凡纳对虾优良性状遗传标记的筛选

凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)是全球三大养殖对虾名优种类之一。我国从1988年开始试养，到1998年大量引进凡纳对虾亲虾和幼体后，华南地区兴起了养殖热潮。在1999年到2000年短短两年时间内，广东、海南、广西凡纳对虾的养殖面积已达10×104亩(1亩=666.7m2)，集约化防病养殖产量普遍达到5~9t/hm2，年产量高达10~20t/hm2，其养殖面积约占华南地区对虾养殖面积的60%，普遍获得了比养殖斑节对虾更好的经济效益，成为我国继中国对虾、斑节对虾之后的又一养殖对虾种类。从凡纳对虾养殖业的长远发展战略来看，如何避免斑节对虾因病害而造成养殖业全面萎缩的情况在凡纳对虾养殖业中重演已成为重要研究内容。 美国夏威夷海洋硏究所等单位利用遗传标记辅助选育种技术进行凡纳对虾良种选育和家系培养取得了很大的成效，培育出世界著名的无特异病原(SPF)凡纳对虾亲虾，在全球对虾养殖产量下滑的形势下仍然保持良好的增长趋势，其关键是种虾的选择和家系的培育。 Garcia等(1994)利用遗传标记技术进行了凡纳对虾种群的遗传标记研究，发现种群之间具有较高水平的遗传变异，因而有潜力进行凡纳对虾良种的人工选育。 本研究利用RAPD标记技术，对目前养殖凡纳对虾不同群体进行DNA多态性研究，筛选与优良性状有关的遗传标记，为凡纳对虾优质种苗的鉴定、选育和今后遗传标记辅助选育种提供了科学依据。     

RAPD技术在中国对虾群体鉴别上的应用

采用RAPD技术对中国对虾(Penaeus chinensis)、中国黄海、渤海沿岸种群(H)朝鲜半岛西海岸种群(K)和即墨健康养殖群体(S)的DNA进行检测,41个随机引、物在3个群体间共筛选到了3个稳定的RAPD标记F-02₅₄₀,OPN-13₈₀₀和OPN-20₂₂₀₀,可用于群体间的鉴别,研究将为中国对虾分子标记遗传育种提供依据。     

凡纳滨对虾EST-SSR标记的筛选及遗传多态性检测

为了研究我国海南地区某凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)繁育群体的种质资源多样性,选取14个比利时野生对虾的EST微卫星标记,以240个中国人工选育的凡纳滨对虾个体为研究对象,检测这些标记在该养殖群体遗传多样性评估中的可行性,结果表明,有7个引物可扩增出清晰条带,其中5个引物(CNM-MG 345,...     

斑节对虾3个野生群体遗传多样性的微卫星标记分析

为探究不同地理条件下斑节对虾天然群体的遗传多样性和遗传分化水平, 选用14对简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)特异引物对广东湛江、海南三亚、海南琼海的斑节对虾天然群体共计90尾个体进行微卫星标记分析, 每对引物检测出的等位基因数为2~4不等, 平均2.7。3个群体(湛江、三亚、琼海)平均有效等位基因分别为1.9081、1.9715和2.0185, 平均多态信息含量分别为0.3864、0.3926和0.4078, 总的平均期望杂合度(0.4605 )明显高于观测杂合度(0.4046), 表明3个群体遗传多样性水平为中等, 且存在杂合度缺失的现象。种群分化指数和遗传距离分析表明, 在不同群体间已产生了遗传分化, 但是分化较小; 三亚群体和琼海群体之间的亲缘关系最近, 而与湛江群体的亲缘关系最远。分子方差分析表明, 群体间的遗传变异指数为8%, 群体内个体间的遗传变异指数为92%, 基因分化主要发生在群体内, 而不是群体之间。     

凡纳滨对虾G蛋白Gaq基因的克隆和功能鉴定

为了寻找并克隆凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）G蛋白α亚基,为研究对虾的生理调控提供理论基础,通过简并PCR和RACE反应获得目的基因的全长cDNA序列;用Blast,DNAstar和Genedoc软件对所得序列进行分析,确定所得序列为凡纳滨时虾G蛋白Gnq基因,命名为pvGnq。将该基因的编码序列克隆到表达载体,通过免疫共沉淀实验和胞内Ca^2＋,IP3浓度的测定鉴定该Gαq亚基的功能,发现该亚基的序列和功能与其他Gαq家族成员具有高度保守性。用Western blotting分析发现pvGαq在对虾身体各部位存在普遍分布,尤其在脑神经、眼柄、腮和颚片中有大量表达,在嗅觉器官触角也有适量分布。说明了pvGαq在对虾生命活动中的重要性,为研究对虾的生理调控奠定了理论基础。     

