一株甲胺磷高效降解菌——巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的分离及其分子鉴定

湘潭南天化工厂的甲胺磷废水未经处理直接排放,对湘江及下游的湖泊造成了一定的污染,利用解磷微生物去除江河湖泊中的甲胺磷污染是一条有效的途径.本文作者从被该厂甲胺磷废水污染的湖泊中分离细菌样品,以甲胺磷为唯一碳源和能源,经过定向筛选,得到一株可高效降解甲胺磷的菌株HN001.气相色谱测定结果表明,此菌株对甲胺磷的降解率在48h和96h分别为49.24%和98.20%.对其进行了常规生理生化测试,结果表明,该菌株与巨大芽孢杆菌的表型特征非常相似.为了进一步确定HN001的分类学地位,测定了其16S rRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了分子系统发生树,结果表明菌株HN001与巨大芽孢杆菌的亲缘关系最近.综合上述结果,菌株HN001可鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium).     

南极低温降解菌的筛选、鉴定与低温降解适应性分析

以南极海洋细菌为研究对象,采用2216E和MMC液体培养基结合的方法,从菌种库里筛选南极低温降解菌,进行石油烃降解率测定、表型特征确定和16SrRNA分子鉴定,构建系统发育树,并对南极低温降解菌NJ49的低温降解适应性进行了初步研究。结果表明,3株南极海洋细菌NJ41、NJ49和NJ289可以在以柴油为惟一碳源和能源的培养基中生长,被视为南极低温降解菌;16SrRNA分子鉴定结果表明,南极低温降解菌NJ41、NJ49和NJ289分别属于Planococcus、Shewanella和Pseudoalteromonas属;NJ49通过改变脂肪酸组分的膜修饰方式适应低温降解。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)病原副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的表型及分子特征

采用常规的形态及生理生化特性检验及分子生物学等方法,对引起凡纳滨对虾幼虾发生毁灭性死亡的病原菌进行了致病性、表型生物学及分子生物学的系统研究。结果表明,分离菌为弧菌属(Vibrio Pacini 1954)的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),对凡纳滨对虾、中国对虾及日本对虾仔虾均有强致病性。分离鉴定的4株副溶血弧菌具有淀粉酶、明胶酶、卵磷脂酶活性,但不具有蛋白酶、脂肪酶活性,KP溶血均呈阴性,且均具有K抗原;代表菌株(JGB080708-1株)的16S rRNA基因序列(长度为1456bp,GenBank登录号为GQ205448)和gyrB基因序列(长度为1195bp,GenBank登录号为GQ205453)与副溶血弧菌的两种基因序列相似性均可达98%以上。病原菌的耐药性检测结果显示,对供试49种抗菌药物中的林可霉素等6种药物耐药。     

一株海洋细菌对原油降解的分析

对实验室所获得的一株海洋细菌LU1进行原油的降解特性分析和降解条件的优化,结果表明,温度、pH、盐度、油质量浓度、接种量等均对石油的降解率有影响,在25℃,初始pH8.0,舍油量为0.5％的低盐条件下,其对原油的降解效果最佳,降解率达61％.将其与实验室分离得到的一株降解率为67％的原油降解微生物DYL-1混合后,其对...     

一株水产益生菌的鉴定

鉴定1株分离自中国对虾养殖水体的益生菌XE-7。进行了常规生理生化和细菌鉴定系统测试,结果表明,菌株XE-7与烟草节杆菌属(Arthrobacter)细菌的表型特征非常相似。为了进一步确定XE-7的分类学地位,测定了其16SrRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树。结果表明,菌株XE-7与烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)的亲缘关系最近。综合上述结果,菌株XE-7可鉴定为烟草节杆菌(A.nicotianae)。     

