对虾白斑杆状病毒基因中的小顺反子及其表达

通过对虾白斑杆状病毒DNA文库和cDNA文库的碱基序列测定和分析,发现对虾白斑杆状病毒的一个开放阅读框的前导序列中含有一个小顺反子,这个小顺反子较多使用对虾基因和白斑杆状病毒基因的稀有密码子.试验表明在该基因的前导序列中存在或不存在小顺反子时,该基因都可在大肠杆菌中诱导表达,但两者的表达量不同.小顺反子可能对基因的表达具有调控作用.     

白斑综合症杆状病毒致病性特征

对白斑综合症杆状病毒（ＷＳＢＶ）致病性特征的研究结果表明：ＷＳＢＶ的致病性与斑节对虾Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ个体大小无关,ＷＳＢＶ的致病力与感染方式和病毒数量有关;在盐度为１４、温度为２８－３２℃的海水中,游离ＷＳＢＶ在４ｈ内失去感染活性;体长７ｃｍ的白斑综合症死亡斑节对虾,其携带的ＷＳＢＶ在５７ｈ失去感染活性;体长７ｃｍ死亡斑节对虾经２８℃空气干燥,其携带的ＷＳＢＶ在５０ｈ失去感染活性;ＷＳＢＶ不能通过体表感染健康斑节对虾,而斑节对虾摄食一定数量病毒才能导致感染;水不能作为游离ＷＳＢＶ的载体传播ＷＳＢＶ。     

Diagnosis of iridovirus in large yellow croaker by PCR

A rapid and sensitive PCR-based method for the detection of the large yellow croaker iridovirus(LYCIV) is described,which involves the amplification of a 295 bp fragment of the LYCIV ATPase gene from DNA isolated from naturally infected fish spleen.Sequencing of LYCIV ATPase gene fragment showed it shared 100% nucleotide sequence homology with the corresponding region of the ATPase gene of red sea bream iridovirus(RSIV) and sea bass iridovirus(SBIV),suggesting that LYCIV was homologous with RSIV and SBIV at least in part of the gemone.The specificity and sensitivity of the PCR procedure were tested on the iridovirus-infected fishes,the expected fragment was detected from spleen DNA samples of infected fishes,whereas no fragments were amplified from healthy fish spleen DNA,white spot syndrome baculoviruses(WSBV) DNA and pseudorabies virus(PRV) DNA.Detection limit of this method was 10^-7 ng positive plasmid DNA containing target sequence,equal to about 100 virions.In the infected experiment,first positive detection(1/4) appeared at Day 3 post-infection,all fish(4/4) tested positive at Day 7,however obvious symptoms were observed at Day 8,so LYCIV infection could be detected prior to the appearance of obvious symptoms.These results indicate that this PCR method could be used for early,rapid and specific detection of LYCIV infection.     

白斑综合症杆状病毒(WSBV)PCR检测方法的改进及应用

斑节对虾Penaeusmonodon白斑综合症是由白斑综合症杆状病毒 (WSBV)所致。患有典型白斑综合症的斑节对虾 ,用两种提取病毒模板DNA的方法 ,进行PCR扩增 :一种是用传统的方法 ,即蛋白酶K ,CTAB等消化 ,酚 /氯仿抽提 ,乙醇沉淀得到DNA ;另一种是用改进的煮沸法提取病毒DNA。对比发现后一种方法稳定性及敏感性比前者高 ,重复性好。用后一种方法对病虾的复眼进行检测 ,PCR结果为阳性。应用后一种方法还对病虾的各组织器官及人工感染的虾进行检测 ,发现病虾中除肝胰腺外 ,附肢、肌肉、心脏、鳃、胃、中肠、神经、复眼、表皮结果均为阳性。感染实验中 ,出现阳性结果注射感染比投喂感染早 ,而且肌肉和附肢较敏感。     

Expressed sequence tag analysis and cloning of trehalose-6-phosphate synthase gene from marine alga Laminaria japonica (Phaeophyta)

A high quality cDNA library was constructed from the brown alga Laminaria japonica,with the titer of 1.2×10 5 pfu/ml.The average insert size of the cDNA library is about 1.6 kb.From the cDNA library,591 cDNA clones were randomly selected and sequenced.As a result,574 EST(expressed sequence tag) sequences were generated.All of the 574 ESTs were submitted to the dbEST database section of GenBank with the accession numbers from CX942625 to CX943198.The cDNA library was screened with a α-32 p labeled 453 bp T P S gene probe,which is a partial sequence yielded from Porphyra yezoensis.Four positive cDNA clones were screened and the sequencing data showed that these four cDNA clones covered majority of L.japonica TPS cDNA sequence.After PCR amplification,sequencing and assembling,the entire ORF(open reading frame) sequence of the T P S gene was obtained,which was named LjTPS.LjTPS encodes a protein containing 908 amino acids with a calculated molecular mass of 101 674 Daltons.The LjTPS gene was successfully expressed in E.coli and rice.The LjTPS gene has potential application both in plant breeding to stress tolerance and in deciphering the T P S gene function and mechanism to stress tolerance.     