凡纳对虾个体发育早期的同工酶研究

采用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳技术，对凡纳对虾(Penaeus vannamei)个体发育早期6个时期的11种同工酶系统(EST、ALP、ACP、GDH、MDH、LDH、AAT、ME、LAP、ADH、AMY)进行研究。结果表明，凡纳对虾在幼体发育阶段已基本具备分解代谢蛋白质、脂类、碳水化合物的酶系。在早期发育过程中，EST同工酶系最为复杂，显示5-15条谱带，至少由6个位点编码；整个发育早期阶段GDH表达很弱，未见R-AMY及Q_AMY的表达；ALP、GDH、AMY及EST在无节幼体期表达很弱或未见表达；ACP、MDH、ME、ADH及AMY酶谱从糠虾幼体第Ⅲ期开始谱带数明显增加；除LAP、AAT酶谱简单且各期变化差异不大外，其它9种同工酶均随发育进程表现出明显差异。     

利用微卫星标记估计凡纳滨对虾生长性状的遗传力

Pacific whiteleg shrimp(Litopenaeus vannamei) is an economically relevant shrimp species in many Asian countries. The specific objective of the current research was to assess microsatellite markers in screening the fastgrowth of domesticated L. vannamei stocks to establish a founder population for breeding-selection plans. The postlarvae produced by the reproduction of second generation broodstock were cultured in the same conditions throughout a five months growing period. Ninety juvenile shrimp were selected from the slow-, medium- and the fast-growth groups, and ten microsatellite markers were used to investigate their genetic diversity, and to understand the improvement of a breeding-selection scheme. Ten polymorphic loci(markers)(M1–M10) were produced at ten loci in this sample, among them Primer M8 was the highest polymorphic locus and M7 was the lowest one. A specific locus was found in the fast-growth group using Primer M5. The longest genetic distance(0.481) was determined between the fast- and medium-growth groups and the shortest(0.098) was between the slow- and medium-growth groups; therefore, the largest genetic identity(0.946) was observed between the slowand medium-growth groups and the smallest(0.667) was observed between the medium- and fast-growth groups.The Unweighted Paired Group with Arithmetic Average(UPGMA) dendrogram based on Nei's genetic distances provided two different groups; the first consist of the slow- and medium-growth groups and the second the fastgrowth group. Selection response and realized heritability for growth were 11.55% and 31.26%, respectively.Therefore, this set of microsatellite markers would provide a useful tool in shrimp breeding schemes.     

中国对虾黄、渤海沿岸地理群的RAPD分析

采用随机扩增多态DNA(random amplified polymorphic DNA,简称RAPD)技术,对中国对虾的黄、渤海地理群的32个个体遗传多样性进行了检测,使用OPI系列的20个10bp的寡核苷酸随机引物,对每个个体的基因组DNA进行扩增,结果为:17个引物获得了谱带清晰且重复性好的产物,扩增片段的分子量在2000～2000bp之间,共检测106个位点,其中多态位点数为39个,占36.8%;平均遗传距离为0.0941+0.0206,有67个标记(占63.2%)在整个群体的32个个体间表观稳定的一致性.     

凡纳滨对虾血淋巴、类淋巴细胞培养

以 ×L-15 培养基为基础,添加不同比例的胎牛血清和对虾肌肉提取液配制成不同的培养液,当 22×L-15培养基、胎牛血清和对虾肌肉提取液的比例分别为 60 %、20 %、20 %时,培养效果较好。培养液 pH 维持在7.0 ~ 7.2时血淋巴和类淋巴细胞生长最好,且类淋巴细胞迁出迅速。绝大部分血淋巴细胞贴壁迅速并伸展成多角样或披针形,一般存活 7 ~ 9 d,少部分呈悬浮状态的血淋巴细胞存活达 60 d 以上。培养中如未及时去除对虾血清,血淋巴细胞迅速衰老并死亡。类淋巴组织细胞 6 d可形成单层,迁出细胞主要有两种形态: 多角样和成纤维样,细胞可存活 16 d以上。     

基于转录组数据的凡纳滨对虾微卫星标记开发

对虾遗传多样性和育种研究需要大量的分子标记。作者利用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)转录组测序数据,采用MISA软件进行微卫星序列挖掘,共获得14 767条微卫星序列。统计发现在凡纳滨对虾中微卫星出现的频率为16.76%;在所有的微卫星序列中,2碱基微卫星最多,占59.53%;其次是3碱基微卫星,占35.78%。随机选取其中74条序列设计引物,通过DNA混池扩增和分型的方法进行微卫星标记的开发,PCR扩增的显示有54对(72.97%)能扩增出清晰的目的条带,进一步分型的结果显示27条(36.49%)微卫星显示出多态性,从这些多态性的微卫星位点中选择11个位点在\"科海1号\"种质库材料中进行个体分型,结果显示在该群体中微卫星标记的等位基因数目为2~11个不等,期望杂合度值为0.256~0.858,观察杂合度为0.213~0.875,多态性信息含量为0.221~0.830,在11个位点中有4个位点显著偏离HWE(P0.05)。本研究结果为后续使用微卫星标记进行对虾遗传学研究,促进对虾的遗传选育和种质资源保护提供了重要基础。     

