创伤弧菌疫苗对青石斑鱼的免疫学效应和安全性

弧菌病是海水网箱养殖石斑鱼Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ主要疾病之一。本文利用致病菌──创伤弧菌Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ强毒菌株制备出安全性很高的福尔马林灭活疫苗（ＦＶ）和热灭活疫苗（ＨＶ）。这两种疫苗无论使用佐剂与否，通过肌肉注射接种青石斑鱼Ｅ．ａｗｏａｒａ都能使鱼体在较短时间内产生较强的体液免疫应答，而且抗体效价能维持较长时期。免疫后的青石斑鱼获得了良好的免疫保护力。     

网箱养殖青石斑鱼河流弧菌病研究

随着养殖规模的扩大 ,病害问题日益严重 ,严重地制约着石斑鱼养殖业健康发展。刘秀珍等１９９４年报道创伤弧菌是石斑鱼的病害弧菌病的病原。本文作者对１９９９年夏季厦门市同安区琼头村网箱养殖石斑鱼的严重病害进行了研究 ,试图能为养殖青石斑鱼（Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓａｗｏａｒａ）的病害防治提供理论依据。１材料与方法１．１试验用鱼患病石斑鱼取自同安区琼头村养殖网箱 (体重９７～２４５ｇ) ;健康石斑鱼购自厦门火烧屿养殖网箱 (体重８１～１１４ｇ) ,暂养备用。１．２病原菌的分离将病鱼体表清洗消毒后 ,用无菌操作方法从肝脏、…     

饵料维生素C对青石斑鱼的非特异性免疫调节作用

调查了饵料维生素Ｃ对青石斑鱼Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ ａｗｏａｒａ非特异性的体液和细胞免疫作用。在冰冻饵料鱼中添剂加不同剂量的维生素Ｃ（每公斤饵料鱼含量分别为０,５００,１０００,１５００和２０００ｍｇ）,连续投喂青石鱼２０周后,青石斑鱼血液白细胞总数及不同种类白细胞（包括淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞）组成比例不受饵料维生素Ｃ的影响。青石斑鱼血清补体经典型溶解羊红细胞的能力随乌料维生素Ｃ添加量的提     

青石斑鱼视网膜运动反应的特性

1987年,在龙海及厦门附近海域采集青石斑鱼,以组织学方法进行视网膜运动反应特性研究,结果表明:(1)青石斑鱼视网膜运动反应几乎以线性方式进行,暗适应在75min内完成,至少有15min潜伏期,视锥肌样体伸长与色素上皮(REP)色素颗粒聚集的速率分别为2.2μm/min和2.7μm/min。明适应在15min内完成,没有潜伏期,视锥肌样体收缩与REP色素颗粒扩散速率分别为8.9μm/min和10.8/μm/min。(2)在持续黑暗和持续光照下,该鱼不产生节律性视网膜运动反应,表明视网膜运动反应主要受光控制,很少受到内源节律性系统影响,这与该鱼长期栖息于近海底层岩礁和洞穴昏暗环境,活动性弱相适应。     

超声波对青石斑鱼体表吸收氯霉素能力的影响

应用超声波对8－20cm青石斑鱼体表吸收能力的影响研究表明，超声波的超声强度和作用时间及及浸泡的氯霉素溶液的浓度对青石斑鱼体表吸收氯霉素的能力有显著影响，且呈正相关关系。此外，不同的超声作用方法也能显著影响实验石斑鱼的体表吸收能力，其中，超声后浸泡和浸泡后超声以及脉冲超声比连续超声均能更显著地提高石斑鱼的体表吸收能力。     

青石斑鱼抗细胞凋亡因子DAD1的克隆及表达特征分析

抗细胞凋亡因子(Defender against cell death 1,DAD1)是一种重要的内源性细胞凋亡抑制因子.采用RACE-PCR方法,结合SMART cDNA合成方法、抑制性差减杂交技术,从青石斑鱼脾脏中克隆DAD1并研究其在正常的青石斑鱼和注射了脂多糖的青石斑鱼各组织中的表达模式.结果表明:DAD1基因cDNA全长721 bp,包含一个342 bp的完整阅读框,编码一个由113个氨基酸组成的蛋白.RT-PCR半定量分析显示DAD1在正常的青石斑鱼和注射了脂多糖的青石斑鱼的脾、心、头肾、肾、肝中都有转录,在脾、肝中表达水平较高,而在肌肉中未见明显表达.DAD1在注射了脂多糖的青石斑鱼各组织中的表达量均高于正常的青石斑鱼.     

