香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)与长牡蛎(Crassostrea gigas)种间杂种遗传力评估

以平衡巢式设计(1长牡蛎♂:3香港牡蛎♀)构建的45个香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)×长牡蛎(Crassostrea gigas)种间杂交家系为材料,对其生长、存活及产量性状狭义遗传力进行了评估,并对其两两对应性状表型相关及遗传相关进行了分析。结果表明:(1)生长性状的遗传力大小为0.6207—0.8785,以父系半同胞组内相关法估计的幼虫15日龄、稚贝180日龄、幼贝360日龄壳高遗传力分别为0.6355、0.4828、0.5787,其360日龄鲜重遗传力为0.7740;(2)存活性状的遗传力大小为0.2748—0.3957,以父系半同胞组内相关法估计的幼虫15日龄、稚贝180日龄、幼贝360日龄存活率遗传力分别为0.1900、0.2939、0.4064;(3)产量是生长与存活的共同作用结果,360日龄产量的遗传力及以父系半同胞组内相关法估计的遗传力分别为0.6706、0.5018。从其生长相关性上看,幼虫期与稚贝期出现了微弱负向相关;除了幼虫期与幼贝期的壳高及产量,及其稚贝期与幼贝产量间无相关性以外;其它的两两生长性状间均为显著正相关。从存活与产量的相关性上看,无论是表型性状,还是遗传性状均出现了积极的正相关,以遗传相关为主。本研究为建立远缘杂交育种方法和策略提供必要的理论依据。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)与熊本牡蛎(C. sikamea)杂交的受精细胞学观察及子一代的生长比较

以长牡蛎和熊本牡蛎为材料,进行了4个组合的杂交和自交实验。利用DAPI染色观察了长牡蛎和熊本牡蛎正反杂交的受精卵在受精,减数分裂和早期卵裂过程中的核相变化。结果表明,在长牡蛎♀×熊本牡蛎♂正交组,熊本牡蛎精子进入长牡蛎卵子后,激活卵子完成2次减数分裂,同时,精核出现了两次明显的体积膨大扩散过程。但是,大部分受精卵不再继续进行胚胎发育。在熊本牡蛎♀×长牡蛎♂反交组中,受精卵内核行为的变化与正交组相同。正反交组的胚胎发育过程都具有明显的不同步现象。对各实验组子一代的生长和存活的研究结果表明,幼虫阶段,杂交后代的壳高、壳长均明显小于自交组;长牡蛎♀×长牡蛎♂自交组(GG)和熊本牡蛎♀×长牡蛎♂杂交组(SG)的存活率高于长牡蛎♀×熊本牡蛎♂杂交组(GS)和熊本牡蛎♀×熊本牡蛎♂自交组(SS)。稚贝和成贝阶段,杂交组子一代在壳高、壳长和存活率3个生长指标上均小于自交组。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)17个EST-SNP标记的开发

利用长牡蛎已有的EST序列数据库,筛选得到候选SNP位点共计1140个。根据候选SNP位点共设计引物82组,通过片段长度差异等位基因特异性PCR(fragment length discrepant allele specific PCR,FLDAS-PCR)的分型方法,在一野生群体中进行检测和验证,结果共有17个SNP候选位点显示多态性。研究结果表明,通过基于EST数据库的SNP开发,可以有效弥补某些海洋生物因基因组学滞后影响SNP标记开发的现状。     

两个地理群体香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)杂交子代早期生长发育的杂种优势研究

为探讨不同地理群体香港牡蛎的杂种优势,于2014年5月开展了广东珠海(Z,生长快)和广西茅尾海(M,抗逆性强)群体间的2×2双列杂交,比较了各实验组早期生长、存活优势,并计算了各阶段的杂种优势,实验由2个杂交组MZ(M♀×Z♂)、ZM(Z♀×M♂)和2个自交组MM(M♀×M♂)、ZZ(Z♀×Z♂)组成。结果表明:浮游期间,正交组(MZ)幼虫在9日龄前未表现出生长优势,但表现出一定的存活优势,幼虫大小存在显著的母本效应;12日龄时正交杂种优势5.34。反交组(ZM)幼虫生长和存活都表现出了正杂种优势,但生长优势值逐渐减小,到了12日龄时壳高与自繁组(ZZ)幼虫间差异不显著(P0.05)。室内苗种培育阶段,杂交稚贝表现出明显的生长、存活优势,正交组(MZ)和反交组(ZM)子代的生长优势分别为7.86±3.12、17.47±13.14;存活优势分别为8.33±1.41、2.86±1.08。以上结果说明两个群体香港牡蛎杂交可以产生杂种优势,可为牡蛎杂种优势开发利用提供参考。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)两个Dmrt家族基因的时空表达