海水养殖鱼类鳗弧菌(Vibrio anguillarum)临床分离株的血清型和抗生素耐药谱

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是常见的海水鱼类病原菌,有23种血清型,其中O1—O3为主要的致病血清型。我国海水养殖鱼类鳗弧菌的血清型种类尚未明确。本研究对实验室分离和收集自海水养殖鱼类的31株鳗弧菌临床菌株进行了生理生化、16S r RNA基因序列、血清分型、抗生素敏感性的分析,旨在系统了解存在于我国海水养殖环境的鳗弧菌血清学型及耐药特征。首先用API ID32E生化反应鉴定系统对鳗弧菌进行生理生化鉴定,结果未能将待测菌株鉴定到种的水平;然后测定鳗弧菌的16S r RNA基因序列并构建系统发育树,结果显示所有分离株聚为一簇,与鳗弧菌有最近的亲缘关系(相似性99%—100%),据此可将临床菌株鉴定为鳗弧菌。以鳗弧菌O1—O5血清型标准菌株为O抗原制备兔抗血清,采用玻片凝集反应对鳗弧菌菌株进行血清学分析,结果显示属于O1、O2、O3、O5血清型菌株分别有16、5、3、1株,表明我国海水鱼类养殖存在3种血清型的致病性鳗弧菌,O1为主要流行的血清型。用ATB药敏检测系统检测鳗弧菌对28种抗生素的敏感性,结果显示菌株对7种抗生素(林可霉素、夫西地酸、甲硝唑、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、苯唑西林、青霉素)的耐药率为100%,对3种抗生素(红霉素、原始霉素、泰洛星)的耐药率为94.4%(34株),有83%以上的菌株(30株)对12种以上的抗生素产生耐药,表明我国海水鱼类养殖鳗弧菌普遍存在多重耐药性。研究结果为进一步揭示鳗弧菌的流行病学规律和防控弧菌病奠定了良好的基础。     

一株高效褐藻酸降解菌的筛选、鉴定及其发酵条件的优化

以褐藻酸钠为唯一碳源,从腐烂海带中筛选得到褐藻酸钠降解能力较强的菌株H4,经生理生化和16S rDNA序列分析鉴定该菌株属于交替单胞菌属(Alteromonas)。对菌株H4的发酵条件优化研究表明,H4的较优培养基组成为(w/v):褐藻酸钠0.6%、酵母粉0.5%、蛋白胨0.25%、NaCl 3%;较优培养条件为:培养温度28℃,初始pH7.5,接种量1.5%(v/v),培养时间48 h。Fe3+对交替单胞菌H4的产酶有明显的促进作用,这在其他褐藻酸裂解酶生产菌株中未见报道,而Cu2+对褐藻酸裂解酶的抑制作用高达45.78%。在优化后的培养条件下,粗酶液酶活达到146.45 U/mL,较优化前提高了39.4%。     

一株芘降解菌Bacilluscereus Py5的分离鉴定

为了研究蜡状芽孢杆菌的筛选、鉴定及对四环多环芳烃芘的降解性能。通过富集驯化培养,从红树林污泥中分离到一株以芘作为唯一碳源与能源的高效菌株PY5,经过形态观察、生理生化与16S rDNA鉴定, PY5属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),同时对该菌株降解芘性能进行了系统研究。结果表明,B.cereus对50mg/L芘的21d降解率为65.8%,投加Tween-80、葡萄糖、水杨酸、Fe3+、Mn2+等基质可以不同程度强化降解芘的能力,其中投加葡萄糖+Fe3++Mn2+的混合液对B. cereus降解芘的强化效果最好, 21 d的芘降解率可达到81.4%,相对于不加共代谢底物时提升15.6%,表明外加C源与酶活诱导因子对高分子质量多环芳烃污染降解具有一定的促进作用。     

仿刺参(Apostichopus japonicus) mtDNA三个基因片段的序列分析

采用PCR技术对中国烟台、威海和莱州三个地点仿刺参的16S rRNA、COI、IrRNA-COI三个mtDNA基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度约为570bp、640bp和900bp的三段序列,分析了三个采样点样品的遗传多样性。结果表明,每段基因序列扩增均获得两种单倍型,已在Genbank中注册(注册号码:AY852278—AY852283)。通过比较,三个地点样品的序列差异不显著,无缺失、插入、颠换的现象,只有个别位点出现转换,其中16S rRNA序列最为保守,16S rRNA、COI、IrRNA-COI三段序列A T的平均含量为56·2%、59·2%、61·8%,均大于G C含量。三个采样点样品同源性为99·84%—99·96%。将获得的仿刺参DNA序列和Genbank中的来自东太平洋8个外群进行基因序列比较,结果发现,不同目、科的海参的序列差异显著。采用DNAsp统计了各类位点数;MEGA2·1分析了碱基组成和遗传距离,构建了系统树。系统树体现的分类关系与这些物种的形态学分类关系完全一致。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原温和气单胞菌(Aeromonas sobria)分子鉴定及耐药性研究