养殖石斑鱼溃疡病病原哈维氏弧菌胞外产物的研究

以网箱养殖的患溃疡病青石斑鱼(Epinephlus awoara)和斜带石斑鱼(Epinephlus co-ioides)分离的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)TS-628菌株为研究对象,采用平板玻璃纸覆盖技术,获得该菌株的胞外产物(ECP),并对其成分进行分析。利用杯碟法研究表明,哈维氏弧菌TS-628菌株的胞外产物具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、卵磷脂酶等多种酶活性和溶血活性,且溶血性物质具有热不稳定性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及考马斯亮蓝R-250染色分析表明,ECP蛋白条带主要集中在分子质量范围25.0~66.2 ku之间,经不同时间培养所获得的ECP在凝胶上显示出的蛋白条带几乎一致。采用复性电泳方法(G-PAGE)分析了哈维氏弧菌及其它4种弧菌属细菌的ECP蛋白酶活性,结果发现哈维氏弧菌ECP在酸性条件下,蛋白酶活性较强,在碱性条件下,蛋白酶带明显减少,活性很弱。在相同的pH条件下,5种弧菌中以副溶血弧菌的ECP蛋白酶活性最强,种类多,分子质量范围宽;而哈维氏弧菌的蛋白酶带较少,活性也稍弱。     

致病性副溶血弧菌脂多糖的制备及其对牙鲆的免疫效应

利用酚水法提取的副溶血弧菌脂多糖 (lipopolysaccharide,L PS) ,经 SDS- PAGE电泳及银染色后表明这种方法提取副溶血弧菌脂多糖显示出 4 1 .3KDa,30 .7KDa,2 5 .4 KDa以及 1 1 .8KDa 4条主要脂多糖带。用此做免疫原 ,采用加强腹腔注射法免疫牙鲆 ,测定牙鲆的血清凝集抗体效价和白细胞吞噬活性。结果表明 ,免疫后的牙鲆对副溶血弧菌的血清凝集抗体效价有显著提高 ,第 3周抗体滴度达到最高值 2 5 6 ;白细胞的吞噬活性与对照组相比有明显加强 (P<0 .0 5 )。     

海水鱼类病原弧菌对对虾的致病力及其疫苗的免疫预防

鱼类致病弧菌（溶藻弧菌Vibrio alginolyticus, 创伤弧菌V.vulnificus，河弧菌生物Ⅰ型V.fluvialis Ⅰ，鳗弧菌Ⅴ.anguillarum和副溶血弧菌Ⅴ.parahaemolyticus）同样可使斑节对虾Penaeus monodon患病，现对斑节对虾的致病性和免疫保护力作了研究。通过肌肉注射感染实验，发现5种弧菌对斑节对虾均有不同的致病作用。从5种弧菌中筛选出强毒株，以其制成福尔马林灭活疫苗。通过注射、浸浴和投喂等3种方式接种的斑节对虾，除投喂效果不明显外，注射和浸浴接种均有一定的免疫保护力。在注射接种组中，随着疫苗浓度的提高，其免疫力有升高的趋势。说明在鱼虾的弧菌病中，疫苗能起到共同的防御效果，为商用鱼虾疫苗的生产提供了可能。     