本文以长牡蛎27个幼虫发育阶段个体以及成体的5个组织织作为实验材料,采用实时荧光定量PCR技术对其Dmrt家族中的2个基因(CgDsx和CgDmrtA2)的表达模式以及在性别决定中的作用进行了研究。结果表明,长牡蛎CgDsx基因在胚胎发育初期有大量表达,从囊胚期到担轮幼虫初期表达量最高,之后表达量开始降低,在D形幼虫后一直维持在极低的表达水平,此后仅在成体的雄性性腺中具有高度表达。由此可见,CgDsx可能也对早期胚胎发育起一定调控作用,同时参与了性别决定。CgDmrtA2在长牡蛎所有组织中均有表达,各组织间表达差异不显著,在D形幼虫至壳顶后期表达量较高,说明它参与了胚胎中后期的发育过程,可能与神经的形成相关,但是其具体功能还需要进一步研究。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)Wnt4基因cDNA克隆与表达分析

Wnt4作为Wnt基因家族的重要成员,在动物的生长发育过程中起重要调控作用。本文利用RACE技术克隆了长牡蛎Wnt4基因c DNA全长序列,该序列全长1999bp,开放阅读框为1068bp,编码355个氨基酸,该蛋白序列与人(Homo sapiens)、沙蚕(Platynereis dumerilii)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)Wnt4蛋白的相似性分别为44%、48%和46%。通过荧光定量RT-PCR分析长牡蛎Wnt4基因在成体不同组织和不同发育阶段的表达情况,发现长牡蛎的Wnt4基因具有广泛的组织表达特点,在所检测的多种组织中(外套膜、鳃、唇瓣、消化腺、雄性性腺、雌性性腺)均有表达,推测长牡蛎的Wnt4以信号分子的形式参与多种组织细胞的生命过程;长牡蛎个体发育过程中Wnt4基因的高表达主要集中在胚胎发育的早期(桑葚期最高,原肠胚期次之),幼贝期该基因的表达量很低,说明Wnt4基因可能在早期发育阶段参与了某些器官的形成。     

长牡蛎不同地理群体选育系数量性状的比较

在长牡蛎的选择育种工作中,为了查明不同地理群体间重要数量性状的差异,利用方差分析、协方差分析和列联表分析等统计方法对长牡蛎中国、日本、韩国3个地理群体快速生长选育系F2代的生长性状、壳型指数和颜色性状进行了比较分析。结果表明,利用协方差分析对个体大小进行校正后的数据分析结果与原数据的分析结果基本相同,不同群体间的主要数量性状差异显著。生长方面,日本群体的壳高和总质量显著大于中、韩群体,表明日本群体具有明显的生长优势;壳型指数方面,中国和韩国群体间无显著差异,日本群体壳型指数C显著高于中、韩群体,其余壳型指数均低于中、韩群体;颜色性状方面,不同群体的左壳、外套膜和闭壳肌痕的着色程度差异均极显著,左壳的着色程度依次为,韩国群体>日本群体>中国群体,外套膜和闭壳肌痕的着色程度均依次为,日本群体>中国群体>韩国群体。不同群体间数量性状的显著差异为进一步开展长牡蛎杂交育种以及特色育种研究提供了良好的素材。     