丹江口水库翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis)遗传多样性的RAPD和ISSR分析

利用RAPD和ISSR两种分子标记技术,分析了丹江口水库野生翘嘴红鲌30个个体的遗传多样性.用10个RAPD引物对其基因组DNA进行扩增,共获得66个重复性好且谱带清晰的扩增位点,片段大小在200--2000bp之间,其中多态性位点24个,多态位点比例为36.36%;个体间遗传距离在0.0338-0.1426之间,平均为0.0941;Shannon信息指数为0.1083.用10个ISSR引物共检测到73个位点,其中多态性位点28个,多态位点比例38.36%;个体间遗传距离在0.0376-O.1652之间.平均为0.1058;Shannon信息指数为0.1196.结果显示,丹江口水库野生翘嘴红鲌的多态位点比例、平均遗传距离和Shannon信息指数均较大,说明其有较丰富的遗传多样性.     

我国引种海带(Laminaria japonica)和长海带(L.longissima)配子体克隆的随机扩增多态性DNA分析

运用RAPD技术,对引种我国的海带(Laminaria japonica)和长海带(L.longissima)的22个配子体克隆进行分析。筛选的19条随机引物共获得252个位点.扩增片段大小在200～2000bp之间,多态性位点228个,占90.5%。配子体克隆遗传变异分析表明,长海带和海带的遗传多样性都比较高,两者之间的遗传分化较为明显,且种间变异大于种内变异。长海带和海带雄配子体克隆的遗传变异程度均低于雌配子体克隆。另外,两个种的雌、雄配子体之间均存在一定程度的分化,且长海带雌、雄配子体之间的遗传分化大于海带配子体。     

RAPD标记鉴别红鳍东方鲀和假睛东方鲀种群的初步研究

用ＲＡＰＤ技术对东方纯属（Ｆｕｇｕ）的红鳍东方鲀（Ｆｕｇｕ　ｒｕｂｒｉｐｅｓ）和假睛东方鲀（Ｆｕｇｕｐｓｅｕｄｏｍｍｕｓ）共三个群体进行分析,经２０个随机引物扩增,得到每一个体的多态片段。比较所有图谱,没有发现能够鉴别三个群体的特异性谱带;而且采自日本的红鳍东方纯与采自中国的红鳍东方鲀的电泳图谱基本相似。结果还表明,红鳍东方纯与假睛东方鲀电泳图谱的差异也甚小,说明二者的亲缘关系非常接近,这与以前用同工酶进行分析的结果相一致（王可玲等,１９８４）,     

皱纹盘鲍中国群体和日本群体的自交与杂交F1 的RAPD 标记

利用皱纹盘鲍中国群体和日本群体野生个体的单自交和单正反杂交获得了 4个F1家系 ,其中家系AJC、BCC、CCJ、DJJ分别为日本♀×中国♂、中国♀×中国♂、中国♀×日本♂和日本♀×日本♂组合 ,采用 2 2个引物对上述四个家系及其各自亲本个体的遗传结构进行了RAPD分析。结果表明 ,四个家系的平均杂合度 :AJC为 0 .2 32 9,BCC为 0 .1 667,CCJ为 0 .1 773,DJJ为 0 .1 649;各家系两亲本间遗传距离 :AJC为 0 .2 4 62 ,BCC为 0 .1 70 1 ,CCJ为 0 .2 1 0 9,DJJ为 0 .1 688。各家系子代群体与父母本的遗传距离 :AJC为 0 .1 772和 0 .2 2 2 4 ,BCC为 0 .1 1 81和 0 .1 92 0 ,CCJ为0 .1 1 2 3和 0 .1 691 ,DJJ为 0 .0 694和 0 .1 947。各家系子代个体间的遗传距离AJC为 0 .0 976,BCC为0 .0 95 1 ,CCJ为 0 .0 699,DJJ为 0 .0 682 ,而子代各群体间遗传距离均小于 0 .0 2 2 0。     

黄鳍鲷2个自然群体遗传变异的RAPD分析

用RAPD技术对福建和珠江口2个自然黄鳍鲷(Sparus latus)群体进行群体内与群体间的遗传变异分析。在使用的40个随机引物中．有18个引物扩增出清晰稳定的片段，共计93条，大小为200-2500bp，其中多各性片段41条．多态性片段的比例为44．09％。福建和珠江口群体内的相似系数分别为0．8821和0．8785．群体内遗传距离分别为0．1179和0．1215，2个群体间的遗传距离为0．1314。福建和珠江口2个群体内都有较高程度的遗传变异水平，但福建群体的遗传变异水平较珠江口群体的低。用类平均聚类法和邻接法进行聚类分析，结果表明．福建和珠江口群体分别聚成一支，且两者的聚类结果一致。说明福建和珠江口群体已经开始出现了遗传分化，分别属于2个不同的地理群体。     

