刺激隐核虫生活史的光镜观察

本文对寄生于海水硬骨鱼体表组织的纤毛虫刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)的生活史进行了描述。该寄生虫生活史分3个阶段,即滋养体,包囊体和幼虫。滋养体主要营寄生生活。成熟的滋养体离开宿主后,在数小时内就发育成包囊体。包囊体的特点是具多层结构的囊壁,而且此阶段虫体的繁殖方式为不等分裂。每个成熟的包囊平均可形成273±64个幼虫。由于囊壁坚硬,幼虫游离后,包囊壁仍保持原样。进入水体的幼虫游动极快,不摄食,一旦遇到合适的宿主即侵入,并在宿主体内发育成滋养体。文中还将结果与淡水多子小瓜虫生活史进行了比较。     

海水鱼类寄生虫刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)趋化性研究

应用本实验室建立的趋化模型对海水鱼类寄生虫刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的趋化特性进行研究。结果显示, 刺激隐核虫幼虫在30min时趋化达到饱和, 在温度28℃时趋化率达到最高; 多种硬骨鱼的血清与粘液对刺激隐核虫的幼虫都有着强烈的吸引作用, 刺激隐核虫幼虫对碳水化合物、氨基酸等小分子物质没有趋化作用; 在组织匀浆液中, 刺激隐核虫幼虫对肌肉匀浆液有一定的趋化作用, 对肝、肠、胃的匀浆液都没有趋化作用; 感染后鱼类血清对刺激隐核虫的幼虫有着更加强烈的吸引作用(P<0.01); 18种中草药中的五倍子、大黄、槟榔、苦楝、虎杖、贯众等6种中药草对刺激隐核虫的幼虫有一定的驱虫作用。本文的研究结果有助于深化对刺激隐核虫致病性的认识并对“白点病”的防治有一定的参考价值。     

刺激隐核虫ADP/ATP 载体蛋白基因的克隆和分子特征分析

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是严重危害海水鱼类的寄生纤毛虫,为了对其进行分子水平的研究,采用SMART技术构建了刺激隐核虫滋养体期的cDNA文库,并随机挑取克隆做EST测序,获得大量克隆的基因。从中挑选ATP/ADP载体蛋白基因同源物(CiAAC)的克隆进一步测序获得全长的cDNA序列。该序列全长为1029bp,包含编码287个氨基酸的开放阅读框。用RT-PCR分析了其在刺激隐核虫各时期的表达情况,并应用生物信息学分析方法,对CiAAC基因进行不同物种的系统进化树分析、功能区分析、物理性质分析、疏水性分析、跨膜结构域预测、亚细胞定位、二级结构预测等等。结果表明:CiAAC蛋白在刺激隐核虫各时期均有表达;据预测,它为六次跨膜蛋白,与卵形肠虫(Nyctotherus ovalis)的ADP/ATP载体蛋白的同源性最高,相似性达65%;蛋白为疏水性,并定位于刺激隐核虫的细胞质中。随后实验中通过对基因的定点诱变,将纤毛虫的非通用密码进行改造后,构建了pGEX-4T-1/CiAAC表达载体。以上实验为病原生物刺激隐核虫CiAAC载体蛋白的研究及应用提供了基础资料。     

羟基自由基快速杀灭刺激隐核虫及其对大黄鱼肠道结构的影响

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的大规模暴发严重危及大黄鱼养殖业的健康发展,造成重大经济损失。在福建省宁德市三都澳海域大黄鱼(Larimichthys crocea)养殖基地,采用大气压强电离放电高效生成的羟基自由基(·OH)溶液输入到海水管路中,快速(0.53 mg/L, 6 s)杀灭(100%)刺激隐核虫,再排入净水池中储存作为大黄鱼的养殖水。经·OH处理后的海水养殖大黄鱼,鱼肠道组织结构完整、肠绒毛长且密,大黄鱼存活率100%;净水池养殖用水中弧菌、总大肠菌群、耐热大肠菌群均未检出,且细菌总数为0 CFU/mL,水质符合《海水水质标准》第二类标准,三溴甲烷含量为7.84μg/L,远低于《生活饮用水卫生标准》的限值100μg/L,溴酸盐、三氯甲烷等均未检出,海洋生态安全。     

