散过程。但是,大部分受精卵不再继续进行胚胎发育。在熊本牡蛎♀×长牡蛎♂反交组中,受精卵内核行为的变化与正交组相同。正反交组的胚胎发育过程都具有明显的不同步现象。对各实验组子一代的生长和存活的研究结果表明,幼虫阶段,杂交后代的壳高、壳长均明显小于自交组;长牡蛎♀×长牡蛎♂自交组(GG)和熊本牡蛎♀×长牡蛎♂杂交组(SG)的存活率高于长牡蛎♀×熊本牡蛎♂杂交组(GS)和熊本牡蛎♀×熊本牡蛎♂自交组(SS)。稚贝和成贝阶段,杂交组子一代在壳高、壳长和存活率3个生长指标上均小于自交组。     

中国北方沿海竿虾虎鱼(Luciogobius guttatus)隐存多样性与群体历史动态

竿虾虎鱼(Luciogobius guttatus)隶属于拟虾虎鱼亚科(Gobionellinae),已知分布于中国沿海、朝鲜半岛和日本的岩基砾石质潮间带。日本学者发现竿虾虎鱼在日本沿海存在三个谱系,但在我国,针对竿虾虎鱼的研究仅限于形态测量和野外调查记录。基于线粒体DNA和核基因序列标记,本研究从系统发育和群体遗传两个角度,揭示竿虾虎鱼在我国北方沿海的隐存多样性与群体历史。结果表明,与日本分布的竿虾虎鱼对比,我国北方沿海分布的竿虾虎鱼存在以崂山为潜在屏障的偏南、偏北两个谱系,分别对应于日本沿海的谱系A和谱系C,缺少谱系B。本研究推测,末次冰期对竿虾虎鱼的有效种群扩张和群体的分化及扩散起到关键作用,且不同谱系对冰期气候变化的反应并不一致。本研究初步查明了中国北方沿海竿虾虎鱼的隐存多样性现状,为我国竿虾虎鱼的保护提供了分子依据。