斑鳢(Channa maculata)微囊藻毒素去毒相关基因sGST的克隆与序列分析

采用RT-PCR技术和RACE技术成功克隆淡水鱼类斑鳢sGST基因cDNA全序列,推测得到氨基酸序列,初步分析其结构功能域及系统进化关系。结果表明,斑鳢sGST基因cDNA序列全长为898bp,编码225个氨基酸。斑鳢sGST与真鲷、金头鲷、鲽、黑头鲦、川鲽、大口黑鲈等最新定名为ρ型的sGST氨基酸同源性较高,ρ型sGST为水生生物所特有并共同占据进化树上独立的分枝;与大鼠、小鼠、人等哺乳动物sGST现有所有类型同源性均很低,并且在进化树上距离也较远,表明本研究成功克隆的sGST基因应属于ρ型,可能在鱼类等水生生物对水栖环境的适应上有重要作用。     

海水鱼类病原弧菌对对虾的致病力及其疫苗的免疫预防

鱼类致病弧菌（溶藻弧菌Vibrio alginolyticus, 创伤弧菌V.vulnificus,河弧菌生物Ⅰ型V.fluvialis Ⅰ,鳗弧菌Ⅴ.anguillarum和副溶血弧菌Ⅴ.parahaemolyticus）同样可使斑节对虾Penaeus monodon患病,现对斑节对虾的致病性和免疫保护力作了研究。通过肌肉注射感染实验,发现5种弧菌对斑节对虾均有不同的致病作用。从5种弧菌中筛选出强毒株,以其制成福尔马林灭活疫苗。通过注射、浸浴和投喂等3种方式接种的斑节对虾,除投喂效果不明显外,注射和浸浴接种均有一定的免疫保护力。在注射接种组中,随着疫苗浓度的提高,其免疫力有升高的趋势。说明在鱼虾的弧菌病中,疫苗能起到共同的防御效果,为商用鱼虾疫苗的生产提供了可能。     

进口大菱鲆Scophthalmus maximus L.苗种的遗传结构分析

利用随机扩增多态性DNA(RAPD)和微卫星两种分子标记技术分析了从法国(F)、英国(E)、西班牙(S)引进我国的三个大菱鲆群体的遗传结构。20个RAPD随机引物对每个群体各20尾大菱鲆的基因组DNA进行扩增，共获得125个重复性好且谱带清晰的RAPD标记，片段大小在200—2500bp之间，三群体的多态位点比例在12．80％—20．00％之间，Nei基因多样性指数在0．0142—0．0352之间，Shannon多样性指数在0．0423—0．0720之间。微卫星引物的分析结果与RAPD一致。总体上，三个群体的遗传多样性均较低，其中西班牙群体遗传多样性水平最高，英国群体次之，而法国群体最低。利用Shannon多样性指数和Nei多样性指数估算群体遗传变异的来源，两者得出一致的结论：群体问遗传分化很弱。AMOVA分析结果进一步证实了shannon多样性指数和Nei基因多样性指数的分析结果：群体的遗传变异有97％以上是由群体内个体问的遗传变异引起的，遗传变异主要来自于群体内个体间，显著性检验表明群体间的变异对总变异的影响不显著。实验结果证明我国进口大菱鲆群体种质较单一。     

红鳍东方鲀(Takifugu rubrips)病原杀对虾弧菌的主要生物学特性研究

采用表观分类学及分子生物学方法,对从发病的养殖红鳍东方()中分离的细菌进行了主要生物学特性研究.主要包括形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定;同时对代表菌株进行了16S rRNA基因的分子鉴定,测定了16S rRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树;结果表明,分离菌为弧茵属(Vibrio Pacini 1954)的杀对虾弧菌(Vibrio penaeicidasp.nov.Ishimaru et al 1995).代表菌株(Hc051105-6株)16s rRNA基因序列长度(不包括引物结合区)为1443bp(GenBank登录号:EU073023),代表菌株(HC051105-8株)16S rRNA基因序列长度(不包括 引物结合区)为1450bp(GenBank登录号:Eu073024).择代表菌株做对健康红鳍东方鲀的人工感染试验,认为分离鉴定的杀对虾弧菌在被检红鳍东方鱼电病例具有一定的病原学意义.药敏试验结果显示,对供试37种抗菌药物中,在一些药物中存在耐药性的菌株间差异.