复方中草药对小丑鱼非特异性免疫、消化酶活性的影响及对刺激隐核虫杀灭效果分析

刺激隐核虫寄生感染引起的“白点病”不仅危害水族箱观赏鱼类,还会对水族馆大水体海水观赏鱼带来毁灭性打击,是海水观赏鱼养殖业危害最为严重的病害之一。本研究探讨了在基础饲料中添加不同剂量复方中草药“XCY-1”(苦参、地肤子、蛇床子、黄芪、甘草等按一定比例混合,超微粉碎后收集备用)对小丑鱼血清、肝脏中非特异性免疫指标和肠道消化酶活性指标变化及不同用药方式对防治刺激隐核虫病的效果。研究结果显示,投喂复方中草药“XCY-1”可使小丑鱼血清中溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP),肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)活性均呈现先升后降趋势,第21 d各项非特异性免疫指标达到最高值,其中20 g/kg剂量组效果最好,能显著提高小丑鱼的免疫能力;肠道中淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)和胰蛋白酶在各取样点活性均高于对照组,20 g/kg剂量组在各取样点胰蛋白酶和AMS活性高于其他剂量组,20 g/kg和40 g/kg剂量组在各取样点LPS活性最高。复方中草药“XCY-1”药浴对刺激隐核虫幼虫的体外杀灭结果显示:4 h内,50 mg/L药物浓度即对刺激隐核虫幼虫具有一定的杀灭效果,400 mg/L药物浓度即可杀灭全部幼虫;当药物浓度达到800 mg/L时,3 h内幼虫全部死亡。不同用药方式防治小丑鱼刺激隐核虫病:实验分为4组,A组20 g/kg剂量组,口服无药浴;B组20 g/kg剂量组,口服且同时按50 mg/L进行药浴;C组20 g/kg剂量组,口服且同时按100 mg/L进行药浴;D组为对照组,仅投喂基础饲料。结果显示:实验第6 d,A、B、C三个药物组与对照组的存活率分别为:51.1%、53.3%、57.7%、0,药物组存活率显著高于对照组(P＜0.05);三个药物处理组每片鳃上仅有0~2个滋养体,对照组每片鳃上滋养体数量是用药组65倍。综上所述,饲料中添加复方中草药“XCY-1”可以提升小丑鱼血清、肝脏非特异性免疫指标和肠道消化酶活性,对刺激隐核虫病起到积极的预防和治疗效果。20 g/kg剂量组、投喂时间14~21 d时效果最佳。该研究为开发无公害、环保型天然植物源杀虫药提供理论参考和技术支撑。     

刺激隐核虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子特征

从刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)滋养体/包囊前体c DNA文库中筛选出了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Ci GAPDH),定点诱变Ci GAPDH基因开放阅读框内的非通用密码子后,构建其原核表达载体p GEX-4T-3/Ci GAPDH,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基硫式-B-D-半乳糖苷诱导表达,结果大肠杆菌成功表达了r Ci GAPDH蛋白。用抗r Ci GAPDH蛋白的鼠血清进行免疫印迹分析,结果抗血清能够识别刺激隐核虫各期虫体的天然Ci GAPDH蛋白,其表观分子质量为37.3 ku,与根据氨基酸序列推算的理论值相符;实验表明r Ci GAPDH蛋白具有很好的免疫原性,而且Ci GAPDH在生活史的各阶段均有表达,符合持家基因的特征。利用间接免疫荧光抗体实验(IFAT)检测天然Ci GAPDH蛋白在刺激隐核虫幼虫上的定位,结果表明天然Ci GAPDH蛋白主要分布在幼虫的细胞质内,且在胞口位置分布最多。对Ci GAPDH的进一步研究可能为刺激隐核虫感染的药物靶点的寻找多条线索。     