半滑舌鳎促黄体激素受体基因片段的克隆及组织表达分析

采用巢式RT-PCR法克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis促黄体激素受体(Luteinizing Hormonene Receptor, LHR)基因部分序列,经过BLAST比对,认为该序列与庸鲽、牙鲆、黑鲷、尼罗罗非鱼、青鳉和红鳍东方鲀的LHR基因同源性分别为97%,94%,85%,83%,82%和80%.该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,含有典型的跨膜螺旋结构区域(TM helix),属于糖蛋白激素受体(GHR)家族.组织表达分析表明,LHR基因在半滑舌鳎的卵巢、精巢、肝脏、胃、肠、鳃、心、脾、肾、头肾和脑中均有表达,表达量有所不同,以脾和肾中表达量最丰富.     

副溶血弧菌一种糖蛋白酶(复苏促进因子)在大肠杆菌中的表达及性质

用PCR方法从副溶血弧菌8621.4基因组中扩增出1种细胞复苏促进因子家族的糖蛋白酶(Glycoprotease,Gcp)基因,核酸序列分析表明其含有完整的gcp基因开放阅读框,编码233个氨基酸组成的蛋白质.核酸序列与副溶血弧菌糖蛋白酶家族基因的序列相似性为100％.其氨基酸序列与哈维氏弧菌HY01、弧菌Ex25、溶珊瑚弧菌、拟态弧菌和杀鲑弧菌LFI1238等糖蛋白酶的序列相似性为67％～92％.将该基因克隆到表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,用Ni琼脂糖亲和柱层析纯化的蛋白为单一条带,利用纯化的Gcp免疫新西兰大白兔制备特异性抗体,Western-Blotting分析发现正常生长及活的非可培养状态(VBNC)诱导过程中的副溶血弧菌细胞内表达的Gcp蛋白为1条带,分子量约为27 kDa,而在VBNC状态的菌体中检测到2条蛋白带.研究结果为进一步探索海洋弧菌活VBNC的形成和复苏机制奠定基础.     

致病性鳗弧菌W-1外膜蛋白ompU基因克隆及在大肠杆菌中的表达

从致病性鳗弧菌W-1基因组DNA扩增并克隆了1 156bp的特异性片段,含有完整的外膜蛋白ompU基因阅读框,由993个核苷酸组成,编码330个氨基酸残基的蛋白质。与国外已发表的鳗弧菌外膜蛋白基因的序列同源性为100%,与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的序列同源性分别为72%,69%,68%和64%。将该外膜蛋白基因克隆于pBV220表达质粒,在大肠杆菌中得到了表达,SDS-PAGE分析表明表达蛋白分子量约38kDa,Western blot分析发现表达蛋白能与鳗弧菌外膜蛋白抗体很好的反应。     

凡纳滨对虾P23蛋白基因的筛选、表达和生物信息学分析

克隆凡纳滨对虾极端体重个体的组织差异表达基因P23基因并进行生物信息学分析, 为进一步研究该基因的功能以及凡纳滨对虾的分子选育等研究提供信息。以凡纳滨对虾雌虾极端体重个体腹部肌肉为实验材料, 利用抑制消减杂交(SSH)技术构建极大体重雌性个体和极小体重雌性个体腹部肌肉组织正反向消减cDNA文库:正库(以极大体重个体为试验组, 以极小体重个体为驱动组, L-S)和反库(以极小体重个体为试验组, 以极大体重个体为驱动组, S-L)消减cDNA文库, 并采用实时定量技术分析P23基因的组织表达规律, 利用生物信息学对其功能和结构进行预测。以β-actin为看家基因检测两个文库的消减效率分别为210和25, 实时定量技术分析结果表明P23基因在体重的调节中起上调作用。P23基因编码区序列全长495bp, 编码165个氨基酸, GenBank登录号:JF806619。生物信息学分析发现P23蛋白部分序列含有强疏水性, 无跨膜螺旋结构, 两种信号肽预测都显示P23含有信号肽。     

