绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)鱼头酸溶性与酶溶性胶原蛋白的分离纯化及理化性质研究

利用酸溶法和酶溶法制备马面鲀鱼头酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC),并对所制备的ASC和PSC的氨基酸组成、SDS-PAGE、红外光谱、黏度和热变性温度,以及溶解度等性质进行分析。结果表明:马面鲀鱼头中ASC和PSC的提取率分别为0.94%±0.07%和3.91%±0.14%。Gly(265.0和251.8残基/1000残基)、Ala(111.0和107.6残基/1000残基)和Pro(87.0和83.1残基/1000残基)含量较高,而His和Tyr的含量较少,且未检测到Cys。ASC和PSC中亚氨基酸(Pro和Hyp)含量为169.3和160.6残基/1000残基。氨基酸组成分析、SDS-PAGE和红外光谱(FTIR)证实ASC和PSC均属于I型胶原蛋白,热变性温度分别为17.6°C和16.5°C。在酸性p H值范围内,ASC和PSC的溶解度较高;当Na Cl溶液浓度高于2%,ASC和PSC的溶解度会显著降低。综上,相对于哺乳动物类胶原蛋白,马面鲀鱼头ASC和PSC的亚氨基酸含量和热变性温度较低,结构稳定性差,易于降解,可作为胶原蛋白肽的制备原料进行开发。     

绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)CYP19a基因克隆与表达特征分析

利用简并引物扩增及RACE全长克隆技术, 克隆得到绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)CYP19a基因cDNA全长序列。通过多序列比对, 发现具有芳香化酶特定保守序列, 包括一个I-螺旋区, 一个Ozol肽区, 一个亚铁血红素结合区域以及一个芳香化酶特异性结合区域。通过RT-PCR技术检测了其在绿鳍马面鲀成鱼各组织表达的情况, 发现其CYP19a基因只在卵巢中有表达; 同时也分析了其在不同卵巢发育期的表达情况, 发现CYP19a在卵黄发生后期表达量达到最高值, 卵巢退化吸收期表达量达到最低值。     

绿鳍马面鲀精子的超微结构

为探讨绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)精子的超微结构,作者应用扫描电镜和透射电镜观察了其精子外部形态与各部位的横切结构。结果表明:绿鳍马面鲀精子由头部和尾部两部分组成。精子头部呈卵圆形,无顶体,头部主要结构是细胞核,染色质致密,核内存在少量染色质空隙,无液泡;核后端正中有凹入核内的植入窝,呈棒状,植入窝较深,最深处占细胞核纵长的5/6,最宽处在细胞核末端,约占头部宽度的1/3。中心粒复合体位于植入窝内,由近端中心粒、中心粒间体和基体组成,近端中心粒的长轴与基体的纵轴垂直,排列方式为"T"型;头部末端为袖套,内含5个或6个均匀分布的线粒体球和少量随机分布的囊泡。尾部细长,自基体向后伸出,尾部无侧鳍结构,其核心结构是轴丝,轴丝为典型的"9+2"微管复合体结构。揭示其精子的形态结构,以期丰富硬骨鱼类繁殖生理学内容,同时为鱼种鉴别提供依据。     

绿鳍马面鲀早期生长发育与摄食特性的研究

在人工培育条件下,采用实验生态学方法,对绿鳍马面鲀(Thamnaconusmodestus)仔、稚、幼鱼生长、发育与摄食特性的变化进行了研究。结果表明,绿鳍马面鲀仔、稚、幼鱼的各生长指标可拟合为具有1～2个生长转折点的2～3段直线,其中全长、体长、体质量、肛前长、头长、吻长和体高可拟合为3段直线,眼径可拟合为2段直线。头长在第一转折点后的生长速率显著高于其他指标,除头长和体高在第二个生长转折点后生长速率减慢外,其余各项生长指标生长速度均逐渐加快。3～4日龄"开口期"前后的仔鱼,摄食发生率和饱食率均较低,随后逐渐升高。摄食发生率在12日龄后达到100%,饱食率在25日龄后达到100%(消化道充塞度为3～4级)。绿鳍马面鲀仔、稚、幼鱼均为白天摄食类型,白天摄食量占全天摄食量的71.6%以上。随日龄增长,鱼苗饱食时间呈下降趋势,消化时间则呈上升趋势。了解绿鳍马面鲀早期的生长发育与摄食特性,可为人工育苗管理提供参考,以促进鱼苗生长,提高成活率。     

