盐酸氯苯胍在红笛鲷体内的药代动力学及残留消除规律

在水温(28±2)℃、盐度28条件下,将盐酸氯苯胍(Robenidine hydrochloride,ROBH)按30 mg/kg的剂量口灌红笛鲷(Luthjanus sanguineus),用HPLC-MS/MS法研究ROBH在红笛鲷体内的药代动力学和残留消除规律。结果表明:单剂量口灌给药后,红笛鲷血浆中ROBH的药时数据符合一级吸收二室模型,药物在血浆中的达峰时间t_p为1.79 h,血药浓度峰值C_(max)为211.38μg/L,药时曲线下面积(AUC_(0-∞))为5 229.16μg/(L·h),消除半衰期(t1/2β)为46.99 h。ROBH在红笛鲷其他组织中分布较广,消除速度较慢,肌肉、肝脏和肾脏的C_(max)分别为37.58、863.02、1 063.24μg/kg,t_p均为1.5 h,AUC0-∞分别1 017.03、20 841.20、30 743.04μg/(kg·h);t1/2β分别为26.35、14.05和24.31 h。连续5 d口灌给药后,红笛鲷血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的药物消除半衰期t1/2分别为46.14、36.11、28.62、26.92 h。以10μg/kg为最高残留限量,肌肉作为食用靶组织,在本试验条件下,建议休药期不少于7 d。     

腹腔注射恩诺沙星和氟苯尼考对红笛鲷血清IgM含量的影响

以20mg·kg-1恩诺沙星和氟苯尼考分别腹腔注射红笛鲷,通过间接酶联免疫吸附实验法(ELISA)测定红笛鲷血清IgM的含量,研究恩诺沙星与氟苯尼考对红笛鲷血清IgM含量的影响。结果显示:健康红笛鲷血清中IgM抗体的含量为3.591±0.314mg·mL-1,注射后,恩诺沙星组增加至4.234±0.013mg·mL-1,第3周后恢复至初始水平,而氟苯尼考组则降低至2.538±0.214mg·mL-1,第5周仍未恢复至初始水平。可见,恩诺沙星可提高红笛鲷血清中抗体IgM的含量,而氟苯尼考则降低鱼体血清中抗体IgM的含量,且影响时间也较长。     

红鳍笛鲷和紫红笛鲷种类和群体的矢耳石地标点法识别

【目的】探讨矢耳石地标法在笛鲷种内及种间中的判别作用。【方法】利用2017年购自广西北海、海南文昌、广东阳江的87尾红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)和76尾紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)成鱼的矢耳石样本,基于地标点法分析耳石的形态差异,运用判别分析检验耳石形态差异在2种笛鲷的种间和同种不同群体间的判别功效。【结果】位于听沟前中部交叉点的两个地标点10、11贡献较大,解释了耳石形态变异的64.88%～65.85%,表明两种笛鲷耳石形态的种间差异和种内群体差异主要集中于听沟前中部。基于耳石形态的地标点方法对2种笛鲷的种间判别成功率为97.4%和100.0%;红鳍笛鲷和紫红笛鲷的种内不同群体判别成功率分别为85.7%、83.3%、80.0%和94.1%、78.1%、81.5%。【结论】矢耳石地标点法可作为2种笛鲷种间和种内判别的有效工具。     

红笛鲷免疫器官发育组织学观察

【目的】研究红笛鲷（Lutjanus sanguineus）免疫器官发育,为其健康养殖和疾病预防提供理论基础。【方法】从红笛鲷卵出膜开始取样,至出膜62 d,通过石蜡连续切片,H-E染色,进行红笛鲷3个主要免疫器官胸腺、头肾、脾脏发育的组织学研究。【结果与结论】红笛鲷出膜1 d时出现前肾,3 d肾管之间可见造血干细胞;出膜18 d,胸腺和头肾间出现细胞桥,头肾淋巴化;出膜62 d,肾小球仍存在于头肾中,表明头肾既是淋巴器官也是泌尿器官。红笛鲷出膜8 d时出现脾脏原基和红细胞发育;出膜22 d时观察到淋巴细胞;出膜24 d时淋巴细胞显著变多。胸腺是最后一个出现的器官,红笛鲷出膜12 d时出现胸腺原基;15 d时发现胸腺淋巴化。     