盐藻的一种盐诱导碳酸酐酶基因转录起始点的确定及表达载体的构建

采用5′RACE和巢式PCR的方法确定盐藻(Dunaliella salina)一种盐诱导碳酸酐酶基因的转录起始位点,通过序列分析得出转录起始位点为A,从而确定核心启动子及上游调控区的位置。应用巢式PCR技术分别扩增盐藻这种碳酸酐酶基因上游调控区的2个片段,长度大约分别为0．8和1．2kb,序列经测定无误后分别与带β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因的载体相连接,经酶切鉴定这两种表达载体构建正确。用基因枪法将这两个载体导入盐藻细胞中,经染色检测,GUS基因在转化藻株中得到瞬时表达。     

大型多管水母的绿色荧光蛋白

采用PCR扩增和southern杂交筛选相结合的方法,从厦门水域的大型多管水母中分离到了新的绿色荧光蛋白基因gfpxm,并在大肠杆菌中进行了表达.gfpxmDNA序列编码区长为1042bp,包含3个外显子和两个内含子,cDNA编码区全长为717bp.gfpxmcDNA与已知野生型Aeqgfp 10cDNA长度一致,核苷酸同源性为81.9%,推导的氨基酸序列全长为238个氨基酸,与AeqGFP10的氨基酸同源性为83.6%.将gfpxm克隆至pTO-T7表达载体,GFPxm在大肠杆菌BL21中的表达量达菌体总蛋白的50%左右.荧光性质和强度分析结果表明,GFPxm蛋白的激发峰为476nm,发射峰为496nm,荧光量子产率为1. GFPxm蛋白的荧光很稳定,对热、碱性、变性剂和盐等有较强抗性.     

缩骨鲫(Carassius auratus sogu var.)MC4R克隆、组织分布以及与生长相关SNPs的筛选

黑色素皮质素受体-4(Melanocortin reporter-4,MC4R)是G蛋白偶联受体超家族成员,在能量调控中发挥重要作用。本实验采用同源克隆以及染色体步移对缩骨鲫(Carassius auratus sogu var.)MC4R基因进行克隆,对其核苷酸序列和推测的氨基酸序列进行生物信息学分析,通过Real-time PCR对其m RNA组织分布进行研究,并对缩骨鲫MC4R编码区潜在的与生长相关的SNPs进行筛选。本实验克隆MC4R基因组基因长度为2854bp,只包含一个外显子,长度为981bp,共编码326个氨基酸,MC4R共有七个跨膜结构,是较为稳定的疏水蛋白。缩骨鲫MC4R与鲫鱼的MC4R氨基酸序列的同源度最高达到99.3%,与MC3R和MC5R同源度相对其他MCRs成员较高。缩骨鲫MC4R m RNA在脑中表达量最为显著,眼中次之,肌肉,卵巢和肾脏中表达较少,在鳃、肠、心脏和肝胰腺中微量表达。在MC4R的CDs区内检测到6个与生长潜在相关的SNPs:两个错义突变(A199G和A881C),4个同义突变(A123G,C231T,A444G和C480T)。本实验可为缩骨鲫生长和发育的分子机制研究以及遗传育种提供基础资料。     

地芽孢杆菌属DYth03 DNA聚合酶基因的克隆、表达及性质分析

从东太平洋热液区E53站位的深海沉积物样品中分离出1株能在65℃生长的嗜热菌（DYth03）.该菌的16S rDNA序列与地芽孢杆菌属（Geobacillus）内各种之间的同源性为98%以上.克隆得到DYth03的DNA聚合酶基因（DYth-pol）,序列分析表明该基因全长为2 631 bp,G＋C含量为55.5%,推测编码为876个氨基酸,与BstDNApolI的同源性最高（达98%）.将该聚合酶基因克隆到pTTQ-h表达载体上,并在大肠杆菌DH1中进行表达.对纯化到的表达产物进行酶活性测定,结果表明该酶具有聚合酶活性和5’-3’外切酶活性.     

香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)新型凝集素ChPerlucin的基因克隆与功能研究

C-型凝集素(C-type lectin)是一类能识别并结合多糖的免疫蛋白质超家族, 本文首次克隆了一种新型香港牡蛎C-型凝集素基因——甘露聚糖结合凝集素, 并获得了该基因的全长序列, 命名为ChPerlucin。结果显示, ChPerlucin基因cDNA全长577bp, 包括21bp的5′末端非翻译区(untranslated region, UTR)、73bp的 3′UTR, 以及483bp的开放阅读框(open reading frame, ORF), 编码160个氨基酸, ChPerlucin蛋白理论分子量为18kD, 等电点为5.95。ChPerlucin蛋白含有保守的C-型凝集素样结构域(C-type lectin or carbohydrate-recognition domain, CLECT); 邻接法(Neighbor-Joining, NJ)进化树分析表明, ChPerlucin与其他贝类的Perlucin聚为一支, 说明该基因是软体动物Perlucin家族的新成员。qRT-PCR结果显示, ChPerlucin在香港牡蛎所检测组织和各个胚胎发育时期中均有表达; 病原菌刺激后, ChPerlucin表达量显著升高; 利用毕赤酵母真核成功表达了ChPerlucin重组蛋白, 发现ChPerlucin重组蛋白具有抑菌效果。以上结果表明ChPerlucin在香港牡蛎的先天性免疫过程中发挥了重要的作用。     

