3种对虾精子超低温冷冻保存技术研究

作者以日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和南美白对虾(Penaeus vannamei)作为实验材料,研究3种稀释液(天然海水,人工无钙海水,Hank’s平衡盐溶液)、3种抗冻剂(二甲基亚砜、丙二醇和丙三醇)、3种稀释比例(5%、10%和15%)、3种不同的降温程序对3种对虾精子超低温冷冻保存效果的影响。冻精解冻后通过台盼蓝染色的方法计算其存活率。结果显示,对于3种对虾,以天然海水作为稀释液,10%PG作为抗冻剂,4℃平衡20 min,以–2℃/min降温至–40℃,–40℃平衡10℃,以–15℃/min降温至–150℃,然后投入液氮作为降温程序进行超低温冷冻保存效果最好,冻精解冻后存活率分别为75.33%±2.56%、69.00%±3.00%和23.33%±8.55%。     

中国明对虾血蓝蛋白C末端片段在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

为研究中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血蓝蛋白C末端(FcHC-C)的抗菌功能,将血蓝蛋白基因FcHC的2个C末端基因片段连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建酵母表达载体pPIC9K/FcHC-C。该载体经SalI酶切后,采用PEG法转化毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)。转化子经过PCR鉴定后,阳性克隆通过含有G418的YPD平板筛选,获得高拷贝重组子。重组毕赤酵母利用甲醇诱导表达目的基因。经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,利用酵母工程菌成功表达了血蓝蛋白C末端片段(rFcHC-C1和rFcHC-C2)。抑菌活性鉴定实验结果显示,重组蛋白rFcHC-C1和rFcHC-C2作为阴离子抗菌肽具有抗真菌和抗细菌的活性。     

中国明对虾TOR 基因的克隆及精氨酸、亮氨酸对其表达的影响

首次从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensiss)肌肉组织中克隆得到TOR基因的cDNA,全长共7 638 bp,开放阅读框7 389 bp,编码2 462个氨基酸。氨基酸序列比对和结构域分析均证实其为目前已知的TOR激酶的同源蛋白。应用实时定量PCR的方法研究TOR在中国明对虾中的组织分布特异性,以及注射等浓度的亮氨酸和精氨酸后,肌肉组织中TOR mRNA表达水平在3,6,12,24 h的变化,探讨营养水平对TOR基因表达的影响。结果显示,注射亮氨酸和精氨酸24 h的对虾TOR mRNA表达量是对照组的3~4倍,显著升高(P0.05),证实氨基酸对TOR的表达具有调节作用。     

基于微卫星(SSR)分子标记的中国对虾渤海湾增殖亲虾群体及回捕群体的遗传多样性分析

Eight microsatellite markers were used to analyze genetic diversity, level of inbreeding, and effective population size of spawner and recaptured populations of Chinese shrimp(Fenneropenaeus chinensis) during stock enhancement in the Bohai Bay in 2013. A total of 254 and 238 alleles were identified in the spawner and recaptured populations, respectively, and the numbers of alleles(N_a) were 8–63 and 6–60, respectively. The numbers of effective alleles(N_e) were 2.52–21.60 and 2.67–20.72, respectively. The polymorphism information content ranged from 0.529 to 0.952. The observed heterozygosity(H_o) values(0.638–0.910 and 0.712–0.927) were lower than the expected heterozygosity(H_e) values(0.603–0.954 and 0.625–0.952), which indicated that the two populations possessed a rich genetic diversity. In 16 tests(2 populations×8 loci), 13 tests deviated from the HardyWeinberg equilibrium. F_(is) values were positive at seven loci and the inbreeding coefficients(F) of the two populations estimated by trio ML were 13.234% and 11.603%, suggesting that there was a relatively high degree of inbreeding. A certain level of inbreeding depression had occurred in the Chinese shrimp population. F_(st) values ranged from 0 to 0.059, with a mean of 0.028, displaying a low level of genetic differentiation in the two populations. Effective population sizes(3 060.2 and 3 842.8) were higher than the minimum number suggested for retaining the evolutionary potential to adapt to new environmental conditions. For enhancement activity in 2014,the ideal number of captured shrimp spawners should have ranged from 7 686 to 19 214 to maintain genetic diversity and effective population size. Further strategies to adjust the balance of economic cost, fishing effort and ideal number of shrimp spawners to maintain a satisfactory effective population size for ensuring the sustainability of Chinese shrimp are proposed.     