采用常规生理生化特性测定及16SrRNA、gyrB及rpoD基因同源性检索与系统发育学分析等分子生物学方法,对引起养殖泥鳅大量死亡的病原细菌进行了综合鉴定。生理生化特性结果表明,分离菌株NQ090701与气单胞菌属的温和气单胞菌相近;16SrRNA、gyrB及rpoD基因Blast序列同源性检索与系统发育学分析均与温和气单胞菌相似性最高;综合形态与生理生化特征及16SrRNA、gyrB与rpoD基因的分子特征,确认分离菌株NQ090701为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。同时,采用试管稀释法测定了养殖生产中常用的10种抗菌药物对病原温和气单胞菌的体外最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC),结果表明氟哌酸杀菌作用最好,其次为盐酸沙拉沙星;甲砜霉素和复方磺胺甲恶唑在所试验的药物浓度范围对温和气单胞菌无杀菌效果。     

海南养殖罗非鱼(Oreochromis niloticus)致病链球菌的分离、鉴定及其药敏试验

采用常规的形态及生理生化特性检验、API20strep快速鉴定及分子生物学等方法,对引起2009年海南罗非鱼大规模死亡的病原菌进行了致病性、表型生物学,分子生物学及药敏试验的系统研究。结果表明,2株分离菌均为无乳链球菌,对罗非鱼具有很强的致病性。分离菌16SrRNA基因序列(GenBank登录存取号分别为GU363869和GU363870)与其它链球菌的16SrRNA基因同源性相似性在96.5%—100%之间,所测2株病原菌16SrRNA基因之间的同源性为100%。16SrRNA基因构建的系统进化树表明,2株病原菌均与无乳链球菌聚类。药敏试验结果表明,分离菌株对头孢类药物、阿莫西林、强力霉素等27种试验药物较敏感,对复方新诺明、卡那霉素等11种试验药物不敏感,对庆大霉素的敏感性不同。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的表型与分子鉴定

从江苏连云港某养殖场养殖死亡的泥鳅肝脏、血液及腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对泥鳅具有很强的致病性。采用表观分类学及分子生物学方法,对分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶活性及溶血活性等生物学性状检验;用PCR方法同时扩增其16SrRNA和gyrB基因,分析了16SrRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,通过基因序列分析,比较了两种基因在相似细菌的检测和鉴定能力;基于16SrRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌(LD081008B-1)所扩增的16SrRNA和gyrB基因序列均与GenBank数据库中霍乱弧菌具有较高的相似性,且gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;16SrRNA基因序列长度为1446bp(GenBank登录号:GQ205447),gyrB基因序列长度为1207bp(GenBank登录号:GQ205452);根据分离菌的表型特征及分子特征,判定病原菌为弧菌属(VibrioPacini1854)的霍乱弧菌(Vibriocholerae)。胞外酶活性及溶血活性检测表明分离菌均具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、明胶酶及DNA酶活性,在含7%家兔脱纤血...     