温度、盐度对绿鳍马面鲀幼鱼存活及生长的影响

在工厂化条件下,通过控制养殖用水的不同温度、盐度,对绿鳍马面鲀幼鱼的存活及生长情况进行观测研究。结果表明:平均全长(42.66±5.23)mm的幼鱼存活的适宜温度为21～30℃,高于30℃时会引起大量死亡;体长和体质量生长的最适温度为21～24℃,高于24℃则生长速度减慢。幼鱼存活的适宜盐度为10～45,体长和体质量生长的最适盐度为25～35,超出此范围生长速度明显降低。     

绿鳍马面鲀肌肉营养成分分析和营养评价

作者以黄海野生绿鳍马面鲀(Thamnaconusseptentrionalis)为研究对象,按国家标准(GB5009.3-6-2010)进行检测,对其肌肉的一般营养成分和氨基酸、脂肪酸进行测定分析。结果表明:水分含量75.47%,粗蛋白含量17.88%(湿样),灰分含量6.15%,粗脂肪含量0.55%。肌肉中检测出17种氨基酸,其中含有7种人体必需氨基酸,平均含量35.70%,与总氨基酸含量平均比值为41.8%;鲜味氨基酸4种,平均含量34.33%,与总氨基酸含量平均比值为38.74%。其必需氨基酸组成符合FAO/WHO理想模式,属于优质蛋白质鱼类。肌肉(干样)中粗脂肪含量较低,含有7种饱和脂肪酸和18种不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸含量60.38%,其中EPA、DHA含量分别在8.71%和23.78%。根据氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS),第一限制氨基酸和第二限制氨基酸分别为蛋氨酸+半胱氨酸和缬氨酸,必需氨基酸AAS均大于1.0, CS均大于0.8。必需氨基酸指数(EAAI)为92.20,高于大部分经济鱼类。因此,野生绿鳍马面鲀肌肉各营养成分种类齐全含量较高,是理想的食用鱼类,今后值得继续开发。     

绿鳍马面鲀ERα 基因部分cDNA 序列克隆及其表达研究

雌二醇是与生殖相关的重要的性类固醇激素之一,它与雌激素受体相结合作用于靶器官从而发挥生物活性。为进一步阐明绿鳍马面鲀雌激素受体α(Estrogen receptorα,ERα)的生理功能提供了科学依据,同时也为其人工繁育提供一定的理论基础,作者利用简并引物扩增得到绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)ERα部分cDNA序列,共1410bp,编码470个氨基酸。通过半定量RT-PCR技术分别检测了其在雌鱼、雄鱼中各组织的表达情况,结果表明ERα在雌鱼体内的表达较雄鱼更广泛,在雌鱼垂体、心脏和卵巢的表达量最高,在雄鱼的垂体、肝脏、肾脏、精巢也有较高的表达。采用实时定量RT-PCR技术,分析了ERα在性腺中的周年表达情况,卵巢中ERαmRNA在5月表达量最高,7月最低:精巢中在5月最低,9月最高。该项研究表明ERα与绿鳍马面鲀生殖周期存在密切关联,提示在性腺发育过程中发挥一定作用。     

盐度对绿鳍马面鲀存活、抗氧化酶及组织结构的影响

绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)作为中国沿海新兴网箱养殖种类, 在夏季多雨季节会经历盐度剧烈变化的过程, 因而探明盐度对绿鳍马面鲀存活和生理指标的影响, 对开展网箱养殖具有重要意义。本研究首先测定了绿鳍马面鲀的96 h半致死盐度, 随后分别设置低盐组(15)和高盐组(40), 分析盐度胁迫不同时间后生理指标的动态变化规律, 观察肝脏、鳃和肾脏的组织结构改变。结果显示, 绿鳍马面鲀96 h半致死低盐度为10.74, 半致死高盐度为42.95。低盐组和高盐组鳃Na⁺-K⁺-ATP酶活呈上升趋势, 且高于对照组, 在96 h时各组差异性显著(P<0.05)。低盐组和高盐组肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性均表现为先上升、后下降的趋势, 在96 h时均低于对照组; 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性呈先下降后上升的趋势, 在96 h时低盐组显著低于高盐组(P<0.05)。低盐组和高盐组肝脏丙二醛(MDA)含量在96 h达到最大值, 且显著高于对照组(P<0.05)。组织切片显示, 低盐组和高盐组肝细胞出现空泡和细胞核固缩的现象, 且高盐组更为严重; 鳃丝上皮细胞排列紊乱、细胞坏死, 低盐组鳃丝变宽, 鳃小片变长, 高盐组鳃丝萎缩, 鳃小片间距变大; 肾组织低盐组出现肾小管管腔扩张、肾小囊腔膨大, 高盐组出现肾小管和肾小球坏死的现象。本研究探究了盐度对存活、抗氧化酶及组织结构的影响, 可为绿鳍马面鲀健康养殖提供理论支持。     