中国对虾雄地虾交配能力和精荚再生的研究

于１９８７年中国对虾雄对虾交配能力进行了实验观察,干１９９４,１９９５两年进行补充实验。结果证明,在实验室条件下,保持雄对虾的相对数量而且有充足雌对虾供交尾选择的情况下,中国对虾雄对虾在一个交配季节中的自然交配能力可达到３－４次;交配后生成新的精荚并再次发生交配的平均时间约为３ｄ,但部分雄对虾交配次日即可生成新的精荚并再次发生交配行为;雌雄性比５：１和２：１对雄对虾在整个交配季节中的累计平均交配率     

蜕皮与中国对虾仔虾肠道杆菌病及肠道堵塞的关系

于１９９６年５月,在青岛市红岛镇后阳育苗场,采用饲养实验的方法对患肠道疾病的中国对虾仔虾的康复进行观察研究。结果表明,中国对虾仔虾的某些肠道疾病的康复与蜕 存在极为密切的关系。肠道杆菌病对虾状幼体和糠虾幼体危害极大,患病个体死亡率为１００％,而患病率的仔虾幼体较高的存活率（３２％）,存活者多数为病症出现时已处蜕皮前期的个体,而在蜕皮间期开始患病的个体极少能发育至蜕皮变态。肠道堵塞是仔虾期纪体的幼体     

盐度胁迫下凡纳滨对虾体内虾青素在着色与抗氧化的资源权衡

工厂化养殖中产生的环境压力,会导致对虾应激反应的发生以及体色的减弱。为了探究胁迫下对虾体内虾青素的消耗规律以及对虾的着色与抗氧化之间的关联性,本研究通过虾青素强化后盐度胁迫的方法进行了实验。结果表明,与强化前相比,虾青素强化后植物源(夏侧金盏花)虾青素(d-AST)、合成虾青素(p-AST)处理的对虾肝胰腺中虾青素含量分别增加48.0%和17.5%;虾壳中分别增加42.8%和45.2%。富含酯化型虾青素的d-AST在肝胰腺中具有更高的沉积量;而由游离虾青素组成的p-AST在虾壳中具有更高的沉积量,不同形式的虾青素在不同组织中的沉积具有一定的偏好性。两个处理组对虾的体色明显增强。与盐度胁迫前相比,胁迫后d-AST、p-AST肝胰腺中虾青素含量分别减少了15.1%和5.7%,对照组(Ctrl)含量无变化;虾壳中分别减少了17.8%、52.9%和14.3%,各组对虾的体色均显著减弱。胁迫24 h检测到编码虾青素转运蛋白β-1,3-葡聚糖结合蛋白(βGBP-HDL)基因的显著上调表达,可能与虾壳中虾青素的减少有关。随着胁迫的进行,与对照组相比,两个处理组的抗氧化基因均呈现上调表达的趋势;各组抗氧化能力呈现先上升后下降的趋势,并在48 h时达到最大值,d-AST、p-AST分别为对照组的1.35和1.30倍。据此,作者推测对虾体内的虾青素是按照资源权衡的原则在着色和抗氧化功能中进行分配的,在遭受环境胁迫时,对虾会优先将用于着色部分的虾青素(虾壳中)转运至肝胰腺中参与抗氧化,进而表现为体色的减弱和抗氧化能力的上升。     

中国对虾家系建立及不同家系生长发育的初步研究

在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)家系建立过程中,我们采用定向交配对子代进行选育的方法.采用4种中国对虾人工授精方法,即整个精荚移植、精荚切块移植、输精管移植和精液移植,共进行了155例雌虾的人工授精实验,有108尾雌虾成功产卵并孵化出仔虾,成功率为69.7%,建立了101个全同胞家系和29个半同胞家系.在受精卵孵化、育苗的基础上,同时进行了不同家系幼体生长情况的研究,结果表明受精率、孵化率、存活率以及初期生长在4个实验组间都没有显著性差异.另外对其他家系之间的比较也得出同样的结果,说明不同家系在早期的生长中,没有表现出显著性差异.而在养成阶段,方差分析结果表明家系间在生长上表现出差异极其显著.     

