凡纳滨对虾遗传多样性研究中AFLP体系的建立

凡纳滨对虾是当今世界公认的重要对虾养殖品种之一,然而良种选育研究仍相对落后,亟需采用分子遗传学手段加以解决.本文以凡纳滨对虾为材料,对预扩增体系、选择性扩增体系中的稀释倍数、dNTP浓度、Taq浓度、Mg2+浓度、引物浓度进行比较,结果表明,300 ng基因组DNA采用5U PstI和5UMseI双酶切4 h,16℃连接过夜,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释50倍进行选择性扩增,能够得到稳定丰富的条带,最终建立了适用于凡纳滨对虾的AFLP反应体系.本研究又进一步应用优化后的AFLP反应体系,从64对选择性扩增引物组合中筛选出12对多态性高的引物组合,便于对凡纳滨对虾基因多态性位点进行分析,从而为凡纳滨对虾的遗传多样性研究奠定基础.     

植物乳杆菌对凡纳滨对虾致病菌抑制及其对肠道菌群结构的影响

本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为对象,通过琼脂扩散法、荧光染色法与分光光度法筛选出对凡纳滨对虾致病菌有抑制作用、对对虾肠黏液有黏附作用且对盐度有耐受性的3株菌(YRL45、KTP(C-2)、QL),经16S rDNA测序比对发现此3株菌均为植物乳杆菌。将其混合饲喂凡纳滨对虾4周,通过高通量测序研究虾肠道菌群变化。研究表明,混合植物乳杆菌的饲喂对凡纳滨对虾肠道菌群的α多样性无显著性影响,变形菌门和拟杆菌门为凡纳滨对虾肠道优势菌门,植物乳杆菌对凡纳滨对虾肠道中放线菌门的丰度有一定的提高。通过LEfSe分析,发现植物乳杆菌处理组中潜在致病菌发光杆菌属减少,而属于光合细菌的赤杆菌属有所增加。研究结果为益生菌在凡纳滨对虾的应用提供了一定的理论指导。     

基于三代测序技术的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)高通量候选基因关联分析方法的建立

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是世界也是我国的主导对虾养殖品种,产业的发展离不开良种的支撑,分子育种被认为是加快良种选育的最有效途径,而目标性状相关分子标记的开发是发展分子育种的基础。研究主要目的是建立一种适用于凡纳滨对虾等水产经济物种的高通量候选基因关联分析方法,并在抗弧菌相关标记筛选中进行应用。首次将三代靶向测序技术用于对虾候选基因的基因分型,在抗弧菌性状候选基因LvPI3K的全长序列上发掘到91个SNP位点,通过关联分析鉴定到21个与抗弧菌性状显著相关的SNP标记(P0.05),利用Sanger测序证实了三代靶向测序技术分型结果准确可靠。所建立的基于三代测序的靶向分型方法为凡纳滨对虾等水产动物提供了一种高效、低成本的基因分型方法,所发掘的抗弧菌性状相关位点对开展凡纳滨对虾抗弧菌性状分子育种具有一定指导意义。     

凡纳滨对虾多代选育群体生长和耐综合胁迫性状的配合力及杂种优势分析

为筛选凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)最佳的交配组合方式,以5个不同遗传背景的凡纳滨对虾群体为亲本,经交配构建12个组合F1代.利用ASReml4软件估计凡纳滨对虾12个组合105日龄的生长和耐综合胁迫(高盐(35)、低pH(6±0.1)与高氨氮(70?mg/L)共同胁迫)性状的一般配合力(GCA...     