创伤弧菌内膜脂蛋白MFP4的克隆、表达及细胞定位研究

创伤弧菌是一种海洋环境中的重要病原菌。细菌脂蛋白是一类细菌重要的具有不同生理功能的膜蛋白,以大肠杆菌为代表的经典革兰氏阴性菌脂蛋白分泌规律遵循“+2规则”。为探究海洋环境中革兰氏阴性菌的细菌脂蛋白分泌机制是否有别于其他环境中的革兰氏阴性菌,本研究克隆并表达了创伤弧菌的MFP4脂蛋白,该脂蛋白N端成熟肽段第二位(+2位)氨基酸为甘氨酸,根据“+2规则”理论上应定位于细胞外膜。实验利用细菌外膜小体分离鉴定法,在表达MFP4重组脂蛋白的创伤弧菌中对其进行细胞定位后发现, MFP4生物合成后定位于细胞内膜。实验进一步构建了MFP4蛋白N端序列与红色荧光蛋白RFP的融合脂蛋白基因MFP4tether-RFP并在创伤弧菌中表达,细胞定位结果发现该重组融合脂蛋白仍然定位于细胞内膜,说明MFP4成熟脂蛋白的N端携带内膜细胞定位的信息。实验同时构建并表达了外膜脂蛋白LptE的N端序列与RFP的融合重组脂蛋白LptEtether-RFP,该蛋白具有与MFP4相同的N端+2位氨基酸(Gly+2),与MFP4 tether-RFP融合脂蛋白仅有(+3—+10位)8个氨基酸序列的差异。实验发现该融合脂蛋白定位于...     

致病溶藻弧菌脂多糖对点带石斑鱼毒性和免疫原性的影响

以热酚水抽提法提取致病溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粗脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS),并将不同浓度的溶藻弧菌粗LPS通过腹腔注射法接种点带石斑鱼(Epinephelus coioides),研究该LPS对点带石斑鱼毒性和免疫原性的影响,并同弱致病溶藻弧菌粗LPS及高纯度大肠杆菌(Escherichia coli)LPS对石斑鱼的刺激效果进行比较。结果表明:溶藻弧菌致病株和弱致病株粗LPS均对石斑鱼具有比较强的毒性,溶藻弧菌LPS对石斑鱼的免疫原性随LPS浓度的增高而增强,高纯度大肠杆菌LPS对石斑鱼的免疫原性效果要优于溶藻弧菌粗LPS。     

鳗弧菌感染牙鲆的组织学和免疫组织化学观察

利用免疫组织化学ＡＢＣ法及组织学ＨＥ染色技术对鳗弧菌人工感染后的牙鲆肝组织及胃肠道进行了组织病理学及细菌的定位研究。结果显示,感染后肝细胞肿胀,空泡化现象严重,肝窦扩张,肝组织内可见阳性反应的细菌呈堆状存在;胃黏膜褶变矮。胃壁变薄,黏膜层内可见阳性反应的细菌;肠绒毛细胞出现破损,肠腔内有大量细胞碎片,肠腔内也可见阳性反应的细菌。提示：鳗弧菌可直接侵入组织细胞破坏组织结构,进而使鱼体出现死亡。     

矛尾复虾虎鱼溃疡病病原创伤弧菌的鉴定

2009年8月江苏连云港赣榆县多家虾蟹养殖塘混养的矛尾复虾虎鱼（砂nechogobius hasta）大量死亡．从病鱼深层溃烂组织及肝脏中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明分离菌对虾虎鱼的半数致死量（LD,0）为1．63×10^6cfu／g。对分离菌进行了形态特征、理化特性和分子生物学等方面的分析。一方面．分离...     

溶藻弧菌脂多糖对大黄鱼的毒性与免疫保护性试验

用酚水法从20dm3大黄鱼的病原菌--溶藻弧菌菌液分离出脂多糖(LPS)溶液380cm3,冻干后得到LPS粉末97.6mg.在注射剂量为0.2cm3不同浓度LPS溶液对大黄鱼肌肉注射毒性试验中,LPS注射浓度为0.5 mg/cm3 时, 5d内能引起大黄鱼死亡;当LPS浓度提高到2 mg/cm3时,大黄鱼的死亡率达到100%.以剂量为0.2 cm3、浓度为0.2 mg/cm3的LPS溶液对大黄鱼进行免疫注射,15d后用0.2cm3浓度为9×108 个/cm3的溶藻弧菌进行攻毒试验,40%的大黄鱼获得免疫保护.     