大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的抗菌和抗寄生虫活性分析

近年来,我国重要经济鱼类大黄鱼（Larimichthys crocea）遭受了严重的海水白点病的感染,造成了巨大的经济损失。海水白点病是由体外寄生虫刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染引起,不仅能引起被感染鱼类生理的破坏,还能够引发二次细菌感染。有报道指出一些抗菌肽（antimicrobial peptides）具有抗刺激隐核虫的活性。大黄鱼hepcidin-like（命名为Lc-HepL）是从刺激隐核虫感染大黄鱼后的比较转录组中挖掘到的一个差异表达基因。本研究中,在基因和蛋白水平上分析了该抗菌肽的生物活性。刺激隐核虫感染后,qRT-PCR检测到Lc-HepL在鳃、肌肉、肝脏、头肾、肠道和脾脏6种组织中显著上调,并且上调的时间点出现在幼虫感染阶段、滋养体脱落阶段和二次细菌感染阶段,结果显示Lc-HepL在抗刺激隐核虫和二次细菌感染的免疫反应中发挥重要作用。在体外成功诱导并纯化的重组Lc-HepL（rLc-HepL）对某些病原菌具有剂量和时间依赖性的强抗菌活性。本研究首次探究了rLc-HepL的抗刺激隐核虫活性,显微观察结果显示其能引起幼虫细胞膜破裂、内容物外泄,该结果首次提供了大黄鱼hepcidin-like具有强抗刺激隐核虫活性证据。研究数据表Lc-HepL很可能是大黄鱼抗刺激隐核虫感染的一种重要的先天免疫因子,具有应用到未来的药物中的潜力。     

大黄鱼cGAS-like基因isofrom X1的克隆鉴定及在感染刺激隐核虫后的表达变化

cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)基因是近几年来新发现的先天免疫中一个新型的信号分子。作者基于大黄鱼(Larimichthys crocea)基因组信息,用cDNA末端快速扩增(RACE)技术在鳃组织中克隆鉴定了cGAS基因cDNA全长序列:包含1个231 bp的5′端-非翻译区(5′-UTR)、207 bp的3′-UTR和1 488 bp的开放阅读框(ORF),命名为Lc-cGAS-like X1。该基因编码1个由495个氨基酸残基组成的多肽,预测的分子量(Mw)大小为56.57kDa,理论等电点(pI)为9.45;序列分析表明其预测的蛋白无信号肽,第115～431位氨基酸序列为Mab-21功能域,第470～492位氨基酸序列为跨膜结构域。基因组全长3 153 bp,包含8个外显子和7个内含子,所有内含子的剪切特点都符合GT-AG规则。同源比对结果显示:Lc-cGAS-likeX1与鱼类cGAS的相似性大于66%,与高等脊椎动物的相似性较低。系统进化分析表明Lc-cGAS-like X1与鱼类cGAS聚成一支。荧光定量PCR(qPCR)检测显示Lc-cGAS基因(X1/X2两种剪切体)在大黄鱼9种组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高;刺激隐核虫感染后,大黄鱼免疫器官头肾中Lc-cGASmRNA分别在刺激隐核虫幼虫感染阶段和滋养体脱落阶段出现了极显著上调(P0.01);解毒器官肝脏中分别在滋养体脱落阶段和细菌感染阶段出现极显著上调变化(P0.01)。本研究结果暗示大黄鱼cGAS基因参与了大黄鱼感染刺激隐核虫的免疫防御过程,为进一步了解鱼类cGAS基因的多样化功能提供参考。     

宽口虫(Steinia sp.)无性生殖周期中核器和纤毛器的演化

利用改进的蛋白银染色法，研究了宽四虫（Steiiniasp．）的形态及其无性生殖周期中核器和纤毛器的发育演化过程。其发生过程为：1．大核改组带出现后，口原基出现在老口围带后方之腹棘毛左侧，其内的毛基体组装成整齐排列的小膜，构成新AZM，老AZM后部也发生部分更新的现象。2．颇腹根棘毛原基各5列，分别以3：3。3：4：3方式分化成前、后仔虫的额、腹、横棘毛。3．在第1－3列背触毛中，分别于前、后仔虫的中部范围产生第1—3列新原基，每列原基向两端伸展替代老背触毛列，成为前、后仔虫相应的第一列新背触毛。4．在前后第3列背触毛原基后端发生前、后第4列原基，它稍偏向第3列原基的右侧，向前伸展成第4列背触毛；在虫体腹面，前、后右缘棘毛原基的前方出现第5、6列背触毛原基，后发育为第5、6列背触毛，在虫体演化过程中转位到背面。     