长牡蛎不同地理群体选育系数量性状的比较

在长牡蛎的选择育种工作中,为了查明不同地理群体间重要数量性状的差异,利用方差分析、协方差分析和列联表分析等统计方法对长牡蛎中国、日本、韩国3个地理群体快速生长选育系F2代的生长性状、壳型指数和颜色性状进行了比较分析.结果表明,利用协方差分析对个体大小进行校正后的数据分析结果与原数据的分析结果基本相同,不同群体间的主要数量性状差异显著.生长方面,日本群体的壳高和总质量显著大于中、韩群体,表明日本群体具有明显的生长优势;壳型指数方面,中国和韩国群体间无显著差异,日本群体壳型指数C显著高于中、韩群体,其余壳型指数均低于中、韩群体;颜色性状方面,不同群体的左壳、外套膜和闭壳肌痕的着色程度差异均极显著,左壳的着色程度依次为,韩国群体＞日本群体＞中国群体,外套膜和闭壳肌痕的着色程度均依次为,日本群体＞中国群体＞韩国群体.不同群体间数量性状的显著差异为进一步开展长牡蛎杂交育种以及特色育种研究提供了良好的素材.     

长牡蛎中国群体与日本群体杂交子一代的生长和存活比较

以中国长牡蛎(C)和日本长牡蛎(J)为材料,进行了4个组合的杂交和自交实验,分析了各实验组受精率、孵化率,幼虫和稚贝的生长、存活以及杂交子代的杂种优势。结果表明,自交组的受精率介于杂交组之间,但是经单因素方差分析表明没有显著性差异; JJ组的孵化率最高,其次是JC和CC组, CJ组的孵化率最低,相同卵子来源的组合在孵化率上无显著差异。JJ组在幼虫期和稚贝期、养成期的壳高、壳长平均值均大于其他三组; JC组在幼虫期和稚贝期、养成期的壳高、壳长仅次于JJ组,其壳高、壳长和存活率杂种优势率均较为明显; CJ组的杂种优势率在幼虫期和稚贝养成期的各个生长性状上都表现为负值。杂交子一代中存在正交和反交结果不同的现象可能与母性效应、遗传因素和环境等因素有关。     

长牡蛎生长性状的遗传效应及与环境互作分析

利用遗传模型分析方法,对长牡蛎生长性状的遗传效应及其与环境互作效应进行研究。结果表明,壳长、壳宽和总重3个性状主要受显性效应控制,显性方差占表型方差的比例分别为0.31、0.23、0.36;壳高性状主要受显性-环境互作效应控制,显性-环境互作方差占表型方差的比例为0.37。4个性状中,壳高的加性效应作用较大,狭义遗传力达到0.10,表明以壳高为目标性状进行选育较容易。但由于总遗传力中互作广义遗传力大于广义遗传力,因此在选育过程中需考虑环境的影响。从遗传效应预测值看,中国和韩国群体杂交子代的效应值最大,表明这2个种群杂交易获得生长性状的杂种优势。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)鲜样组织八种成分含量近红外(NIR)模型的建立

采用傅里叶变换近红外(FT-NIR)光谱技术,以94份具有代表性的长牡蛎鲜样组织样本的近红外(NIR)数据和其对应的化学真实值数据为基础,研究了NIR技术预测长牡蛎鲜样组织中水分、糖原、总蛋白质、总脂肪、锌、硒、牛磺酸和灰分8种成分含量的可行性,通过偏最小二乘回归法(PLS)建立了以上8种成分的NIR分析模型,并对模型进行了交互验证和外部验证。结果显示:该实验所建立的长牡蛎鲜样组织肉质性状8项主要指标中水分、糖原和总蛋白质3种成分的NIR模型具有良好的准确性和预测能力,建模集相关系数(RC)为0.9625—0.9902,交互验证相关系数(RCV)为0.9342—0.9863,外部验证的相关系数(REV)为0.9734—0.9915;但总脂肪、锌、硒、牛磺酸和灰分含量的建模效果不佳。实验结果表明,可以运用NIR技术快速、大批量地分析长牡蛎鲜样组织中的水分、糖原和总蛋白质3种成分含量;分析过程无需使用化学试剂,实验成本低,且对环境无污染。长牡蛎NIR多种成分含量模型的建立,对开展长牡蛎肉质分析、肉质性状选育、育种世代的鉴定及种质资源评价都有非常重要的意义。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)野生与选育群体的微卫星遗传多样性分析