不同盐度波动幅度对中国明对虾稚虾蜕皮和生长的影响

研究了盐度波动幅度对中国明对虾稚虾(Fenneropenaeus chinensis)蜕皮和生长的影响.实验在水族箱内进行,实验对虾的初始体重为(0.553 2±0.000 1)g,投喂人工配合饲料.实验结果表明:(1)不同盐度波动幅度对中国明对虾稚虾的蜕皮周期有显著的影响(P<0.05),其中S10能明显抑制对虾的蜕皮,S2则能促进对虾的蜕皮,前者较后者蜕皮周期延长4.97 d;(2)不同盐度波动幅度对中国明对虾的特定生长率有显著影响(P<0.05),其中,S4和S7两组对虾的特定生长率最大,分别大于S0组28.11%和22.6%,并且与S0和其他处理组相比差异均达到显著水平(P<0.05);(3)不同盐度波动幅度对中国明对虾的摄食量有显著影响(P<0.05),S4和S7两组分别高于S0组15.96%和11.46%;(4)不同盐度波动幅度对中国明对虾的食物转化效率未产生显著的影响P>0.05,但S4和S7两组对虾的食物转化效率较高.     

凡纳滨对虾水孔蛋白-4的cDNA克隆及盐度胁迫对其肝胰腺mRNA表达水平的影响

为了探索水孔蛋白(Aquaporin,AQP)在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)渗透压调节过程中作用,本研究通过RACE方法获得克隆的凡纳滨对虾AQP(命名为LvAQP4)的c DNA全长序列,并分析了盐度胁迫对其肝胰腺m RNA表达的影响。结果发现:LvAQP4 c DNA序列全长为1 048 bp,其中包括75 bp的5￠UTR,187 bp的3￠UTR和786 bp的ORF。根据ORF序列推导出LvAQP4编码261个氨基酸,预测其分子质量为27.85 k Da,等电点为8.11。推导的氨基酸序列与其他甲壳物种的AQP相似度为48.8%到97.3%。进化分析显示LvAQP4属于AQP1-like亚族、AQP4类。定量PCR(q PCR)检测到LvAQP4在不同组织中均有表达,其中鳃的表达量最高,肝胰腺、肌肉、脑和眼柄中也较高,而血淋巴、肠、胃和胸神经节中表达量则较低。在高盐(盐度40)刺激下,凡纳滨对虾的肝胰腺LvAQP4 m RNA表达量会随着时间推移而上升,到6 h达到最高,而后逐步下降。而在低盐(盐度4)刺激下,凡纳滨对虾的肝胰腺LvAQP4 m RNA表达量并无明显变化。在原代分离和培养的肝胰腺细胞中,培养液中加入额外的Na Cl会剂量依赖地提高LvAQP4 m RNA表达水平。同样,通过在培养液中额外加入蔗糖提高培养液渗透压,也会剂量依赖地提高LvAQP4 m RNA表达水平,但作用不如Na Cl明显。这些结果表明盐度与肝胰腺LvAQP4的表达量有关,LvAQP4对凡纳滨对虾的渗透压调节具有非常重要的作用。     