二溴海因和碳水化合物水平对凡纳滨对虾生长和免疫的影响

研究了低盐度条件下,二溴海因和碳水化合物水平对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长和免疫的影响,共3个实验。实验1研究了二溴海因对凡纳滨对虾存活的影响,发现在0.2、5和20三个盐度水平,随着二溴海因浓度的升高,凡纳滨对虾存活率呈下降趋势;二溴海因对凡纳滨对虾的安全浓度随盐度的增加呈上升趋势。实验2和实验3研究了盐度、二溴海因浓度和饲料中碳水化合物水平对凡纳滨对虾生长和免疫的影响,结果表明:在低盐度养殖条件下,凡纳滨对虾长期生活于二溴海因环境中,可导致对虾处于应激状态,需要消耗体内较多的免疫因子,血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性降低,生长速度下降,而在饲料中适量增加碳水化合物不仅可促进对虾生长又可起到饲料蛋白质节约作用。     

凡纳滨对虾引进亲虾及其子一代的遗传多样性研究

采用Operon公司的16个引物对两个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)引进亲本群体及其子一代对虾的基因组DNA多态性进行了检测。第一个亲虾群体对16个引物共获得78个位点,其中多态位点数为48个,占61.54%;其子代对虾共获得89个位点,其中多态位点数为50个,占56.18%。第二个亲虾群体对16个引物共获得97个位点,其中多态位点数为49个,占50.52%,其子代对虾共获得93个位点,多态位点数为28个,占30.11%。单个引物获得的标记数为1～8个。第一个亲本群体及其子代个体间的平均遗传距离分别是0.1959±0.0392和0.1435±0.0268;第二个亲本群体及其子代个体间的平均遗传距离分别为0.0922±0.0189和0.0621±0.0148。两个亲本群体间的遗传距离为0.6546±0.0794,两个子代群体间的遗传距离为0.7087±0.0656。在OPF-09、OPZ-11两个引物的扩增结果中,发现两个亲本群体及其子代有差异标记。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)选择育种G_0代的生长性能比较与选择效果预估

采集凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)7个不同遗传背景的亲本群体,采用群体自繁或杂交方法获得11个凡纳滨对虾选育群体,分别对标准化养殖270日龄(留种阶段)后的不同群体和不同性别个体生长性能差异进行比较分析,根据Kung育种值及综合评定值评估筛选亲本群体,并对体质量性状进行选择效果预估。结果表明,11个群体270日龄体长和体质量均值分别为13.52cm和31.05g,各群体间体长和体质量性状差异均达到显著水平(P0.05);体重与体长回归关系达到极显著水平(P0.01),回归系数为0.903;分别对各交配组合雌雄群体体长体质量均值进行t-检验分析,差异均达到显著水平(P0.05);根据各群体的综合评定值大小将所有群体评定为优、良及一般3个等级,其中作为父本时优等级群体为GH♀×GH♂、ZX♀×ZX♂,而作为母本时优等级群体为GH♀×GH♂和SS♀×SS♂;进一步预估凡纳滨对虾选育G1代的综合选择反应为1.927g。本研究可为下一阶段凡纳滨对虾家系选育基础群体的构建提供生长性能资料,加快凡纳滨对虾的遗传改良进程。     

循环水养殖系统在凡纳滨对虾种虾养殖中的应用效果初探

循环水养殖系统在凡纳滨对虾种虾养殖中应用较少,本研究应用循环水养殖系统养殖凡纳滨对虾种虾,设定4个不同的养殖密度(30、40、50、65尾/m2),初始体重:(0.102±0.008)g,研究凡纳滨对虾种虾在循环水养殖系统中的生长情况。养殖期间定时对对虾体重和水体指标(氨氮、亚硝酸氮、pH、水温、微生物)进行分析测定。通过对各项数据分析表明:低密度组(30、40、50尾/m2)凡纳滨对虾体重增长较快,各组特定生长率分别为(3.83±0.03)%、(3.87±0.01)%、(3.81±0.03)%,绝对增重率分别为(0.201±0.009)、(0.214±0.004)、(0.194±0.009)g/d,但均无显著性差异(P0.05);高密度组(65尾/m2)的凡纳滨对虾体重增长较慢,特定生长率和绝对增重率分别为(3.41±0.02)%和(0.107±0.004)g/d,该结果与低密度组间存在显著性差异(P0.05)。低密度组中凡纳滨对虾养殖水体的水质指标要优于高密度组,4个密度组中氨氮、亚硝酸氮、绿菌均维持在安全浓度范围内,仅仅黄菌数量略高。综合分析,采用该养殖系统养殖凡纳滨对虾的最优密度为50尾/m2。因此,本研究可为循环水养殖系统养殖凡纳滨对虾种虾提供参考。     