人工培育条件下绿鳍马面鲀Thamnaconus modestus胚胎发育的研究

2010年春、夏季对绿鳍马面鲀的人工繁育技术进行研究.以驯化的2～4龄野生绿鳍马面鲍作为亲鱼,人工采卵、半干法授精获得发育同步的受精卵.受精卵孵化条件:水温为(21.O士0.5)℃,S为32～33,pH为7.8～8.2,微充气.对绿鳍马面鲀的胚胎发育进行观察、拍照,分析各发育时期的发育时序和形态特征.绿鳍马面鲍受精卵为...     

绿鳍马面鲀微卫星标记开发及在丝背细鳞鲀中的通用性检测

为充分挖掘绿鳍马面鲀(Thamnaconus modestus)基因组资源,开发可用于群体遗传学研究的分子标记,本研究利用NCBI数据库中公布的绿鳍马面鲀全基因组序列筛查微卫星位点并在野生群体中验证,在85个选取的位点中筛选得到30个新的多态性较高的微卫星标记。每个微卫星标记的等位基因数为4~16,平均为8.5个;观测杂合度范围为0.207~0.916,平均值为0.685;期望杂合度范围为0.315~0.971,平均值为0.756;多态信息含量范围为0.301~0.898,平均值为0.716,其中属于高度多态的位点有26个,占总位点数的86.67%;经过Bonferroni校正后,有7个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。将30个绿鳍马面鲀多态性微卫星标记在丝背细鳞鲀(Stephanolepis cirrhifer)中进行通用性检测,其中13个位点成功扩增,9个位点具有多态性。本研究开发的微卫星标记可用于绿鳍马面鲀及相关物种的遗传多样性分析、QTL定位以及系统进化等研究。     

刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合症发生相关蛋白的分离与鉴定

采用比较蛋白质组学的方法,对2011年10月20日取自辽宁省普兰店室内养殖厂腐皮综合症刺参和健康个体肠组织中差异表达蛋白进行了研究。结果表明,在优化的电泳条件(80μg脱盐蛋白、pH4—7[NL,13cm]的IPG预制胶条)下,共检测到约700个蛋白质点;表达量差异两倍以上的蛋白点51个,最大表达差异比率为4.32;对其中重复性一致的30个差异点进行质谱鉴定,成功鉴定了23个差异蛋白,包括铁蛋白,过氧化氢酶,泛素相关修饰子3,细胞色素氧化酶和肌动蛋白等;进一步扫描实验室完成的刺参转录组数据,筛选了过氧化氢酶和泛素相关修饰子3的EST序列。本研究是蛋白层面上刺参腐皮综合症发生机制的有效尝试,研究结果为进一步认识该疾病的发生机制提供了参考。     

一株大口黑鲈源ST-873型肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的分离鉴定及生物学特性研究

从患腹水病大口黑鲈(Micropterus salmoides)的头肾、脾脏、肝脏组织中分离到一株优势菌,生长出圆形、边缘整齐的灰白色黏液状菌落;染色镜检可见短粗、卵圆形、有荚膜的革兰氏阴性杆菌。结合形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析鉴定为肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),MLST分析进一步确定其为ST-873型,与ST-65型聚为一支;该菌株携带aere、alls、wca和ybt四种毒力基因,具有溶血活性;人工感染大口黑鲈,发现患病鱼呈现腹水等与自然发病类似的症状,且病鱼内脏的分离菌株与攻毒菌株相同;经统计,其LD50为3.4×10⁷ CFU/mL,具有中等生物被膜形成能力。耐药性分析结果显示,该菌株携带bla-shv、sul2、aadA和tetB四种耐药基因,对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、黏菌素类药物敏感,对四环素类、磺胺类、林可酰胺类、利福霉素类耐药;中药三七、款冬花对分离菌株有明显抑制作用。研究探明了大口黑鲈腹水病的主要病原,可为鱼源肺炎克雷伯菌的诊断和防治提供科学依据和数据参考。     