利用扩增vvhA基因的环介导等温扩增技术快速，特异而敏感地检测创伤弧菌

创伤弧菌是一种可感染人类的河口病原菌。建立快速,特异而敏感的检测方法,有助于创伤弧菌感染的早期疾病诊断和及时治疗。本研究设计了针对vvhA基因的一系列引物（包括两对外部引物和两对内部引物）,采用环介导等温扩增技术（LAMP）来检测创伤弧菌。结果显示,本方法的最适扩增温度是63℃,反应仅需35分钟。扩增产物不仅可以用含有DNA ladder的琼脂糖凝胶电泳检出,也可借助钙黄绿素直接肉眼观察。采用45株菌株检测该方法的特异性,其中所有创伤弧菌均被检出而其他菌株检测结果皆为阴性。本方法的敏感性是普通PCR扩增的100倍,同时利用该方法可以准确检测出所有的模拟样品、临床标本及环境样品。与其他已知方法比较,针对vvhA基因的介导等温扩增技术可以快速、简单、敏感及特异地鉴定创伤弧菌。     

饵料维生素C对青石斑鱼的非特异性免疫调节作用

调查了饵料维生素C对青石斑鱼Epinephelusawoara非特异性的体液和细胞免疫调节作用。在冰冻饵料小杂鱼中添加不同剂量的维生素C(每公斤饵料鱼含量分别为 0 ,50 0 ,1 0 0 0 ,1 50 0和 2 0 0 0mg) ,连续投喂青石斑鱼 2 0周后 ,青石斑鱼血液白细胞总数及不同种类白细胞 (包括淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞 )组成比例不受饵料维生素C的影响。青石斑鱼血清补体经典型溶解羊红细胞的能力随饵料维生素C添加量的提高而显著增强 (p<0 .0 1 )。然而 ,维生素C对血清的杀菌活性没有作用。鱼体非特异性的细胞免疫活动 (包括血液白细胞和头肾细胞的吞噬活动 )也不受维生素C的影响     

黑鲷和青石斑鱼对气泡幕反应的比较

在室内水池中观察了黑鲷（Ｓｐａｒｕｓｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ）和青石斑鱼（Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓａｗｏａｒａ）对孔径０．５ｍｍ、孔距５．０ｃｍ，空气压力０．２５ｋｇ／ｃｍ２固定气泡幕的反应。结果表明，气泡幕对两种海水鱼都有显著的阻拦作用，平均阻拦率分别为黑鲷７５．１％、青石斑鱼８２．４％。分析显示，气泡幕对两种鱼的阻拦率间无显著差异。在本实验中，该两种鱼对气泡幕均无明显的适应现象     

副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）tdh2基因和鳗弧菌（Kanguillarum）ompU基因二联DNA疫苗制备及其对大菱鲆（Scophthalmusmaximus）免疫保护作用

采用基因工程的方法,将副溶血弧菌的热稳定直接溶血素基因tdh2和鳗弧菌外膜蛋白基因ompU进行融合,在大肠杆菌中得到表达,并利用该融合基因构建二联DNA疫苗pEGFP．N1／tdh2-ompU。用DNA疫苗按10和50μg／尾的剂量通过肌肉注射免疫大菱鲆,对大菱鲆抵抗致病性副溶血弧菌和鳗弧菌的免疫效果进行研究。结果表明...     

海洋放线菌对大黄鱼病原弧菌的拮抗作用和抗菌谱

在大黄鱼（Pseudosciaena crocea)病原弧菌的拮抗放线菌筛选和人工诱变基础上，选择出对溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌（V.paradaemolyticus)同时具有较强拮抗作用的4株放线菌，采用琼脂块法测定4株放线菌的抗菌谱，并检测4株放线菌分别在固体和液体培养液中的拮抗作用，结果表明：4株放线菌的抗菌谱均较窄，在固体和液体培养基中对2种病原弧菌都有较强的拮抗作用。     

环境因子对鳗弧菌生长和胞外蛋白酶表达的影响

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种水产动物的重要致病菌,鳗弧菌分泌的胞外蛋白酶是该菌的致病因子之一.研究了环境因子对鳗弧菌W-1生长及胞外蛋白酶表达的影响.结果表明,鳗弧菌的最适生长温度为28℃,菌体生长量在21 h达到最高,胞外蛋白酶的活力在24 h最高.在37℃培养时,菌体生长和酶活力显著降低;添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等碳源物质均能显著促进菌体的生长,但对于胞外蛋白酶表达有明显抑制作用;1 mmol/L EGTA对茵体的生长和胞外蛋白酶表达没有明显影响,而1 mmol/L的EDTA强烈抑制鳗弧菌的生长及其胞外蛋白酶的表达.添加不同浓度的氨苄青霉素对菌体的生长及其胞外蛋白酶表达有明显的抑制作用.