臂轮凹口虫新种及其生活史的研究

于1979年7月在武昌中国科学院水生生物研究所湖汊采集水草,经研究发现须根上栖息的轮虫体内有一种专门攻击萼花臂尾轮虫和双棘臂尾轮虫的凹口虫,经鉴定系一新种,其主要特征为,传布子长椭圆形,两端较尖小,中间稍微凹;体前方有锥形的钻孔器,后端有3—5根长尾毛;大核香肠状,小核一个,椭圆形,伸缩泡一个,居中偏后。营养子圆球形,直径78—141μm,大核肾形,小核和伸缩泡各一个,亦具尾毛;裂子数为2—32个。寄生。致死轮虫,并在轮虫躯壳内完成其生活史。能形成次级包囊和抵抗性包囊。     

隐妇蚌虫属现生种的分类学研究(甲壳门:介甲目,蚌壳虫科)(英文)

本文以检索表的形式记述了甲壳动物门介甲目蚌壳虫科隐妇蚌虫属的17个现生种。对其中的1个新种石泉隐妇蚌虫Caenestheria shiquanica sp.nov.进行了形态特征描述。列表比较了近似种川候隐妇蚌虫C.Kawamurai(Ueno,1940)Hu,1988与新种的主要形态区别特征。文中附有亚洲产的12种隐妇蚌虫的形态图58幅。     

双核平腹虫(新种)的研究及平腹虫属的修订

于1991年4,5月在山东潍坊一对虾育苗池中发现一小型盾纤目纤毛虫,经鉴定确定为一新种——双核平腹虫Homalogastra binucleata nov. sp.。借助各银染法及生物统计学方法对其分类及形态学特征作了描述。新种的特点为:体呈倒梨形;胞口位于体后半部;约16列体纤毛,其第n列贯穿尾极后交于背方第8,9列纤毛间;具独特的两个大核。鉴于该属系国内首次报道,同时由于迄今对本属描述所存在的混乱,文中另对平腹虫属的定义、系统地位及与相近种属的关系做了补充和探讨,将其同物异名圆尾虫属(Urocyclon)并入本属并由此建立起两个新组合Homalogastra filificum nov. comb., H. chesapeakensis nov. comb.。     

寡毛双眉虫无性生殖期间的皮膜演化和细胞发生学

于１９９１年６月在青岛海区采集到一腹毛目纤毛虫,寡毛双眉虫。应用蛋白银技术研究了其无性生殖期间的细胞发生学,其特征为：１）ＡＺＭ原基独立地出现于远离模棘毛的前方而非紧靠老的横棘毛附近;２）口棘毛并非来自第一ＦＶＴ原基（在后仔虫）,而是由ＵＭ原基分化而来;３）老的ＡＺＭ将发生后半群的局部重建而非整个地由前仔虫简单继承。     

四种贝类和鱼类外寄生车轮虫的国内新纪录

车轮虫是一类主要寄生于贝类和鱼类体表的缘毛类纤毛虫原生动物。本文对分别寄生于海洋贝类－－虾夷扇贝Mizuhopecten yessoensis,半咸水鱼类－－鲻鱼Mugil cephalus和双色鳗鲡Anguilla bicolor bicolor,以及淡水鱼类－－光唇鱼Acrossocheilus fasciatus鳃表和体表的虾夷扇贝车轮虫Trichodina pectenis,亚卓车轮虫T.jadranica,急尖车轮虫T.acuta和喙状车轮虫T.rostrata,进行了详细的分类学研究。本文第一次报道了虾夷扇贝车轮虫的活体和蛋白银染色后特征,该虫体也是国内新记录种。其它三个车轮虫物种感染的鱼类,均属新纪录宿主。同时,也报道了这四种车轮虫对宿主的感染率和感染强度。     

鲈鱼的鳃寄生车轮虫病及扫描电镜观察

报道鲈鱼的鳃寄生车轮虫病及病理组织的扫描电镜观察。病原鉴定为 :直钩车轮虫、杜氏车轮虫、日本车轮虫、劳牧小车轮虫及简单两分虫 5种车轮虫科纤毛虫 ,其中数量上占优势的为直钩车轮虫。扫描电镜观察结果表明 ,鳃寄生车轮虫可对宿主的上皮组织产生明显的机械性损伤并造成鳃丝粘液分泌增多及炎症反应。文中就海水养殖鱼类及野生鱼类由车轮虫寄生造成的危害及防治途径做了探讨。     