Expression, purification and polyclonal antibody generation of p23, an Hsp90 cochaperone, in the amphioxus Branchiostoma belcheri

1Introduction p23, the 23-kDa protein originally identified asa component of the complex of heat shock protein 90(Hsp90) with the progesterone receptor (Johnson etal., 1994), is a ubiquitous and highly conservedprotein from yeast to humans (Garcia -Ranea …     

Molecular cloning and expression analysis of Crustin-like gene from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

A new member of antimicrobial protein genes of the Crustin family was cloned from haemocytes of the Chinese shrimp Fennero- penaeus chinensis by 3 ′and 5′ RACE. The full-length cDNA of Crustin-like gene contains a 390 bp open reading frame, encoding 130 amino acids. The deduced peptide contains a putative signal peptide of 17 amino acids and mature peptide of 113 amino acids. The molecular mass of the deduced mature peptide is 12. 3 ku. It is highly cationic with a theoretical isoelectric point of 8.5. The deduced amino acids sequence of this Crustin showed high homology with those of Penaeus （ Litopenaeus ） setferus. Northern blotting showed that the cloned Crustin gene was mainly expressed in haemocytes, gill, intestine, and RNA in situ hybridization indicated that the Crustin gene was constitutively expressed exclusively in haemocytes of these tissues. Capillary elec- trophoresis RT-PCR analysis showed that Crustin was up-regulated dramatically from 12 to 48 h after a brief decrease of mRNA during first 6 h in response to microbe infection. The level of Crustin mRNA began to restore at 72 h post-challenge. This indicated that Crustin gene might play an important role when shrimps are infected by bacterial pathogen.     

白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因的克隆及在蓝藻中表达载体的构建

用蔗糖密度梯度离心法分离纯化白斑综合症病毒（WSSV）。设计并合成引物，提取WSSV中国株的基因组DNA作为模板，通过PCR，扩增克隆出VP28基因，利用BamHI和EcoRI切点将VP28基因插入克隆载体pUC19 的多克隆位点上，得到VP28基因的重组克隆质粒，对其进行双向DNA测序。测序结果表明，该基因含有615个核苷酸，与GenBank中已有不同来源的WSSV的序列片段同源性为100％。利用BamHI切点将VP28的基因插入到穿梭表达载体启动子PpsbA的下游，EcoRI酶切鉴定，得到正向连接的可在蓝藻表达的重组穿梭表达载体，命名为pRL-VP28。     

Xp11.2区域YAC OAT1中表达顺序筛选

筛选 X染色体 Xp11.2区域的酵母人工染色体 ( YAC)克隆 OAT1所包含的表达序列 ,为该区域疾病相关基因的克隆探索方法。以 YAC克隆 OAT1为探针 ,与胎脑 c DNA文库的噬菌体原位裂解膜进行两轮杂交。所得的阳性克隆经过杂交鉴定剔除假阳性克隆和重复序列 ,并进行测序分析。获得了一个 YAC OAT1编码的表达顺序克隆。该克隆与鸟氨酸转氨酶 ( Ornithine Amino-transferase,OAT)基因同源     

hairy和hedgehog在单环刺蜢幼虫体节形成过程中的表达特征分析

hairy作为成对控制基因参与果蝇等体节动物的体节形成;体节极性基因hedgehog是节肢动物和环节动物体节边界维持的关键基因。本研究分析了单环刺螠hairy的序列特征以及hairy和hedgehog在其幼虫体节发生过程中的时空表达特征,结果显示:单环刺螠Hairy序列中含有保守的HLH结构域、Hairy_orange结构域和四肽WRPW;其mRNA在早期体节幼虫中的表达量显著高于晚期担轮幼虫,并且定位于每个体节的边界处。单环刺螠hedgehog mRNA在体节幼虫中的表达水平显著高于早期体节幼虫,并且呈现保守的体节边界表达特征。研究结果表明,hairy和hedgehog在单环刺螠幼虫体节中的表达图式与小头虫等典型体节动物中的表达图式基本一致。