贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis MCCC 1A15695抑菌蛋白分离纯化及应用研究

对虾“玻璃苗”病的暴发,会导致对虾幼苗大批死亡,给水产养殖带来巨大损失。利用本实验室最近鉴定的“玻璃苗”致病菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)vp HL,从海洋来源芽孢杆菌中筛选拮抗菌,获得一株能够高效抑制vp HL菌株的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MCCC 1A15695。经分离鉴定与活性测定,其有效抑菌物质为蛋白类,该蛋白抑菌谱较广,对包括多种弧菌病原在内的17种病原微生物有抑制作用。经Q Seharose Fast Flow阴离子柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)及液相色谱 质谱联用技术(LC MS)分离纯化鉴定,确定活性蛋白组分中的有效抑菌物质为枯草杆菌素(subtilisin)、未知蛋白(hypothetical protein)及α 淀粉酶(Alpha amylase)。蛋白类物质具有高生物安全性,本研究为后续益生菌的开发利用提供了理论基础。     

深海贝莱斯芽孢杆菌DH82的筛选、鉴定及其抗菌粗蛋白性质分析

本研究从西太平洋雅浦海沟 6 000 m 深的水样中分离得到 106 株深海细菌,其中筛选到一株能较强拮抗迟缓爱德华氏菌等水产致病菌的 DH82 菌株。采用 16S rDNA 和 gyrB 基因 （NCBI 登录号：MK203035 与 MK203036） 分子生物学分析, 结合形态学和生理生化特性,鉴定 DH82 菌株为贝莱斯芽胞杆菌 Bacillus velezensis。对其抗菌粗蛋白性质进行研究发现：该粗蛋白具有较好热稳定性,在 100 益,处理 30 min 后,仍有 85.5 %抑菌活性;木瓜蛋白酶、蛋白酶 K、胃蛋白酶及胰蛋白酶对粗蛋白影响不显著;粗蛋白在 pH7.0 条件下抑菌活性最佳;金属离子 K+和 Na+对粗蛋白抑菌活性有促进作用,Mg2+、Ca2+及 Fe3+等多价金属离子对粗蛋白抑菌活性有抑制作用。     

生防细菌K2-1对大菱鲆病原菌的抑制作用及其抗菌特性分析

为探讨生防细菌应用于水产养殖动物细菌病防治的可行性,作者从厦门市海沧港口污泥中筛选到一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)K2-1,利用琼脂扩散法发现其发酵上清对大菱鲆(Scophthalmus maximus)养殖常见致病菌——副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、爱德华氏菌(Edwardsiella)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus))有较强拮抗作用。进一步分析抗菌物质的部分特性,结果显示,蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)K2-1发酵产生的抗菌物质含有蛋白(肽)类成分,该抗菌物质具有一定的耐热性,其在温度40~70℃的条件下保持较好的抑菌效果,对酸碱度也有很强的耐受力,pH在3.0~9.0范围内,活性降低少于15%,对紫外线不敏感,对胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶也不敏感,但对蛋白酶K敏感。从实验结果可以初步确定该菌具有较好的开发价值。     

三种海螵蛸的处理方法及抗菌活性研究

为研究海螵蛸抗菌活性,本文通过比较海螵蛸的不同处理方法,采用药敏纸片扩散法和二倍稀释法测定了金乌贼(Sepia esculenta)、曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)、虎斑乌贼(Sepia pharaonis)3种海螵蛸对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)等8种人体及海水常见菌的抑菌效果。结果显示:海螵蛸粉末用80%酒精、按照固液比1∶4,80 W超声波3次,60℃,每次20 min震荡6 h混合后抗菌活性最好。3种海螵蛸均对哈氏弧菌(V.harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)抑制效果较好,其中,对哈氏弧菌(V.harveyi)抑制效果最强,溶藻弧菌(V.alginolyticus)其次,金黄色葡萄球菌(S.aureus)居于第三。3种海螵蛸中,金乌贼(S.esculenta)和曼氏无针乌贼(S.maindroni)海螵蛸抑制效果相似且强于虎斑乌贼(S.pharaonis)。在8种菌中,对抑制效果最明显的哈氏弧菌(V.harveyi),最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC)为3.9 mg/mL,其次是溶藻弧菌(V.alginolyticus),MIC为15.6 mg/mL。研究结果表明三种海螵蛸均具有抗菌活性,这为海螵鞘应用价值提供了理论依据。     

乳酸杆菌LH对几种水产养殖病原弧菌的抑制作用

为探明乳酸杆菌（Lactobacillus spp．）LH对水产养殖病害的生物防治功能，采用试管稀释法和平板抑菌圈检测法，探讨了乳酸杆菌LH代谢产物对沙蚕弧菌（Vibrio nereis）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyicus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、漂浮弧菌（Vibrio natriegen）的抑制能力，并在模拟养殖水体实验中探讨了乳酸杆菌LH对哈维弧菌的抑制效果．结果显示，乳酸杆菌LH培养12h的代谢产物没有抑菌活性，培养24～96h的代谢产物有明显抑菌活性，随着培养时间的延长，其代谢产物的抑菌活性增强；乳酸杆菌LH代谢产物对病原弧菌的最低抑菌浓度为8倍稀释液；在模拟养殖水体中，10^3个／cm^3乳酸杆菌LH即对哈维氏弧菌有明显的抑制作用，抑制作用随哈维氏弧菌菌量（10^3～10^6个／cm^3）的增大而减弱．结果表明乳酸杆菌LH对病原弧菌具有良好的抑制作用．     