黄芩苷在中国对虾体内对诺氟沙星消除及细胞色素P450 酶的影响

对照组中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)连续投喂不含药物饵料,诺氟沙星组和联合用药组以50 mg/kg体质量剂量连续投喂含诺氟沙星药饵5 d后,诺氟沙星组投喂不含药物饵料10 d,联合用药组以100 mg/kg体质量剂量投喂含黄芩苷饵料10 d。从投喂诺氟沙星药饵时开始,在不同时间点采集中国对虾血液、肝胰腺、鳃和肌肉组织进行药物残留和肝药酶活性测定。结果表明:与诺氟沙星组相比,联合用药组各组织中诺氟沙星消除较快,血淋巴、肝胰腺、鳃和肌肉的理论休药期比诺氟沙星组分别缩短了23.92%、22.73%、25.92%和21.92%;与对照组相比,诺氟沙星对中国对虾CYP1A(ECOD)和CYP2(APND)酶活性有一定的抑制作用,但随着诺氟沙星的消除抑制作用逐渐减弱,最后恢复至对照水平;黄芩苷在加速诺氟沙星在中国对虾体内消除的同时,对中国对虾CYP450酶也有较强的诱导作用。因此,药物使用应注意药物之间的相互作用,以免造成药物中毒或疗效下降现象。     

中国明对虾caspase基因的克隆与表达分析

利用细胞凋亡来清除多细胞器官受损伤或有害的细胞,为动物发育过程中保持机体平衡起到关键作用。为了研究细胞凋亡在甲壳类动物应对病毒感染后所起到的作用,作者利用同源克隆技术获得了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)caspase基因(FcCasp)的cDNA序列,并分析了该基因在对虾受到白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,简称WSSV)刺激后的表达变化规律。结果表明,该基因的cDNA含有954个核苷酸,编码317个氨基酸,具有caspase家族典型的QACRG五肽蛋白酶活性位点(190-194氨基酸)。对注射了WSSV的中国明对虾FcCasp的表达进行分析,在5个时间点取其肝胰脏样本,经real-time PCR检测发现,WSSV刺激3 h后,对虾肝胰脏中FcCasp的表达呈现显著性上调,说明FcCasp的表达与WSSV感染密切相关,提示FcCasp基因与细胞凋亡相关。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)耐低温和生长性状的遗传参数估计

The inability of Fenneropenaeus chinensis to tolerate low temperatures is of major economic concern in temperate climates,as it reduces their growing season and leads to over-winter mortality.In this study,the heritability of body weight under low grow-out temperature and cold tolerance in F.chinensis were first investigated and estimated using 88 ful-sib families,which might provide crucial information in Chinese fleshy prawn breeding programs.The heritability for body weight under suitable and low temperature of F.chinensis were both moderate(0.158 0±0.307 5 and 0.132 0±0.026 9 respectively);the large coefficient of variation(approximately 21%) and moderate estimate of heritability for body weight indicated substantial potential for selective breeding.The heritability estimate for cold tolerance was low(0.019 2±0.023 5),and showed no significant differences from zero(P0.05).A weak genetic correlation between cold tolerance and body weight was also estimated in the present study,also showing no significant differences from zero(P0.05).Thus,more research needs to be conducted on the more accurate heritability estimate of cold tolerance and genetic correlations between traits in F.chinensis to further improve the achievement of breeding goals.     

中国对虾细胞色素P450基因CYP4原核表达条件优化

根据克隆得到的中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）CYP4基因开放阅读框设计引物,构建了中国对虾CYP4基因原核表达载体p28a-CYP4,并对重组菌株Rosetta／28a-CYP4的原核表达条件进行了优化。结果表明：p28a—CYP4转化Rosetta后可实现CYP4基因的原核表达,SDS—PAGE分析显示其在56．0kDa处有显著诱导条带;通过对诱导温度、IPTG浓度、诱导时机（OD600）及诱导时间的优化表明,重组菌株Rosetta／p28a-CYP4的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1．2mmol／L,最佳诱导时机及诱导时间分别为0．59和6h。     

