企鹅珍珠贝同工酶表达多态性的初步研究

采用垂直板状聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳，对企鹅珍珠贝鳃组织的酯酶(EST)、葡萄糖-6磷酸脱氢酶(G6PD)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)和超氧化物歧化酶(SOD)5种同工酶进行了检测，并对酶谱特征进行了生化遗传分析。酶谱表型显示企鹅珍珠贝的同工酶呈现多态现象，同工酶表达上的多态性表明企鹅珍珠贝具有较丰富的遗传多样性。     

企鹅珍珠贝同工酶表达多态性的初步研究

采用垂直板状聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳,对企鹅珍珠贝鳃组织的酯酶(EST)、葡萄糖-6磷酸脱氢酶(G6PD)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)和超氧化物歧化酶(SOD)5种同工酶进行了检测,并对酶谱特征进行了生化遗传分析.酶谱表型显示企鹅珍珠贝的同工酶呈现多态现象,同工酶表达上的多态性表明企鹅珍珠贝具有较丰富的遗传多样性.     

企鹅珍珠贝主要污损生物的初步研究

企鹅珍珠贝[Pteria（Magnavicula）penguin（Roeding）]分布于热带亚热带海域，在台湾、两广沿海和海南岛有野生种群栖息，它是珍珠贝属的一种可生产大规格附壳珠和正圆珠的大型贝类。近年来企鹅珍珠贝的种苗生产、养殖和大型珍珠培育以及生化遗传的研究受到关注。在养殖中，其他海洋生物的附着或寄生成为影响企鹅珍珠贝生长与存活的重要因素，目前相关研究仅见其他贝类的多毛虫寄生病、附着敌害生物和网笼污损生物类群等的报道，而企鹅珍珠贝的污损生物的研究仅见污损苔虫的文献记录。本文对企鹅珍珠贝的附着生物进行了初步鉴别，并分析它们的附着或寄生状态。     

企鹅珍珠贝生殖细胞的发生

对不同发育阶段的企鹅珍珠贝[Ptedapenguin(Rding)]的性腺结构、生殖细胞结构与分布进行组织学观察,描述精/卵子发生过程中各级精/卵细胞的特征。结果表明:根据雌性生殖细胞形态和卵黄的变化特点,卵子发生经历卵原细胞、无卵黄初级卵母细胞、卵黄形成期卵母细胞及成熟卵子阶段;依据雄性生殖细胞大小和细胞核形态变化,精子发生经历精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子阶段,其中精原细胞存在形态上有差异的A型和B型两种类型。此外还观察到企鹅珍珠贝的性别转化现象。     

企鹅珍珠贝人工苗生长的初步观察

为了解企鹅珍珠贝生长规律，观察了壳高2.5～5.0mm的出池幼苗，按月测量其生长参数和成活率，以及环境因子。结果表明，企鹅珍珠贝生长最快的月份为7～11月和次年4～6月，壳长，壳高和壳宽月均增加量分别为3.8～13.0mm、4.7～11.2mm、2.3～3.8mm，月成活率97.8%～98.6%。企鹅珍珠贝生长最慢月份是11月至次年3月。     

企鹅珍珠贝主要污损生物的初步研究

企鹅珍珠贝[Pteria(Magnavicula)penguin(R ding)]分布于热带亚热带海域,在台湾、两广沿海和海南岛有野生种群栖息,它是珍珠贝属的一种可生产大规格附壳珠和正圆珠的大型贝类。近年来企鹅珍珠贝的种苗生产、养殖和大型珍珠培育以及生化遗传的研究受到关注。在养殖中,其他海洋生物的附着或寄生成为影响企鹅珍珠贝生长与存活的重要因素,目前相关研究仅见其他贝类的多毛虫寄生病[1-4]、附着敌害生物和网笼污损生物类群等[5-7]的报道,而企鹅珍珠贝的污损生物的研究仅见污损苔虫的文献记录[8]。本文对企鹅珍珠贝的附着生物进行了初步鉴别,并分…     

企鹅珍珠贝附壳珍珠的培育

以7种聚乙烯塑料核型为珠核,正常壳形与二壳隆起的畸形企鹅珍珠贝为手术贝,培育附壳珍珠。养殖6个月,结果表明:壳形正常的育珠贝成活率为73.3%～93.8%,成珠率55.0%～82.0%;畸形贝成活率为60%,成珠率53.3%。统计分析表明:珠核高度是影响育珠贝成活率和成珠率的主要因素,珠核越高,育珠贝成活率和成珠率越低。畸形贝与正常壳形贝成活率和成珠率存在极显著差异(P<0.01),畸形贝不宜用作手术贝。     