南麂岛海洋沉积物中抗大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病弧菌的放线菌分离和筛选研究

采用平板涂布法从南麂岛近海海洋沉积物样品中分得86株放线菌,用琼脂块法和杯碟法结合筛选出对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)两种大黄鱼病原性弧菌具有不同拮抗作用的海洋放线菌5株,其中编号NJR0956的菌株对两种致病菌的抑菌圈直径均25mm,表现出较强的抑制作用;进而测定了5株活性菌株的抗菌谱。结果表明,它们对指示菌中的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)四种病原弧菌均具有较好的拮抗作用;在对NJR0956的抑菌效果研究中发现,该菌株在牛肉膏蛋白胨液体培养基中不仅能够增殖,而且能够有效地抑制病原菌的生长。     

迟缓爱德华氏菌胶体金快速检测试纸的研制

本研究用纳米胶体金颗粒标记抗迟缓爱德华氏菌(AL60306NA1)单克隆抗体3A7并制备金标垫,将抗迟缓爱德华氏菌(AL60306NA1)单克隆抗体4F11与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜,建立迟缓爱德华氏菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定,结果表明:试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、海安气单胞菌、产碱假单胞菌、无乳链球菌、大肠埃希杆菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、类志贺邻单胞菌、鲁氏不动杆菌等15种水产常见病原菌没有交叉反应,与迟缓爱德华氏菌特异性反应,检测灵敏度为1×105cfu.mL-1,检测所需时间低于20min。所制备的迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。     

一株许氏平鲉(Sebastes schlegelii)肠道乳酸菌的分离鉴定及特性分析

为筛选具有广谱抑菌活性的乳酸菌用于微生态制剂开发,本研究自野生许氏平鲉肠道内共分离出35株细菌,从中筛选出1株乳酸菌YH1,其革兰氏染色呈阳性,且可发酵脱脂乳产生凝固、无气泡、呈酸性现象,基于形态学观察、生理生化和16S rDNA序列鉴定乳酸菌YH1为食窦魏斯氏菌。分析了酸碱度、温度和NaCl含量对食窦魏斯氏菌YH1生长的影响;选取金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟钝爱德华氏菌、鳗弧菌、假交替单胞菌和哈维氏弧菌等多种病原指示菌,以琼脂扩散法测定YH1培养12h产物的抑菌活性;并采用肌肉注射和腹腔注射两种方式对YH1的动物安全性进行检测。实验结果显示,食窦魏斯氏菌YH1适宜的生长条件为pH5.7—8.8、温度20—40oC,最适生长条件为pH7.2—8.4,温度35oC,在MRS培养基中添加NaCl会抑制YH1的生长;食窦魏斯氏菌YH1的无菌培养产物可显著抑制金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟钝爱德华氏菌、鳗弧菌、假交替单胞菌、哈维氏弧菌等病原指示菌的生长;食窦魏斯氏菌YH1在10~8CFU/m L及以下浓度对许氏平鲉是相对安全的。以上研究表明了食窦魏斯氏菌YH1具有广谱抑菌性和动物安全性,为其应用于水产养殖业奠定了理论基础。     

降低交叉反应的鱼类病原菌检测抗体芯片初步研究

采用菌体吸附法对海豚链球菌(Streptococcus iniae)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、荧光假单胞菌(Psedomonas fluo-rescens)和海洋分支杆菌(Mycobacterium marinum)6种养殖鱼类病原菌的兔抗血清进行吸附,以减小抗血清与其它菌株的交叉反应;吸附纯化后的抗体作为捕获抗体构建了病原菌检测抗体芯片。实验结果显示,与未经过吸附的纯化抗血清构建的抗体芯片相比,血清吸附实验能有效减少交叉反应,降低抗体的非特异性吸附,提高细菌检测的特异性。同时,以迟缓爱德华氏菌为例,采用吸附纯化后抗体制备的抗体芯片检测人工感染迟缓爱德华氏菌和自然发病的牙鲆,均观察到迟缓爱德华氏菌的特异性显色反应,得到了较理想的检测结果。本文结果说明优化后的病原菌检测抗体芯片可用于水产养殖鱼类常见的上述6种细菌性疾病的有效检测。     

苗期中国对虾幼体异养细菌区系及其变化与病害发生的关系

研究了2个育苗场不同发育期的中国对虾(Penaeus chinensis)幼体的异养菌和弧菌种群变化的动态过程。以典型特征法、BIOLOGGN法和数值分类法对菌株进行鉴定。结果表明，对虾幼体样品中所分离的细菌，大多是革兰氏阴性杆菌。鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)和弧菌属(Vibrio)。弧菌属主要为溶藻弧菌(Vibrioal-ginozyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。在对虾幼体发育早期，假单胞菌(Pseudomonas)和气单胞菌(Aeromonas)占优势，随着对虾幼体的发育，弧菌(Vibrio)渐成为优势，其中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)优势明显。二者的消长与苗期病害的发生相关，溶藻弧菌总是在虾幼体健康时出现或成为优势，而哈维氏弧菌成为优势时，苗期病害容易发生。