红笛鲷CD40和去除信号肽CD40的原核表达

根据红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD40基因cDNA全长序列设计2对特异性引物,利用RT-PCR技术从红笛鲷头肾组织中扩增出CD40 ORF序列和去信号肽序列,分别与原核表达载体pET-32a(+)相连,构建原核重组表达质粒,命名为pET32-CD40和pET32-△CD40,并分别转化至大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,分别于54 ku和53 ku处有清晰的目的蛋白条带。融合蛋白的表达效率最佳的表达条件,pET32-CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.4,IPTG浓度为0.08 mmol/L,诱导5 h;pET32-△CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.6,IPTG浓度为0.10 mmol/L,诱导6 h。在各自优化的表达条件下,pET32-△CD40融合蛋白表达量较pET32-CD40融合蛋白高。RNAstructure软件分析发现,CD40的mRNA 5′端序列形成复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,表明信号肽序列的存在可能对CD40基因在原核细胞中的表达有一定的影响。     

三种笛鲷属鱼类的随机扩增多态性DNA初步研究

RAPD技术是由Williams和Welsh领导的两个科研小组于1990年几乎同时独立创立的一种DNA多态性分析技术，它的原理是利用一系列随机排列的寡核苷酸单链引物，以研究对象的基因组DNA为模板进行PCR扩增，通过扩增产物DNA片段的多态性来检测基因组DNA的多态性。     

三种笛鲷属鱼类的随机扩增多态性DNA初步研究

RAPD技术是由 Williams[1]和 Welsh[2 ]领导的两个科研小组于 1 990年几乎同时独立创立的一种 DNA多态性分析技术 ,它的原理是利用一系列随机排列的寡核苷酸单链引物 ,以研究对象的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增 ,通过扩增产物 DNA片段的多态性来检测基因组 DNA的多态性。该技术已被广泛地应用于种质鉴定、遗传多样性、亲缘关系及系统分类研究 [3～ 6]。但对海水鱼类RAPD研究报道较少。红鳍笛鲷 (L utjanus erythopterus Bloch)、紫红笛鲷 (L utjanus argentimaculatus Forskal)和勒氏笛鲷 (L utjanus russelli Bleeker)具有…     

红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus)精巢发育的组织学研究

为掌握红鳍笛鲷的繁殖特性,通过石蜡切片、苏木精-伊红染色对红笛鲷精巢的发育进行组织学研究。结果表明,红鳍笛鲷的精巢属于叶状精巢,精子发生过程与其他脊椎动物一样,包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细、精子细胞和精子形成。精巢的生长发育过程的组织学结构共分为5期:3~4月龄精巢为第Ⅰ期精巢,精原细胞无定向分散在结缔组织之间;5~6月龄精巢为第Ⅱ期精巢,精原细胞成束分布,形成曲细精管的雏形;6~9月龄精巢为第Ⅲ期精巢,曲细精管出现管腔,曲细精管的管壁由精原细胞和大量初级精母细胞和次级精母细胞及少数精子细胞构成;10月龄精巢为第Ⅳ期精巢,曲细精管内除了精原细胞和初级精母细胞外、还形成了次级精母细胞和精子细胞,同时,管腔中出现极少量的精子;16月龄精巢为第Ⅴ期精巢,外观呈椭圆形的圆柱状,曲细精管的管腔和壶腹中充满成熟的精子。     