企鹅珍珠贝附壳珍珠养殖研究

在水温为２１．４℃—３１．２℃，盐度为２７．２‰—３６．３‰的环境条件下，进行了企鹅珍珠贝培育附壳珍珠的研究。经２８７天的育珠，成活率８７．５％。在收获的１５个母贝中，植入直径为７～１０ｍｍ的珠核４７粒，佛像模型２个；收获附壳珍珠４０颗，佛像２个，留核率达８５．７％。其中商品珠３５颗，商品珠率为８３．３％。在商品珠中，珠色为银白色的１６颗，占４５．７％；金黄色的１６颗（包括１佛像），占４５．７％；污斑珠３颗，占８．６％。珍珠直径超过１１ｍｍ的有５颗，１０．０～１０．９ｍｍ的有１９颗，９．０～９．９ｍｍ的有９颗，８．０～８．９ｍｍ的仅１颗。抽测珍珠５颗，珠层厚度最大者８６２．５μｍ，最薄者５６２．５μｍ。     

低盐度海水对企鹅珍珠贝存活的影响

对企鹅珍珠贝稚贝、中贝和成贝在降低盐度的海水中存活状态进行了观察和研究。在水温20~23℃,以不同盐度梯度(8、12、16、20、242、8、30和33)的海水暂养稚贝并定时检查,在广东的四个海区,对盐度变化时中贝及成贝的养殖成活率进行了观察。结果表明:盐度低于16的3个组,稚贝在60h内全部死亡,盐度20~24海水中,稚贝虽只有部分死亡,但活力较差;稚贝在14的海水中4h后转入正常海水,可全部存活,而超过8h后再移入正常海水的稚贝会陆续死亡;在盐度18海水中,稚贝一直未分泌足丝附着,而移入正常海水,6h就有小苗附着;大万山岛附近海域在雨季盐度可降至20以下,6~9月不适合养殖,而其它实验点可以通过深吊避免海水盐度变化造成企鹅珍珠贝死亡。     

低盐度海水对企鹅珍珠贝存活的影响

对企鹅珍珠贝稚贝、中贝和成贝在降低盐度的海水中存活状态进行了观察和研究。在水温20～23℃，以不同盐度梯度（8、12、16、20、24、28、30和33）的海水暂养稚贝并定时检查，在广东的四个海区，对盐度变化时中贝及成贝的养殖成活率进行了观察。结果表明：盐度低于16的3个组，稚贝在60h内全部死亡，盐度20～24海水中，稚贝虽只有部分死亡，但活力较差；稚贝在14的海水中4h后转入正常海水，可全部存活，而超过8h后再移入正常海水的稚贝会陆续死亡；在盐度18海水中，稚贝一直未分泌足丝附着，而移入正常海水，6h就有小苗附着；大万山岛附近海域在雨季盐度可降至20以下，6～9月不适合养殖，而其它实验点可以通过深吊避免海水盐度变化造成企鹅珍珠贝死亡。     

马氏珠母贝TRADD基因克隆与组织表达分析

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101 bp,3′非编码区144 bp和开放阅读框(ORF)591 bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。     

马氏珠母贝PmFAMeT基因的克隆及表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)法尼酸甲基转移酶(FAMe T)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝FAMeT(PmFAMeT)基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmFAMeT在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmFAMeT包含5′非编码区120 bp,3′非编码区968 bp和开放阅读框(ORF)1 536 bp,编码511个氨基酸。序列分析表明,PmFAMeT含有信号肽序列和跨膜结构域,并有WSC结构域、TSP1结构域和2个Methyltransf_FA结构域。将推导的PmFAMeT氨基酸序列与其他物种的FAMeT序列进行比对发现,不同物种的Methyltransf_FA序列同源性较高。PmFAMeT在马氏珠母贝的各个组织中均有表达,且在边缘膜、肝胰腺和性腺中的表达量显著高于其他组织。     

马氏珠母贝载脂蛋白-2基因的克隆与表达分析

以RACE技术克隆获得马氏珠母贝载脂蛋白-2(Pm-ApoL2)基因cDNA全长序列,以传统萃取法提取黄色与白色闭壳肌个体的类胡萝卜素,以荧光定量技术检测Pm-ApoL2基因在各个组织中的表达量及黄与白闭壳肌个体的Pm-ApoL2表达量。结果表明,Pm-ApoL2基因cDNA序列全长1 328 bp,开放阅读框(ORF)长705 bp,编码234个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长342 bp,3′UTR长281 bp。Pm-ApoL2在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃、闭壳肌,其中肝胰脏表达量显著大于其它3个组织(P0.05)。黄、白色闭壳肌个体之间的类胡萝卜素含量和Pm-ApoL2的表达量都存在显著性差异(P0.05),且二者的类胡萝卜素含量与Pm-ApoL2表达量呈显著正相关。Pm-ApoL2基因为马氏珠母贝类胡萝卜素代谢候选基因。     