凡纳对虾优良性状遗传标记的筛选

凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)是全球三大养殖对虾名优种类之一。我国从1988年开始试养，到1998年大量引进凡纳对虾亲虾和幼体后，华南地区兴起了养殖热潮。在1999年到2000年短短两年时间内，广东、海南、广西凡纳对虾的养殖面积已达10×104亩(1亩=666.7m2)，集约化防病养殖产量普遍达到5~9t/hm2，年产量高达10~20t/hm2，其养殖面积约占华南地区对虾养殖面积的60%，普遍获得了比养殖斑节对虾更好的经济效益，成为我国继中国对虾、斑节对虾之后的又一养殖对虾种类。从凡纳对虾养殖业的长远发展战略来看，如何避免斑节对虾因病害而造成养殖业全面萎缩的情况在凡纳对虾养殖业中重演已成为重要研究内容。 美国夏威夷海洋硏究所等单位利用遗传标记辅助选育种技术进行凡纳对虾良种选育和家系培养取得了很大的成效，培育出世界著名的无特异病原(SPF)凡纳对虾亲虾，在全球对虾养殖产量下滑的形势下仍然保持良好的增长趋势，其关键是种虾的选择和家系的培育。 Garcia等(1994)利用遗传标记技术进行了凡纳对虾种群的遗传标记研究，发现种群之间具有较高水平的遗传变异，因而有潜力进行凡纳对虾良种的人工选育。 本研究利用RAPD标记技术，对目前养殖凡纳对虾不同群体进行DNA多态性研究，筛选与优良性状有关的遗传标记，为凡纳对虾优质种苗的鉴定、选育和今后遗传标记辅助选育种提供了科学依据。     

基于转录组数据的凡纳滨对虾微卫星标记开发

对虾遗传多样性和育种研究需要大量的分子标记。作者利用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)转录组测序数据,采用MISA软件进行微卫星序列挖掘,共获得14 767条微卫星序列。统计发现在凡纳滨对虾中微卫星出现的频率为16.76%;在所有的微卫星序列中,2碱基微卫星最多,占59.53%;其次是3碱基微卫星,占35.78%。随机选取其中74条序列设计引物,通过DNA混池扩增和分型的方法进行微卫星标记的开发,PCR扩增的显示有54对(72.97%)能扩增出清晰的目的条带,进一步分型的结果显示27条(36.49%)微卫星显示出多态性,从这些多态性的微卫星位点中选择11个位点在"科海1号"种质库材料中进行个体分型,结果显示在该群体中微卫星标记的等位基因数目为2~11个不等,期望杂合度值为0.256~0.858,观察杂合度为0.213~0.875,多态性信息含量为0.221~0.830,在11个位点中有4个位点显著偏离HWE(P0.05)。本研究结果为后续使用微卫星标记进行对虾遗传学研究,促进对虾的遗传选育和种质资源保护提供了重要基础。     