为了评估长牡蛎(Crassostrea gigas) 2个壳长性状(掌心形)快速生长选育群体(LY2-K4、LY2-K7)、1个壳高性状(速生型)快速生长选育群体(LY2-K11)和6个野生群体(QHD、LS、HD、ZH、WD、KTD)的遗传多样性和遗传结构, 用21对多态性丰富的微卫星引物对9个长牡蛎群体的269个个体进行了遗传分析。结果显示: 21个微卫星位点共检测出了460个等位基因(N_a),平均等位基因数为21.905; 21个微卫星位点的多态信息含量(PIC)均大于0.5, 具有高度遗传多态性; 选育群体LY2-K11的遗传多样性最低(N_a=13, I=2.128,H_e=0.831, PIC=0.825), 野生群体KTD的遗传多样性最高(N_a=29,I=3.112, H_e=0.941, PIC=0. 938); 189个群体位点组合有66%偏离哈代-温伯格平衡, 表明这些群体存在一定程度的杂合子缺失; 9个群体间的遗传分化指数(F_st)为0.012~0.064, 处于较低的遗传分化水平; AMOVA分析显示遗传变异主要来自于个体内; PCoA分析结果与UPGMA聚类树一致, LY2-K11群体单独聚为一类, QHD和HD群体聚为一类, 其他6个群体聚为一类。综上所述, 长牡蛎3个选育群体和6个野生群体遗传多样性均较高, 遗传分化水平较低; 选育群体LY2-K11多样性略有下降, 选育过程中应保证亲本的数量及质量, 防止因近交衰退造成遗传多样性降低, 苗种抗逆性变差。该结果将为长牡蛎新品种的选育和野生种质资源的保护提供科学指导。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)多代近交与自交家系遗传差异及生长性状比较

在良种选育过程中,为了尽快得到稳定可遗传的优良性状,常采用近交方式进行纯系选育,而近交会导致群体的遗传多样性下降。为了解长牡蛎(Crassostrea gigas)多代近交和自交家系的遗传多样性、遗传结构和生长情况,本实验选用长牡蛎近交4代(F4代)、近交5代(F5代)家系和雌性同体自交1代(自交1代)家系,采用8对多态性高的微卫星序列进行分析,同时对其成体的三个时间点生长数据进行了显著性差异分析。实验结果表明,8对微卫星位点在野生对照组中表现出较高的多态性,F4代、F5代和自交1代3个家系的遗传多样性明显下降,平均等位基因数(Na)由17.00下降到2.00,平均观测杂合度(Ho)由0.538下降到0.449,平均多态信息含量(PIC)由0.826下降到0.297;哈迪-温伯格平衡(HWE)检验结果显示,8个位点在三个家系和野生对照组中均不同程度偏离HWE平衡(P0.0062)。F4代、F5代、自交1代和野生对照的生长性状指标分析表明,和野生对照相比,三个家系生长指标明显提高,对于自交一代而言,与自交实验组亲本选择的偶然性有关。同时,三个家系三个时间点的壳长、壳宽生长性状没有显著性差异(除330日龄壳宽和630日龄壳长),F5代生长性状指标壳高和湿重均大于F4代和自交1代,且差异显著;但F4代和自交1代之间没有显著性差异。通过本研究发现,F5代可以继续用来进行生长性状新品系的选育,自交1代多样性降低程度相当于F5代,但多样性的降低对成体的生长性状影响不明显,仍可以用做相关实验材料。     

长牡蛎和紫贻贝对浒苔微观繁殖体生物控制的可行性研究

近年来我国绿潮灾害频发,滤食性贝类对浒苔的生物防控是潜在的防控策略之一。本研究基于实验室内可控实验,探究了长牡蛎(Crassostreagigas)和紫贻贝(Mytilusedulis)对浒苔微观繁殖体的滤食作用,并在江苏如东紫菜养殖区进行了长牡蛎和紫贻贝离底式平挂养殖试验。室内滤除实验结果表明,牡蛎和贻贝均可有效截留浒苔微观繁殖体,平均截留速率分别为6892和1589ind/(ind·h),部分被截留的颗粒失去萌发活性,有效滤除速率为3980和574ind/(ind·h)。现场养殖实验结果表明,长牡蛎和紫贻贝可在紫菜养殖区生长存活,每天约能滤除水体中63.7万个浒苔微观繁殖体。研究证实了两种贝类对微观繁殖体的有效滤除能力及江苏浅滩进行牡蛎和贻贝养殖的可行性。养殖方式的进一步的优化改进,以及研究江苏浅滩其他滩涂贝类对浒苔的防控潜力,还需进一步深入开展。     