红鳍笛鲷皮肤色素细胞组成、分布及类胡萝卜素含量分析

【目的】揭示红鳍笛鲷（Lutjanus erythropterus）红体色的分布特征及影响机制。【方法】利用色差仪分别测定背部、腹部和尾部皮肤的体色值,用形态学观察、石蜡切片、冰冻切片和透射电镜切片等方法分析色素细胞组成、分布和数量特征,并使用紫外分光光度法和液相色谱-质谱/质谱法研究类胡萝卜素和体色特征的关系。【结果与结论】红鳍笛鲷体表的红色素细胞显著多于黑色素细胞（P <0.001）,且从背部向腹部逐渐减少,红体色受到黑色素细胞分布的影响;皮肤和视网膜是类胡萝卜素的主要沉积部位,皮肤中类胡萝卜素以脂肪酸结合的形式存在,其中红色类胡萝卜素主要有虾青素、角黄素和β-柠乌素等3种,虾青素和角黄素含量与红色素细胞数量呈正相关。建议在饲料中补充虾青素和角黄素以提升红色。     

红笛鲷IRAK-1基因克隆及哈维弧菌感染后的组织表达

用同源克隆和RACE的方法克隆红笛鲷(Lutjanus sanguineus)白细胞介素1受体相关激酶1(Interleukin-1receptor-associated kinase 1,IRAK-1)基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析其在健康鱼及哈维弧菌感染后红笛鲷的组织表达。结果表明,该序列全长3 207 bp(登录号KF728204),包含5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR752 bp,开放阅读框(ORF)2 253 bp,编码750个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其蛋白分子质量为82.6 ku,理论等电点为6.59。IRAK-1包含1个N端死亡结构域、proST结构域、中央激酶结构域和C末端结构域。荧光定量PCR分析显示,红笛鲷IRKA-1基因在肝脏和皮肤的表达量最高,其次是心脏、鳃、肌肉和胸腺,其余组织的表达量较低。哈维弧菌侵染红笛鲷后,各组织中IRAK-1基因mRNA表达量均呈上调趋势,肝组织中变化最显著。     

红鳍笛鲷弧菌病病原的研究

从广东湛江特呈岛鱼排取患病红鳍笛鲷进行病原分离、纯化,得到一株病原菌Ls 1。该菌 为革兰阴性短杆菌,有运动性,菌落半透明,最适温度28～30℃,需盐生长,氧化酶反应阳性,发酵 葡萄糖不产气,不发酵肌醇,对弧菌抑制剂O/129敏感。经API ID32E细菌鉴定系统及弧菌科细 菌生化鉴定管鉴定,该菌为一株溶藻弧菌(Vibrioaginolyticus);其对红鳍笛鲷的半数致死量为6.32 ×105mL-1。药敏试验结果表明,该菌对阿莫西林、先锋V不敏感,对新生霉素、卡那霉素、多粘菌 素B、四环素中度敏感,而对庆大霉素、氟哌酸、氯霉素、红霉素、链霉素和复方新诺明等有较高的敏 感性。     

红笛鲷弧菌病血清流行病学研究方法的建立

以红笛鲷Lutjanus sanguineus弧菌病的主要病原菌——溶藻弧菌Vibrio alginolyticus为抗原制备兔抗血清,以辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清为酶标二抗,建立了酶联免疫吸附试验检测技术。通过棋盘滴定法测定,得出溶藻弧菌菌悬液的最佳工作浓度为5×108mL-1,兔抗溶藻弧菌血清的最佳稀释度为1∶16000,酶标羊抗兔抗体的最佳稀释度为1∶2000。应用本实验建立的间接双抗体夹心法对红笛鲷进行现场检测,患病红笛鲷特异性抗体的检出率为70%,外观健康红笛鲷的检出率为20%。结果表明,本实验所建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法可以用于红笛鲷弧菌病的血清流行病学研究,而且可以检测出隐性感染状态下的红笛鲷。     

红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化

通过克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)非特异性毒性细胞受体蛋白-1(nonspecific cytotoxic cell receptor protein-1,NCCRP-1)成熟肽基因序列,然后与载体连接构建pET21a-NCCRP融合蛋白表达载体,将其转入大肠杆菌BL21进行诱导表达并优化条件。SDS-PAGE分析表明,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol/L、37℃条件下培养3 h后表达量最大,分子大小与预期值相符,融合蛋白主要以包涵体形式高效表达,通过HisTrap HP柱子使其得到进一步纯化;Western blot分析表明,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明获得该表达产物。     