哈维氏弧菌PspF基因的克隆及原核表达分析

【目的】对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603的PspF基因进行克隆与原核表达分析,优化表达条件。【方法】克隆哈维氏弧菌菌株ZJ0603的FspF基因,对其编码蛋白进行理化性质、信号肽、亚细胞定位、二级结构及三级结构分析,构建表达载体pET28a-PspF,经BamHI和XhoI双酶切和测序鉴定正确后转入表达菌株大肠杆菌BL21,对表达重组菌株进行表达条件优化及Western Blot鉴定。【结果与结论】PspF基因的开放阅读框(ORF)全长为1 179 bp,编码336个氨基酸,分子质量为38.04 ku,理论等电点5.27,不稳定系数41.97,总平均亲水性-0.382,PspF蛋白整体表现为亲水性蛋白。成功构建含pET28a-PspF的表达菌株,其最佳诱导条件为37℃下异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.2 mmol/L诱导6 h,其表达蛋白为38 ku。Western Blot结果表明PspF重组蛋白成功获得,蛋白同源性高,具有作为抗弧菌病疫苗的潜力。     

马氏珠母贝TRACP基因的克隆及组织表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)基因,分析该基因在不同组织中的表达模式。【方法】用RACE技术克隆得马氏珠母贝TRACP基因(PmTRACP),用实时荧光定量PCR分析该基因在外套膜、闭壳肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鳃中的表达。【结果与结论】PmTRACP基因长度为2 034 bp,开放式阅读框972 bp,编码323个氨基酸,5′UTR长度为27 bp,3′UTR长度为1 035 bp。预测PmTRACP分子质量约为36.39 ku,理论等电点为5.97。该基因含有一个钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域。PmTRACP与其他物种TRACP的同源性为48%～65%,与长牡蛎(Crassostrea gigas)TRACP的同源性最高,同时D³²、D⁷⁰、Y⁷³、N¹⁰⁸、H²⁰³、H²¹²、H²³⁷、H²³⁹等8个氨基酸活性位点和N¹¹⁴糖基化位点在不同物种TRACP中高度保守。PmTRACP与长牡蛎TRACP的亲缘关系最近。PmTRACP在马氏珠母贝各个组织均有表达,且在肝胰腺和珍珠囊中高表达。     

墨吉明对虾c型溶菌酶基因的克隆及表达

克隆并鉴定墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)的一种c型溶菌酶基因(Fm-Lyz),其cDNA全长为770 bp,包括71 bp的5′非编码区(UTR)、222 bp的3′UTR和477 bp完整开放阅读框,编码158个氨基酸。SMART分析显示,Fm-Lyz氨基酸序列包含1个LYZ1结构域和1个含18个氨基酸的信号肽。同源性分析发现,Fm-Lyz与斑节对虾(Penaeus monodon)溶菌酶同源性最高;进化树结果显示,Fm-Lyz与不同对虾的c型溶菌酶聚为一类。实时荧光定量PCR结果显示,Fm-Lyz在所测组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)感染后,Fm-Lyz表达量比对照组明显上调(P0.05),最高表达量时间分别为感染后24、12 h,暗示Fm-Lyz参与了墨吉明对虾的抗菌免疫防御。     

马氏珠母贝DNA甲基化转移酶Dnmt1的克隆及表达

【目的】对马氏珠母贝(Pinctada martensii)DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)的基因全长及组织表达作分析,探究马氏珠母贝甲基转移酶Dnmt1(PmDnmt1)参与贝壳矿化调控机理。【方法】利用RACE技术获得PmDnmt1的c DNA序列全长,并对PmDnmt1的序列特征进行分析,同时利用逆转录-聚合酶链反应RT-PCR技术检测马氏珠母贝不同组织中PmDnmt1的表达情况。【结果与结论】PmDnmt1基因c DNA长4 818 bp,其中,开放阅读框为4 623 bp,编码1 540个氨基酸。预测分子质量约为174.55 ku、理论等电点为5.89。结构域分析显示,PmDnmt1具有DMAP结合结构域、DNMT1-RFD结构域、锌指结构、BAH结构域和C5胞嘧啶DNA甲基化酶结构域等。多序列比对结果发现,Dnmt1在不同物种间具有较高保守性。实时荧光定量PCR分析显示PmDnmt1在所有检测组织中均有表达,在外套膜中央膜部分的表达量最高(P 0.05)。PmDnmt1可通过调控外套膜的DNA甲基化修饰参与贝壳的形成。     

马氏珠母贝B型清道夫受体PmSR-B基因克隆与表达性分析

采用c DNA末端快速扩增技术克隆获得马氏珠母贝清道夫受体基因c DNA全长序列(Pm SR-B);利用荧光定量技术检测Pm SR-B基因在各个组织中的表达量。结果表明,Pm SR-B基因c DNA序列全长1 857 bp,开放阅读框(ORF)长1 443 bp,编码480个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长89 bp,3′UTR长325 bp。预测其分子质量为54.77 ku,等电点为7.94,脂溶性系数92.94,总平均亲水性-0.120,属于疏水性蛋白;不稳定指数26.37,属于稳定蛋白。氨基酸序列同源比对结果,Pm SR-B氨基酸序列与其他物种具有一定的保守性,与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)SR-B的序列的相似度高达47%。荧光定量PCR检测结果,Pm SR-B在肝胰腺中表达量最高,其后依次是鳃、闭壳肌、中央膜,各组织的表达量差异具统计学意义(P0.05)。