大竹蛏(Solen grandis)cDNA文库中微卫星标记的筛选

利用微卫星查找软件SSRIT对大竹蛏cDNA文库(2038条EST)中2—6个碱基重复单元组成的简单序列重复进行了筛选。最少重复次数设定为5次,共发现包含微卫星位点的EST96条,占整个EST数据库的4.71%;共发现微卫星位点103个,其中含双碱基重复序列77个,数量最多,占总数的74.76%;三、四碱基重复序列分别占微卫星序列总数的22.33%、2.91%,没有发现五或六碱基的重复。对含有SSR位点符合微卫星引物设计的EST序列,利用在线引物设计软件Primer3设计合成引物14对,以南通野生群体为模板PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳发现,其中5对有多态性位点。在5个微卫星位点上,等位基因的数目从2—7个不等,观测杂合度和期望杂合度分别为0.067—1.000和0.066—0.775,香农指数在0.146—1.545之间。结果表明,所筛选的微卫星标记可用于遗传分析。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)微卫星位点的分离和序列分析

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从三疣梭子蟹基因组DNA的Sau3A1酶切的500-1000bp片段中筛选微卫星序列.洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出阳性克隆进行测序.在56条测序序列中有49条非冗余序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到87.5%.其中perfect类型微卫星最大的重复次数为47次.在47条非冗余序列中,共有40条(85.1%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计.本研究中筛选的微卫星位点将为下一步的三疣梭子蟹种群遗传结构分析、经济性状的QTL定位提供遗传标记.     

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)卵黄蛋白原的纯化、性质鉴定及ELISA检测方法的建立

腹腔注射17β-雌二醇(E2),使瓦氏黄颡鱼雄鱼在7天内产生卵黄蛋白原(Vtg)。采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从E2诱导的雄性瓦氏黄颡鱼血浆中分离、纯化出Vtg,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为Vtg,该Vtg在非变性条件下分子量约为240kDa,在SDS变性条件下分子量约为143kDa。纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg经检测显示可能含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清。用双向免疫扩散法测得抗血清的纯度较高,效价为1︰32;Western blotting检测显示抗血清的特异性较好。以瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清为抗体,以纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测瓦氏黄颡鱼体内Vtg的含量,标准曲线线性部分的线性方程为y=0.099x+0.4529(R2=0.9327),该方法检测的灵敏度为15.6ng/ml,工作范围为31.2—4000ng/ml,在此范围内,标准曲线具有良好的线性。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病性维氏气单胞菌的分离鉴定与药敏特性研究

本研究从自然发病的养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肝脏处分离得到1株优势菌9L2,经形态学观察和传统生理生化鉴定,显示该菌为发酵型革兰氏阴性短杆菌,有动力,氧化酶阳性,水解赖氨酸及色氨酸等。利用Biolog细菌鉴定方法进行种属鉴定,确定9L2为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),相似性达100%。同时对其16S rDNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析,结果表明该菌与气单胞菌属的菌株亲缘关系最近,与维氏气单胞菌(登录号为LMG13695)的16S rRNA基因序列相似性达99.79%。经人工腹腔注射感染吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的试验结果表明,9L2对罗非鱼的半数致死剂量LD_(50)为1.08×10~3CFU/g。24种抗生素药敏试验结果表明,该菌株对诺氟沙星、新生霉素、呋喃妥因、头孢曲松等13种药物高度敏感,对洛美沙星、卡那霉素等5种药物中度敏感,对利福平、青霉素等6种药物产生耐药性。20种中药体外抑菌试验结果表明,其中11种对致病菌体外抑菌效果较好,平均抑菌浓度范围为0.11—7.20mg/mL。     

一株海洋牟勒氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）病毒的分离与初步鉴定

以海洋赤潮藻为材料,从宁波市象山港附近海域采取水样,经反冲超滤法对水样进行浓缩处理后,用其对培养的赤潮藻细胞进行感染,分离到了一株能裂解牟勒氏角毛藻的病毒,经反复的液体感染,建立了稳定的藻病毒-宿主藻系统,命名为牟勒氏角毛藻病毒。该病毒具有很强的感染力,稀释10^8倍以后仍然具有明显的感染效果。病毒纯化后,电镜观察显示...     

斑点叉尾鮰(Ictalunes punctatus)源中间气单胞菌(Aeromonas media)分离鉴定及药敏特性

从湖南常德某养殖场死亡的斑点叉尾（Ictalunes punctatus）肝脏、肾脏、腹水及血水中分离到一株致病性菌株zy02。对该菌进行了形态特征观察、理化特性测定及分子生物学方法鉴定,用PCR方法同时扩增其16S rDNA和gyrB基因,分析了16S rDNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树。经生理生化测定和16S rDNA与gyrB基因序列分析,zy02株为中间气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾的半致死浓度为3.89×10⁶CFU/mL。菌株zy02对多西环素、庆大霉素及左氧氟沙星等高度敏感;对红霉素中度敏感;对阿莫西林、磺胺异噁唑、克林霉素及利福平等5种药物耐药。本研究为斑点叉尾该病防控提供了理论依据。