注射氟苯尼考对红笛鲷免疫指标的影响

以0、5、10、20 mg.kg-1的氟苯尼考腹腔注射红笛鲷,研究氟苯尼考在国家规定的使用范围内对红笛鲷血清部分免疫指标的影响。结果显示:5 mg.kg-1组氟苯尼考对所测的各项指标无影响或影响不显著;10 mg.kg-1组中氟苯尼考对红笛鲷血清SOD活力、AKP活力有显著性提高(P<0.05),对溶菌酶的含量、IgM的含量无显著性影响;20 mg.kg-1组中红笛鲷血清碱性磷酸酶AKP、超氧化物歧化酶SOD活力、溶菌酶、抗体IgM均受到显著性抑制(P<0.05),但影响持续时间不同,这表明高浓度氟苯尼考显著抑制红笛鲷各项免疫指标,从而影响到鱼体自身的免疫功能。     

一种复方中草药饲料添加剂在红笛鲷网箱养殖中的应用

将黄芪、当归、甘草和山楂等粉碎后按一定比例配伍制成复方中草药饲料添加剂后,按质量分数0.5%、1.0%、1.5%和2.0%添加到基础饲料中,连续投喂红笛鲷(体重234.95±19.26 g,体长24.76±1.42 cm)56 d,研究复合中草药制剂对红笛鲷生长、成活、免疫和抗病力的影响。结果表明,基础饲料中添加本复方中草药饲料添加剂能够显著促进红笛鲷的生长,增强其血清中的抗菌活力和溶菌酶活力,提高红笛鲷成活率及其对溶藻弧菌的免疫保护率,其中以添加1.5%(质量分数)和连续饲喂28 d效果为最佳(P<0.01)。     

红笛鲷重组激活基因rag1原核表达条件的优化及纯化

克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)RAG1蛋白(recombination activating protein1)活性核心区的基因序列,并与pET-28a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-28a-RAG1,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。为提高融合蛋白的表达效率,运用传统的实验方法对诱导条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,在37℃条件下,利用0.1 mmol/L IPTG诱导8 h后,RAG1重组融合蛋白的表达量最大,相对分子质量与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式高效表达,利用His Trap HP亲和柱使其得到进一步纯化;Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白。     

脂多糖、苯酚、硫酸铜对红笛鲷非特异性细胞毒性细胞受体基因表达的影响

应用Real-time PCR技术,研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、苯酚、硫酸铜刺激红笛鲷(Lutjanussanguineus)后非特异性细胞毒性细胞受体(NCCRP-1)基因在不同组织里的表达差异。结果发现,LPS刺激红笛鲷24 h后NCCRP-1在红笛鲷头肾、脾脏、胸腺、肝脏、心脏、脑、肌肉和肠组织中均有表达,其中头肾表达量最高,脾脏次之,然后依次是肝脏、脑、肌肉、胸腺和肠,心脏表达量最少。LPS、苯酚和CuSO4刺激红笛鲷后,随着刺激时间的增长,NCCRP-1表达量在各组织达到峰值的时间不同。以头肾为模式组织,RT-PCR的结果显示,红笛鲷NCCRP-1在LPS、苯酚和CuSO4的刺激下的表达模式相似,随着时间的增加NCCRP-1表达量逐渐增加,分别在24、9、12 h处达到最高,达到对照组的52、30、24倍左右,之后表达量开始下降。免疫组织化学表明,NCCRP-1只在头肾、脾脏和胸腺的特定细胞中表达。     

勒氏笛鲷外周血细胞显微结构的观察

报道了勒氏笛鲷外周血细胞的显微结构,血涂片经过Wright染色液染色,可区分出红血细胞、血栓细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等五种血细胞,没有发现嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞.白血细胞中,血栓细胞体积最小,单核细胞体积最大;血栓细胞数目最多,淋巴细胞和单核细胞数目最少;淋巴细胞有大小两种类型大淋巴细胞和小淋巴细胞.此外,在外周血液中还观察到少量未成熟的红细胞和嗜中性粒细胞,偶而可见正在分裂的红细胞,提示红细胞也可在外周血直接分裂.