基于AFLP技术的海南三亚野生和养殖牡蛎遗传多样性研究

2008年夏季,从海南三亚分别采集26份养殖牡蛎和32份野生牡蛎样品(1份样品代表1个体),开展扩增片断长度多态性(AFLP)和数量性状分析,采用POPGENE 32软件计算多态性位点百分率、遗传多样性指数、Hardy-Weinberg遗传偏离指数、群体遗传相似度和遗传距离。基于AFLP分析获得的遗传距离和线粒体细胞色素氧化酶I亚基(CO I)基因序列,采用邻接法构建养殖和野生牡蛎的系统发育树。结果表明,选择性引物对牡蛎品种具有较好的鉴别效率;相比养殖牡蛎,野生牡蛎多样性丰富、品种间同源性较低、亲缘关系相差较远、遗传基础较宽;通过CO I基因序列分析可知,养殖牡蛎均为香港巨牡蛎Crassostrea hongkongensis,而野生牡蛎属于囊牡蛎属Saccostrea,主要为僧帽牡蛎Saccostrea cucullata。目前海南三亚牡蛎种质资源多样性相对丰富,引种还未对三亚自然环境的牡蛎资源造成明显影响。     

中国对虾交尾雌虾蜕皮及人工再交尾研究

为更好地利用交尾雌虾,采用温差刺激、药物刺激对养殖交尾雌虾和海捕交尾雌虾进行蜕皮实验,使交尾雌虾的精荚随蜕皮而脱落,然后对蜕皮对虾再次进行精荚移植,来建立特定杂交组合的中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)家系。实验结果表明,养殖交尾雌虾蜕皮实验中,在只有温差刺激的条件下,对虾蜕皮率为30%,且对虾成活率为100%,说明温差刺激在保持对虾较高存活率的情况下,可以促使中国对虾蜕皮;在温差刺激的基础上进行药物刺激,不同茶籽饼质量浓度梯度下对虾的蜕皮率存在显著差异,且随着药物浓度的增加,对虾蜕皮率也随之增加,3个茶籽饼质量浓度(30,60,90 g/m3)下的对虾蜕皮率分别为40%,60%,70%,茶籽饼质量浓度为0的对虾蜕皮率与60,90 g/m3质量浓度下的对虾蜕皮率存在显著差异(P0.05);从对虾的死亡情况看,当药物质量浓度达到90 g/m3时,对虾出现死亡,经x2检验表明,90 g/m3质量浓度与0～60 g/m3质量浓度下的对虾死亡率存在显著差异(P0.05)。在海捕交尾雌虾蜕皮实验中,对虾蜕皮率不高,只有在药物质量浓度为30,90 g/m3条件下才有对虾蜕皮,蜕皮率仅为20%,10%;每个药物浓度下均有对虾死亡,死亡率随着茶籽饼质量浓度升高而升高,不同药物浓度下的对虾死亡率存在显著差异。对蜕皮后雌虾进行精荚移植,共获得18个中国对虾家系,平均受精率和平均孵化率分别为51.2%,88.6%。本研究通过对交尾雌虾进行蜕皮后再交尾,获得了不同杂交组合的中国对虾家系,为进一步的中国对虾家系选育工作打下了基础。     

牙鲆选育F3代家系的建立及遗传效应分析

牙鲆是太平洋西岸海水养殖、捕捞和自然增殖的主要鱼类,但是人工养殖病害多、生长慢,针对这一问题,从2003年开始开展了牙鲆选择育种。本文利用筛选和培育的F1、F2代牙鲆家系核心群体,构建了F3代家系52个,在生长到196d时,对家系1 560尾鱼苗全长、体宽、体质量、全长日增量和体重日增量5个生长性状进行测量和计算,获得7 800个数据。采用"加性-显性"线性模型、最小范数二阶无偏估计法(MINQUE)对以上生长性状的边际平均值、加性方差分量、显性方差分量、随机方差分量、狭义遗传力、广义遗传力、亲本加性效应、杂交随机效应等遗传参数进行了评估。结果显示:1202、1206、1226和1211家系以上生长性状的边际平均值同时显著高于其他家系。以上5个生长性状的加性方差分量比率为(0.099±0.01)~(0.24±0.02),显性方差分量比率(0.30±0.02)~(0.31±0.02),随机方差分量比率(0.48±0.02)~(0.61±0.01),5个性状狭义遗传力0.099~0.24,广义遗传力0.38~0.54,以上遗传参数均达极显著性水平(P0.01)。综合比较18个亲本5个性状的加性效应预测值,发现F0917、F0908、F0905、F0915、F09125和KS(韩国牙鲆)亲本在5个性状上都具有极显著的正向效应(P0.01),其他亲本5个性状都不同程度的表现为显著(P0.05)或极显著(P0.01)的负向加性效应。对42个杂交组合显性随机效应进行预测,D(2×6)、D(2×18)、D(3×4)、D(7×12)、D(7×14)和D(8×13)6个杂交组合在5个性状上都表现为极显著(P0.05)正效应,利用这些杂交组合建立家系将促进牙鲆以上5个性状的生长。本文研究结果,为牙鲆优良家系的建立及新品种的培育初步筛选出了性状优良的亲本、杂交组合和家系,同时为牙鲆进一步选择育种提供了理论和技术依据。     