熊本牡蛎(Crassostrea sikamea)多嵴和无嵴品系子二代生长性状的选择效应

为了进一步检查熊本牡蛎(Crassostrea sikamea)多嵴品系及无嵴品系的连续选择反应能力,以两个品系子一代上选组为材料,以壳高为指标,按照10%选择强度,开展了两个品系子二代混合上选研究,评估了两个品系子二代选择反应、现实遗传力,计算了两个品系的遗传改进量。结果表明:两个品系仍具有较高的现实遗传力,多嵴品系遗传参数均大于无嵴品系,表现出较好的遗传改良效果。多嵴和无嵴品系幼虫期的选择反应分别为0.47、0.34,稚贝期为0.65、0.40,养成期为0.82、0.56;幼虫期的现实遗传力分别为0.27、0.19,稚贝期为0.37、0.23,养成期为0.47、0.32;幼虫期的遗传改进量分别为4.83%、3.61%,稚贝期为7.55%、5.76%,养成期为9.95%、6.47%。经过一周年的养成,多嵴品系壳高显著大于无嵴品系,两个品系现实遗传力分别为0.50、0.35,遗传改进量分别为10.13%、6.61%。由此可见,多嵴品系具有较快的生长速度,遗传改良潜力较大。本研究为熊本牡蛎遗传改良和新品系培育奠定了坚实的基础。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)黑色壳表面微生物多样性的研究

为探究自然海区与室内养殖环境对软体动物壳色及壳表面细菌群落多样性的影响，以黑色壳长牡蛎（Crassostrea gigas）为研究对象，在自然海区与室内环境分别暂养30 d后，对长牡蛎的壳色及壳表面细菌群落的多样性和差异细菌功能进行分析。结果表明，室内养殖的黑壳长牡蛎出现较为明显的壳褪色现象，其黑色素含量显著下降，远低于自然海区养殖的黑壳长牡蛎。16S rRNA基因测序结果显示，变形杆菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝细菌（Cyanobacteria）为长牡蛎壳表面的主要优势菌，其中变形杆菌的丰度超过50%。在门水平上，放线菌（Actinobacteria）、俭菌超门（Parcubateria）和Bacterial rice cluster 1（BRC1）在室内、外养殖长牡蛎之间存在较为显著的差异（P<0.05），而具有降解作用的放线菌和俭菌超门细菌在室内养殖的黑壳长牡蛎壳表面丰度较高。在属水平上，两组之间存在显著差异的细菌共计67种。该研究揭示了不同生境条件下，黑壳长牡蛎壳表面的微生物群落物种组成及差异，为解析长牡蛎壳色的形成机制提供了新的分析视角。     

基于RNA-seq数据分析长牡蛎(Crassostrea gigas)天然免疫的可变剪接事件

大部分无脊椎动物缺乏基于经典抗体和记忆细胞的适应性免疫, 因而天然免疫在无脊椎动物免疫防御中发挥不可或缺的作用。可变剪接正是产生天然免疫多样性和特异性的重要途径。牡蛎(Crassostrea)是全球范围内的大宗养殖贝类和我国产量最高的海水养殖贝类, 理解其天然免疫系统的多样性和特异性对牡蛎病害防治和养殖业健康可持续发展至关重要。通过对不同病原诱导以及诱导后不同时间的转录组进行生物信息分析, 系统地研究了长牡蛎天然免疫应激反应的可变剪接事件。发现在弧菌诱导下可变剪接事件的总数显著增加, 表明弧菌的感染会诱导长牡蛎可变剪接事件的产生。对病原诱导后可变剪接体的组成类型及表达量显著变化的基因的功能富集分析, 表明免疫系统相关功能被显著富集, 病原感染不同阶段以及不同病原感染后可变剪接体的组成类型和表达量均不一致, 表明长牡蛎免疫系统可通过可变剪接产生免疫响应的特异性和多样性。研究结果为长牡蛎等无脊椎动物天然免疫多样性和特异性提供了典型实例, 也为长牡蛎病害防御提供了理论支撑。