移动粒子半隐式法中核函数适用性研究

研究了移动粒子半隐式法(MPS法)中核函数的特性。选取溃坝、晃荡和船舶横剖面横摇分别作为不具有边界速度、具有一维边界速度和具有二维边界速度模拟的代表,研究了MPS法中常见五种核函数在上述三种速度边界条件模拟中的适用性。结果表明,在核函数的作用力范围边界时,要求提供适中的作用力,较大的作用力会导致模拟的失败;提供适中作用力的核函数适合于具有一维边界速度的模拟,而提供较小作用力的核函数适合于具有二维边界速度的模拟。     

敏捷瘦体虫(Urosomoida agiliformis FOISSNER,1982)无性生殖期间的形态发生研究(原生动物,纤毛虫)

敏捷瘦体虫（UrosomoidaagiliformisFOISSNER，1982）为小型腹毛目纤毛虫。利用银染法对该种二分裂期间的形态发生学进行初步研究，指出该虫形态发生的主要过程为：1．伴随大核改组带的出现，口原基发生于老口围带的下方，后演化为后仔虫的口围带。在前仔虫，老口围带及口侧膜完全保留并被继承；2．体棘毛场首先出现后一组棘毛原基，后形成前棘毛场，随后各自独立演化成前后仔虫的8：3／4：2／3模式的额-腹-横棘毛；3．在背触毛中，分别于前、后仔虫的中部产生前、后3列新原基，每列原基向其两端伸展替代老背触毛列，成为前、后仔虫相应的3列新触毛；接着，在右缘棘毛原基右前端发生前、后第4列背触毛。     

扇贝外寄生车轮虫（Trichodina jadranica Raabe，1958）的形态学研究 （原生动物：纤毛门：缘毛目）

采用Ｗｉｌｂｅｒｔ蛋白银法及Ｃｈａｔｔｏｎ—Ｌｗｏｆｆ银浸法对一种附生于栉孔扇贝鳃丝上的寄生车轮虫进行了光镜水平下的研究。依据其形态学和纤毛图式特征，该种被鉴定为ＴｒｉｃｈｏｄｉｎａｊａｄｒａｎｉｃａＲａａｂｅ，１９５８．此为我国新记录，同时也是第一例有关外寄生于扇贝鳃表纤毛虫原生动物的报道。     

钩刺尾刺虫无性生殖期的皮膜演化

借助蛋白银技术对海洋纤毛虫钩刺尾刺虫无性二分裂期间的形态发生进了观察(1991年7月10日),结果表明:(1)前仔虫也有一口原基出现并由其对老的口围带进行部分重建,另一部分未被更新的小膜将保留并为前仔虫所继承;(2)额棘毛分别来自第1、2棘毛原基及口侧膜原基;(3)形式上的右缘棘毛实为腹棘毛,来自第5列棘毛原基;(4)尾棘毛十分独特地由两组原基演化而成;(5)背触毛的发生为分步式进行.文中另对本属的演化模式及在游仆虫科中所体现的独特性做了讨论.     

致病性哈维氏弧菌:海洋寄生性纤毛虫的内共生细菌

哈维氏弧菌被观察到与海洋寄生性纤毛虫刺激隐核虫具有内共生现象,其作为一种致病性细菌,可导致感染刺激隐核虫的大黄鱼产生严重的继发性细菌感染。我们通过16s宏测序技术对刺激隐核虫的细菌群落进行鉴定,并通过标准的细菌培养方法分离鉴定出哈维氏弧菌。通过透射电镜和荧光原位杂交方法,在刺激隐核虫的细胞胞质中,均观察到内共生的哈维氏弧菌的存在;而在其细胞核中,则没有相关信号存在。哈维氏弧菌与刺激隐核虫的相关关系以及内共生的哈维氏弧菌对刺激隐核虫的影响作用,仍需要深入进行研究。