广东沿海杂色鲍养殖群体遗传多样性的微卫星分析

实验选取的7个杂色鲍(Haliotis diversicolor)养殖群体分别来自广东汕头、汕尾、惠东、湛江和徐闻,深圳野生驯养,利用7对微卫星引物对上述群体进行了遗传多样性和群体遗传结构的分析。结果显示:7个位点产生的等位基因数从7～13个不等,共检测到68个等位基因,平均每个位点的等位基因数为9.71个。有效等位基因数的范围为3.8～8.1,平均观测杂合度范围为0.422～0.906,平均期望杂合度范围为0.748～0.917。7个群体的多态信息含量变化范围为0.657～0.883,PIC值均在0.500以上,表现为高度多态性。与两个野生驯养的养殖群体相比,其他5个养殖群体均存在不同程度的遗传多样性降低。AMOVA分析显示,4.79%的遗传变异来自于群体之间,95.21%的变异来自于群体内的个体之间。研究表明,广东沿岸的杂色鲍具有较高的遗传多样性水平,7个群体之间呈现一定的遗传分化。     

牙鲆野生群体与养殖群体的遗传多样性分析

利用AFLP技术对荣成野生群体和养殖群体牙鲆进行遗传多样性分析和比较。实验采用 7对引物组合在 2个群体中共扩增出 797个位点 ,其中多态位点数为 43 3个 ,占总位点数的 5 4.2 7%。各引物组合在 2个群体中的扩增位点数目和多态位点比例有较大不同 ,但养殖群体的总扩增位点数和多态位点比例均低于野生群体 ,野生群体和养殖群体的平均多态位点率分别为 46.18%和 40 .0 7% ,其中 ,E3 8M 5 0引物组合在两群体中扩增的多态位点比例差异显著 (P <0 .0 5 )。养殖群体中低频位点明显减少而隐性纯合基因位点显著增加。群体遗传结构分析表明 ,两群体间的遗传距离比较小 ,群体遗传结构相似 ,说明养殖群体尚没有形成自己独立的遗传结构。     

栉孔扇贝不同种群的遗传结构及其杂种优势

采用来自韩国野生的栉孔扇贝和中国养殖的栉孔扇贝以及发病区存活个体作为亲本 ,构建韩国野生×韩国野生、韩国野生×中国养殖、韩国野生×中国养殖发病区存活个体以及中国养殖×中国养殖共 4个交配组合 ,通过对F1 代个体壳宽、壳高和体重的测量 ,比较不同群体的生长情况。同时采用RAPD技术对F1 代不同群体的遗传结构进行比较 ,研究群体内的遗传变异与杂种优势的关系。结果表明 ,杂交后代具有明显的生长优势 ,说明栉孔扇贝种内不同种群之间存在杂种优势。韩国野生种群和中国养殖群体以及发病区存活群体的遗传距离分别为 0 0 3 6 6和 0 0 0 5 7,以上 4个F1 代群体的平均杂合度的理论值分别为 0 2 83、0 2 6 7、0 2 6 8和 0 2 6 6 ;多态位点比例分别为 0 76 5、0 76 0、0 76 0、0 73 5。表明栉孔扇贝不同地理种群之间存在遗传分化 ,其杂种优势与群体的遗传多样性相关     

