4株琼胶降解菌的分离、鉴定及产酶条件分析

从海藻及海参中分离筛选得到4株琼胶降解菌HD、JL、QJ和HS,均为革兰氏阴性菌,确定了它们发酵产酶的最佳条件均为：2216E海水培养基、初始 Ph 7.5、琼胶底物浓度0.30%、培养温度28℃、培养时间36 h。大部分酶分泌到细菌细胞外。生理生化检测、16SrDNA序列同源性及聚类分析结果表明, HD、JL、HS为白色噬琼胶菌(Agarivorans albus);QJ的16SrDNA序列与Simiduia sp.,糖噬胞菌属( Saccharophagus sp.)和船蛆杆菌(Teredinibacter sp.)的相似性为93%~94%,在进化树上单独形成一个分支,但生理生化特征与它们有所不同,分类地位需要进一步确定。从HD、JL和HS中能克隆到β-琼胶酶基因,它们与其他物种的β-琼胶酶基因序列的相似性为97%~98%。     

白色噬琼胶菌QM38β-琼胶酶基因agaD02 的克隆与表达

从白色噬琼胶菌(Agarivorans albus)QM38基因组中扩增到一段编码β-琼胶酶的DNA序列,命名为agaD02。序列相似性分析的结果表明,基因agaD02和弧菌Vibrio sp.JT0107及Vibrio sp.PO-303的琼胶酶基因具有同源性,其相似性程度分别为98.7%和97.4%,而同GenBank中的其他序列同源性很低。对此基因的序列进行了分析,结果表明,其开放阅读框长度为2 868 bp,编码的蛋白质包含955个氨基酸,在蛋白数据库中的编号为ABM90422,推测其分子质量为106 ku,等电点为4.87。利用网上数据库资源和生物学软件对预测的琼胶酶蛋白序列进行了同源性分析和结构分析。设计两端含酶切位点的特定引物,克隆agaD02基因,构建入表达载体pET24a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),转化后提取质粒进行酶切和电泳验证,转化后的大肠杆菌经诱导可产生胞外琼胶酶。     

一种诱导模式和甘油补料优化策略提高重组大肠杆菌BL21（DE3）β-琼胶酶的产量

琼胶酶是作用于琼胶的水解酶,在食品、化妆品和制药工业中有广泛的应用。本文建立了一种基于诱导模式和甘油补料优化的高细胞密度和高产β-琼胶酶策略,同时可以较好的控制乙酸盐产量。首先,在诱导前期采用不同的比生长速率（μ）的甘油指数补料策略。结果表明,低的比生长速率（μ=0.2）是细胞生长和β-琼胶酶产生的最佳条件。其次,研究了诱导阶段诱导温度和诱导物浓度对细胞生长和β-琼胶酶产生的影响。当异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导时,在20℃下0.8mmol/L的IPTG诱导策略对β-琼胶酶的产生效果最佳。采用1.0g/（L·h）的乳糖连续补料策略诱导培养,β-琼胶酶活性达到112.5U/mL,是目前报道的产量最高的β-琼胶酶。此外,β-琼胶酶能直接酶解龙须菜粉,产生新琼寡糖,水解产物为新琼胶四糖（NA4）和新琼胶六糖（NA6）。本文的研究为β-琼胶酶的工业化生产和应用提供了较好的理论依据。     

微泡菌QZHA1褐藻胶裂解酶MAAL1的酶学性质研究

为探究Microbulbifer sp. QZHA1褐藻胶裂解(Escherichia coli)酶MAAL1的酶学性质,将褐藻胶裂解酶基因maal1构建至pET-28a表达载体并利用大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达。研究发现：重组酶MAAL1与来源于Microbulbifer sp. ALW1菌株的褐藻胶裂解酶(WP＿23625014.1)同源性最高,为93.69%,且与PL7家族蛋白聚为一支;重组酶MAAL1最适温度为35℃,最适pH为7.5,在pH为5.5～10.5范围内保存24 h仍能保持60%以上的酶活力;MAAL1具备良好的耐有机溶剂特性,在测试的9种有机溶剂中,除异丙醇外,其他有机溶剂在添加量达到30%(体积分数)后,酶活力依然保持在59%以上;重组酶MAAL1最适条件下酶活力为4.3 U/mg,米氏常数(K_m)值为1.08 mg/mL,最大反应速率(V_max)为4.75 mg/(mL·min),催化常数(K_cat)值为4.52 s^-1;重组酶MAAL1对聚β-D-甘露糖醛酸(p...     

一种海洋拟诺卡氏菌产生的胞内中性β-葡萄糖苷酶

从一株海洋放线菌株HY-G中纯化得到了一种胞内中性β-葡萄糖苷酶。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Superdex 200凝胶柱层析估计酶分子质量分别是43.3 kD和45.0 kD,两者估计值接近,表明该酶是一个单聚体,不含亚基。采用对硝基酚基-β-D-葡萄糖苷(p-NPG)做底物,测得该酶的最适pH和最适温度分别为pH 7.5和40?C。该酶在pH 6.0～7.0最稳定,在70?C保温30 min仍能保留56%的酶活力,表明具有一定的温度稳定性。基于16S rRNA基因的分类研究表明,该菌株属于拟诺卡氏菌属。