中国明对虾精氨酸激酶与白斑综合征病毒结构蛋白VP31的作用初探

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是危害对虾的主要病原,给全球水产养殖业带来了巨大经济损失。为研究阻断WSSV的途径,前期研究WSSV与宿主相结合的受体蛋白发现,白斑综合征病毒囊膜蛋白VP31可以与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)精氨酸激酶(FcAK)发生结合作用。精氨酸激酶(AK)通过调节无脊椎动物体内磷酸精氨酸与三磷酸腺苷(ATP)之间平衡在能量代谢、储存和利用方面具有重要作用。作者通过重组表达的rFcAK与rVP31的far-Western blotting分析,证实两者有结合作用,此外,rFcAK还与WSSV的VP19、VP28等6种结构蛋白有结合作用。双向电泳分析观察到,rFcAK与rVP31的磷酸化反应后,rVP31部分发生pI降低现象,提示rVP31可能发生了磷酸化。生物信息学分析表明VP31存在21个精氨酸残基,FcAK具有12个精氨酸结合位点,这可能为VP31和FcAK的结合活性提供了靶位。为进一步研究WSSV与宿主结合机理及阻断感染的机制提供思路。     

中国对虾选育群体“黄海1号”和野生群体不同组织基因组DNA甲基化的MSAP分析

DNA甲基化在调节动物生长发育和组织分化中发挥了重要作用。本研究主要从酶切、预扩和选扩等方面优化了中国对虾DNA甲基化分析的MSAP技术,给出了适合中国对虾MSAP分析的最近反应程序和体系,并采用该技术分别对中国对虾选育群体"黄海1号"和野生群体的肌肉、鳃和血细胞三种组织基因组DNA的CCGG甲基化水平进行分析。研究结果表明,中国对虾野生群体肌肉、鳃和血细胞的DNA甲基化比例分别为23.1%、22.3%和19.7%,选育群体"黄海1号"肌肉、鳃和血液的甲基化比例分别为21.4%、19.6%和18.9%。鳃组织的DNA甲基化水平在两群体中差异极显著(P <0.01),肌肉间的甲基化水平差异显著(P <0.05),而血细胞中甲基化水平差异不显著(P >0.05)。中国对虾野生群体和"黄海1号"同一组织间的甲基化水平不同(P ≤ 0.05),而不同组织间的甲基化水平也各不相同(P ≤ 0.05)。DNA甲基化多态性分析表明,野生群体和选育群体"黄海1号"的鳃和血细胞组织的甲基化多态性比例变化明显,而肌肉组织甲基化水平较稳定,这些变化趋势与CCGG位点的甲基化和去甲基化有关。     

Estimation of genetic parameters and breeding values in shrimp Fenneropenaeus chinensis using the REML/BLUP procedure

An analysis of a selection experiment was used to assess the impact of various animal model structures on REML estimates of variance components.The analyses were carried out based on 162 d body mass (BM) of 1 287 animals from 21 paternal half-sib groups of Fenneropenaeus chinensis.Estimated breeding values (EBV) of BM of all individuals were estimated using eight statistical models (A,AB,ABC,ABDC,ABMFC,ABMDC,ABFDC and ABMFDC) and BLUP (best linear unbiased prediction).These models were designed involving factors such as sex,spawn date as fixed effects,maternal genetic effects,full-sib family effects as random effects,mean BM of families at tagging and age at recording (covariate).The results demonstrate the importance of correct interpretation of effects in the data set,particularly those that can influence resemblance between relatives.The data structure and the particular model that was applied markedly influenced the magnitude of variance component estimates.Models based on few effects obtained upward biased estimates of additive genetic variance.The accuracy of genetic parameters and breeding value estimated by ABFDC model was higher than other models.The results imply that additive genetic direct value,full-sib family effects,and covariance effects besides sex and spawn date as fixed effects were very important for estimating genetic parameters and breeding value of body mass.This model had a heritability estimate of 162 d BM of 0.44.The comparison of the efficiency of selection based on breeding values or phenotypic value revealed great difference:average breeding value of the best 24 families selected by the 162 d BM breeding value and phenotype were 0.577 g and 0.366 g,respectively,representing a 36.57% higher efficiency in the former.In conclusion,selection based on breeding value was more effective than selection based on phenotypic value.Our results indicate that effects influencing the magnitude of estimates should be taken into account when estimating heritability and breeding values for BM.