马氏珠母贝选育子一代生长特性研究

通过选择培育获得马氏珠母贝Pinctada martensii大亚湾养殖群体选育子一代(DDS),以大亚湾养殖群体为对照(DDC),在相同条件下进行养殖,对其生长性状进行了约1年的跟踪测量,运用t检验对2个组别主要性状进行了比较。分析表明,经过一代的选育,DDS在壳长、高、宽和总重上均大于DDC,存活率提高9.18%,除壳长在2个时期(2003年12月,2004年2月)差异不显著外(p>0.05),DDC/DDS2个组别其他性状在7个生长时期均具有显著差异(p<0.05)。该研究为进一步通过选择育种培育马氏珠母贝优良品种奠定了基础。     

EST-derived microsatellites in Pseudosciaena crocea and their applicability to related species

Simple sequence repeat (SSR) markers were obtained for the large yellow croaker Pseudosciaena crocea using 1 205 expressed sequences tags (ESTs) from the NCBI database. Primers for 48 ESTSSR loci were designed and screened with 30 P.crocea specimens captured from Guanjingyang sea area in Fujian Province of China. Sixteen of the loci were polymorphic, which were amplified with 3 to 11 alleles per locus and the mean of 6.13. The observed and expected heterozygosity per locus ranged from 0.091 to 0.844 (mean 0.544) and from 0.118 to 0.892 (mean 0.644), respectively. Polymorphic information content (PIC) ranged from 0.115 to 0.866 (mean 0.593). The results for cross-species amplification of the 16 large yellow croaker EST-SSRs on P. polyactis, C. niveatus, C. lucidus, A. argentatus and J. belengeri revealed that 14, 12, 11, 7 and 6 loci were successfully amplified with 1 to 10 alleles with an average of 4.5 per locus, respectively, which are suitable for population genetics studies of these species and useful for phylogenetic relationship analysis among these species. Overall, this study provides a set of type I markers for population genetics studies and genome mapping for large yellow croaker and its closely related species.     

氨氮对中国对虾抗病力的影响

１９９６年５月２４日－６月１４日,８月１－１９日,分别在青岛的两个养殖场采集海捕产卵后中国对虾亲虾和养殖中国对虾,采用人工添加氨氮并检测对虾和抗菌有关因子的活力的方法,进行氨氮对中国对虾抗病力影响的实验。结果表明,在氨氮浓度较高的实验组,对虾血细胞数目减少,其结构也有变化;酚氧化酶,超氧化物歧化酶和过氧化物酶活力,以及溶菌和抗菌活力都较对照组有明显下降;对病原菌的易感性明显提高。     

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)选育家系构建与早期标准化培育

采用巢式设计方法和人工受精技术, 对红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)选育家系的构建与标准化培育技术进行研究。按照1雄配2雌的原则, 选取养殖、野生和日本3个群体的红鳍东方鲀进行定向交配, 并对红鳍东方鲀早期阶段苗种进行了环境标准化和一、二、三、四级数量标准化培育。结果表明, 红鳍东方鲀亲鱼产卵量大, 对构建父系半同胞家系十分有利; 从4次数量标准化看, 每次各家系内鱼苗数量都较为集中, 各阶段各家系的成活率也较高, 但存在部分家系间数量差异显著; 经过4次数量标准化, 成功构建22个父系半同胞家系, 48个母系全同胞家系。对早期阶段家系构建和培育存在的问题, 进行了探讨并提出拟解决方法, 为大规模建立红鳍东方鲀家系提供参照。