养殖鲟鱼出血症病原鲁氏耶尔森菌的分离鉴定和致病性研究

鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)是鲑鳟鱼类和温水性鱼类肠炎红嘴病的主要病原,可引起病鱼体表出血、肠道肿胀发炎等临床症状。本研究从患出血症施氏鲟(Acipenser schrenckii)中分离到一株致病性菌株(YR-H01),生理生化鉴定和16S rRNA基因序列分析表明YR-H01株为鲁氏耶尔森菌。人工感染该菌后发病鱼表现为肛门红肿、外突明显,部分鱼鳍基部和下颌处有出血现象,内脏器官不同程度出血,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对施氏鲟的半致死浓度为7.2×106CFU,且攻毒剂量越大,临床病症出现越快。病理组织切片显示,该菌感染鲟鱼后肝细胞发生明显病变,淋巴细胞侵润,肝索结构消失,细胞肿胀,核空泡变性或核仁边缘化。     

4株米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)藻际异养细菌的分离鉴定

采用分子生物学方法,对分离的米氏凯伦藻4株藻际异养细菌进行分子鉴定和功能分析。结果表明,经16S rRNA序列分析,4株藻际异养细菌分别隶属于Formosa、Erythrobacter、Shewanella和Marinobacter四个属,P1菌株与Formosa的16S rRNA核苷酸序列的同源性为95%,P2、P3和P4菌株与Erythrobacter、Shewanella和Marinobacter的同源性在99%以上。通过4株异养细菌及其同源性大的24株细菌构建进化树得出,28株细菌在系统发育树中主要分成4个分支,与同源性分析相符。     

文蛤属(Meretrix)16S rRNA基因及ITS1序列的系统学分析

利用线粒体16SrRNA基因片段及核糖体DNA转录间隔区ITS1序列分析的方法,以近缘属的青蛤(Cyclinasinensis)为外群,对文蛤属的文蛤(M.meretrix)、丽文蛤(M.lusoria)、帘文蛤(M.lyrata)和斧文蛤(M.lamarckii)4种贝类进行了系统学研究。经ClustalX多重比对及DNAsp软件分析后,用PAUP4.0分析软件,计算出种间序列的碱基转换/颠换频率,利用邻接法NJ构建系统发育树。结果表明,帘文蛤与该属其他三种的分歧时间较早,两类序列与其他种类间的相对遗传距离分别在0.25866—0.28218和0.15644—0.20104之间。文蛤与丽文蛤间的16SrDNA及ITS1序列间的遗传距离仅为0.04805和0.04201,拓扑结构图显示关系很近,并且二者的分布区大面积重叠,其序列间的转换/颠换频率接近种内单元型(haplotype)间的序列变化,鉴于它们的贝壳形态有一定差别,应归为同一个种内的不同地理亚种比较恰当。     

斑点叉尾(Ictalunes punctatus)源鲁氏耶尔森氏菌的分离鉴定及系统发育分析

从发病的斑点叉尾肝脏和肾脏均分离到一高致病性的菌株(FF003),感染该菌后斑点叉尾表现为体表多处点状出血,特别是在下颌、腹壁、体侧处,各内脏器官不同程度出血,尤其是腹内膜和鳔内膜斑块状出血。该菌为非发酵型需氧,革兰氏阴性杆菌,对除麦芽糖、甘露糖、果糖、海藻糖、D-甘露醇以外的多种糖类不利用产酸,氧化酶阴性,精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶阳性,MR阳性。在以该菌16S rDNA序列(GenBank登录号为FJ908709)和GenBank数据库内同源性较高的细菌16SrDNA序列构建的系统发育树中,分离菌FF003株与鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)聚为一个分支,结合形态和生理生化特点将其鉴定为鲁氏耶尔森氏菌。药敏实验结果表明氟哌酸、环丙沙星、强力霉素、氯霉素对其高度敏感,头孢拉定、克拉霉素、磺胺甲基异唑、庆大霉素、麦迪霉素等药物不敏感。     

养殖牙鲆鱼苗腹水症病原菌的鉴定及系统发育学分析

从患腹水症养殖牙鲆鱼苗分离到一株细菌B17，人工感染实验证实春具有致病性。用Biolog-GN细菌鉴定系统对B17进行测试，发现其与参考菌株的相似性较低，不能进行鉴定。常规生化测试表明，B17具有弧菌属的特征，其表型特征与Vibrio splendidus非常相似。为了进一步明确菌株B17的分类学地位，测定了其16SrRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建了系统发生树，结果表明菌株B17与V. splendidus的亲缘关系最近。综合上述结果，菌株B17可鉴定为V.splendidus。